莊靖銘（綜述） 侯劍剛（審校）

（復旦大學附屬華山醫(yī)院泌尿外科 上海 200040）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是一種常見的男科疾病，指男性無能力達到性生活所需要的充分勃起或維持勃起時間過短的病癥。各個年齡段均可發(fā)生，以中老年為主，且年齡越大發(fā)病率越高［1］。生理上，勃起需要副交感神經末梢釋放的一氧化氮（NO）來實現(xiàn)。因此，各種原因引起的NO釋放減少和/或限制陰莖血流量可以導致ED。從病因學分析，ED 可分為器質性、心理性和混合性。器質性ED 可由多種代謝條件紊亂（如糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、陰莖纖維性海綿體炎等）或物理打擊（如創(chuàng)傷、盆腔手術等）所引起［2-3］。心理障礙（如焦慮、抑郁）可以通過精神性或藥物相關性途徑抑制勃起功能從而導致心理性ED。盡管在過去二十多年出現(xiàn)了諸如口服磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase 5 inhibitors，PDE5i）、海綿體內注射（intracavernosal injections，ICI）血管活性藥物和低強度沖擊波等療法，但治療效果僅限于緩解癥狀，往往是出現(xiàn)暫時性的好轉而非永久性治愈或根本的病理性改善。對于嚴重ED 的治療突破則更加有限，其中糖尿病性ED 以及創(chuàng)傷后ED（包括醫(yī)源性）更加嚴重，且對傳統(tǒng)藥物治療反應不佳。尋找和開發(fā)新療法，從而延長改善時間，提高療效，是這個領域的研究重點。

在眾多療法中，干細胞（stem cells，SCs）療法因其對ED 有治愈的可能而引起了廣泛的關注。在此，我們簡要綜述現(xiàn)有ED 干細胞療法的臨床前實驗、臨床試驗和未來可研究的方向。

干細胞干細胞是具有多向分化能力的可自我更新的細胞，可以從胎盤、羊水、脂肪組織、肝臟、肌肉、骨髓和臍帶血等組織中回收。成人干細胞駐留在稱為干細胞巢（stem cell niche）的特殊微環(huán)境中，巢內細胞根據與干細胞的接近程度分為基質細胞和上皮細胞。干細胞通過細胞黏附和細胞外基質分子錨定到細胞巢。干細胞可以通過分泌細胞因子和生長因子傳遞信息［4］，其具有分裂能力和向各種類型的細胞分化的潛能。一個母細胞可產生兩個相同的干細胞（維持其數(shù)量）或兩個分化的細胞，甚至能產生一個干細胞和一個分化的細胞。它們分裂、分化和組織再生的能力高度依賴于周圍環(huán)境［5］。干細胞根據發(fā)育階段可分為胚胎干細胞（embryonic SCs，ESCs）和成體干細胞（adult stem cells，ASCs）；根據發(fā)育潛能可分為全能干細胞（totipotent）、多能干細胞（pluripotent）、專能干細胞（multipotent）和祖細胞（progenitor）。全能干細胞分化潛能最大，可分化出成熟生物體的所有細胞，但人類的全能干細胞只存在于胚胎發(fā)育的前3 天。多能干細胞可以產生三個生發(fā)層（即外胚層，中胚層和內胚層）中的所有細胞；專能干細胞可以在發(fā)育成熟的器官中發(fā)現(xiàn)，并且可以分化成它們自己所在的生發(fā)層的細胞；最后，祖細胞顯示出最小的分化潛能（最多可分化成兩種類型的細胞）［6］。除了具有分化產生成熟組織細胞的能力，干細胞還發(fā)揮旁分泌作用，其似乎在受損或缺陷組織的愈合過程中起到了關鍵作用［7］。這可能是通過干細胞外泌體的趨化性、抗炎性、再生性、血管生成性和抗細胞凋亡性來實現(xiàn)的［8］。這些能力促使眾多學者研究它們在治療各種疾病中的可能性。

臨床前實驗現(xiàn)階段大多數(shù)研究使用大鼠模型模擬了不同類型的人類ED。最廣泛應用的兩種模型是誘導大鼠糖尿病引發(fā)的慢性ED（diabetes mellitus-induced erectile dysfunction，DMED）和模擬根治性前列腺切除術（radical prostatectomy，RP）后海綿體神經損傷（cavernous nerve injury，CNI）的急性ED。治療方法大多是向成模動物直接注射干細胞。已有多種類型的干細胞應用于研究器質性ED，這其中包括了 ESCs、間充質干細胞（mesenchymal SCs，MSCs）、神經嵴干細胞（neural crest SCs，NCSCs）、內 皮 祖 細 胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、肌 源 性 干 細 胞（musclederived SCs，MDSCs）、脂肪源性干細胞（adiposederived stem cells，ADSCs）和尿源性干細胞（urinederived stem cells，USCs）。另外，在開展動物實驗的同時，一些研究人員也開始進行體外實驗（如細胞共培養(yǎng)）來探究干細胞改善ED 功能的機制。

胚胎干細胞（ESCs） 由于倫理與法律的限制，ESCs 在ED 研究中的使用受到限制。 只有Bochinski 等［9］在2004 年進行了相關研究，他們使用CNI 誘導的神經性ED 大鼠模型，記錄了在大鼠海綿體和主盆神經節(jié)（major pelvic ganglion，MPG）注射同源神經胚胎干（NES）細胞的結果。將26 只雄性SD 大鼠分成4 組：5 只進行假手術；8 只（對照組）進行雙側CN 鉗夾，并將干細胞培養(yǎng)基注入其陰莖海綿體；4 只經鉗夾后，將NES 細胞注入MPG；最后9 只鉗夾后，使用NES 細胞進行ICI。3 個月后通過海綿體神經電刺激評估勃起反應，測定陰莖海綿體內壓（intracavernosal pressures，ICP），免疫組化染色評估陰莖組織中神經型一氧化氮合酶（neural NO synthase，nNOS）的質量差異。結果顯示第一組的ICP 均峰值為96.9（18.0）cmH2O，明顯高于其他組（P<0.05）；第2 組ICP 均峰值為30.5（8.3）cmH2O，顯著低于第3 組［55.1（19.2）］和第4 組［54.1（23.8）cmH2O］（P均<0.05），第3 組和第4 組之間的平均ICP 峰值無顯著差異。在注射NES 細胞的實驗組中，染色結果也明顯更好。這說明使用NES 細胞，可以改善神經源性ED 大鼠模型的勃起功能。

成體干細胞（ASCs） 對ESCs 的種種限制使得可以從患者自身取得的ASCs 在近些年的研究中更受青睞，在有關ED 治療的研究中也是如此。應用各類ASCs（如MSCs、ADSCs 等）進行ED 治療的動物研究大多都得出了勃起功能改善的結論，許多團隊正以進一步確定哪種細胞類型表現(xiàn)最佳以及優(yōu)化治療方案為目標進行嘗試。

Abdel 等［10］使 用 同 源MSCs 對 老 年 大 鼠 進 行ICI 以評價其療效，100 只大鼠每只進行100 萬個單位MSCs 的 單 次ICI。在 第3 周、4 周、3 個 月 和4 個月（每組25 只大鼠）進行ICP 測定和病理學檢測，并分別設立成年和老年對照組。結果顯示，與對照組相比，注射組組織中平均cGMP 含量均顯著增加（P<0.05），ICP 測量也顯示MSCs 移植組均峰值顯著增加。注射后第3 個月和4 個月的平均cGMP 水平和ICP 均峰值與注射后第3 和4 周相比顯著增加，提示長期療效優(yōu)于短期。

Kendirci 等［11］使 用p75 神經 生長因子受 體的抗體激活的骨髓源性間充質干細胞（BMSCs）對CNI大鼠進行了ICI，他們發(fā)現(xiàn)注射和非注射組的大鼠都出現(xiàn)勃起功能的改善，但注射p75 激活的干細胞組表達出了更高濃度的β-成纖維細胞生長因子，揭示了一種加強干細胞修復功能的途徑。另一項研究［12］則比較了雙側CN 鉗夾后分別向海綿體或腹腔注射BMSCs，使用兩種注射方法后大鼠的海綿體內皮細胞、平滑肌細胞、陰莖NOS 和神經微絲含量均有上升，但ICI 顯著優(yōu)于IPI（P<0.05）。

上述實驗表明，干細胞注射有助于恢復陰莖的勃起以及其他生理功能［13］，這些基于干細胞的臨床前研究強調了干細胞治療后動物ED 的恢復情況。而其治療作用機制仍不明確。ADSCs 和USCs 由于其豐富的自體來源、易于分離和較強的擴增能力受到了特別關注，并且開始應用于體外培養(yǎng)實驗［14］。Liu 等［15］通 過 病 毒 轉 染，制 備 出 表 達 大 量VEGF 的ADSCs。他們發(fā)現(xiàn)使用其進行ICI 后，通過刺激內皮功能和增加平滑肌和周細胞的含量，DMED 大鼠的勃起功能明顯改善。這樣的療法結合了干細胞注射與基因治療，Qiu 等［16］在MSCs 中也進行過類似實驗，表達VEGF 的MSCs 也表現(xiàn)出相同的優(yōu)勢。此外，ADSCs 注射聯(lián)合胰島素治療在鏈脲佐菌素（STZ）誘導的DMED 大鼠中能產生更好 的 治 療 效 果［17］。Zhou 等［18］發(fā) 現(xiàn)ADSCs 可 表 達VEGF，金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）和脂多糖誘導的CXC 趨化因子（LIX）。與對照組相比，ADSCs 注射組可恢復部分海綿體內皮細胞、平滑肌細胞以及nNOS 陽性神經細胞的功能，并減少未經胰島素治療的DMED 大鼠的細胞凋亡，可以將DMED 大鼠的ED 癥狀和病理表現(xiàn)改善至接近正常水 平［18］。Zhang 等［19］制 備 過 量 表 達 誘 導 型NOS（iNOS）的腺病毒感染了ADSCs，對DMED 大鼠進行注射的同時，分離提取了大鼠海綿體平滑肌細胞進行共培養(yǎng)實驗。結果顯示ADSCs-iNOS 可以顯著改善DMED 大鼠的勃起功能。體外則可以通過增加NO 生成和抑制海綿體平滑肌中的Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原表達以減少陰莖纖維化來達到治療效果。

Xu 等［20］在CNI 大 鼠 模 型 上 比 較 了 用 游 離 的ADSCs 進行ICI 和用懸滴法培養(yǎng)ADSCs 3 天產生的微組織（micro-tissue，MT）進行ICI。發(fā)現(xiàn)注射MT 組的細胞恢復數(shù)量增加，且ICP/MAP 也顯著上升，說明MT 注射更能改善勃起功能。Lin 等［21］將納米顆粒吸附ADSCs 來維持注射后的細胞簇。他們將這些干細胞簇注射到大鼠體內觀察3 天，發(fā)現(xiàn)與單純注射ADSCs 相比，納米顆粒吸附組改善勃起功能更佳。

USCs 可以很容易地從尿液中分離出來，表達出多能祖細胞的性質，并具有應用于組織工程的潛力［22-26］。USCs 分泌促血管生成因子，可誘導內皮細胞分化，可能在糖尿病性ED 中有作用。Ouyang等［27］使用人類USCs 和FGF2 轉染的人類USCs 對2型DMED 大鼠進行ICI 來確定這種療法是否具有改善勃起功能障礙的可能性。使用高脂飲食和STZ 誘導2 型DMED 大鼠進行分組ICI。結果顯示雖然注射部位細胞數(shù)目增加不明顯，但是實驗組ICP/MAP 明顯增加，且海綿體組織的內皮和平滑肌標記物的表達也明顯增加，推測可能是USCs 或USCs-FGF2 的旁分泌作用通過募集原有細胞和增加內皮細胞表達和平滑肌含量來誘導2 型糖尿病大鼠 勃 起功能的 改 善。Zhang 等［28］對USCs 的治療機制進行了探索，使用高級糖基化終末產物（AGEs）處理大鼠海綿體血管內皮細胞模擬糖尿病環(huán)境。然后對兩種細胞進行共培養(yǎng)評估USCs 體外保護作用。最后得出自噬功能障礙與DMED 大鼠海綿體內皮功能和勃起功能障礙有關。且USCs 可上調海綿體內皮細胞的自噬活性，有助于改善海綿體內皮功能障礙，并最終有望改善糖尿病引起的勃起功能障礙。

干細胞外泌體（exosomes） 有一些觀點認為注射干細胞改善性功能是由細胞的植入和分化造成的，但大多數(shù)意見還是以旁分泌機制為主。旁分泌機制強調勃起功能的改善是由于干細胞注射后分泌的細胞外囊泡（或外泌體）引起的，其內容物包括細胞保護分子、抗纖維化分子和抗凋亡分子［29］。近幾年，隨著有關各類干細胞衍生物外泌體研究的不斷深入，也有一些學者開始將干細胞外泌體直接應用于ED 的治療［30］，不失為另一種很有前景的治療方向。

Chen 等［30］使用超速離心的方法從培養(yǎng)ADSCs的上清液中分離出EXOs。將構建好的2 型DMED大鼠模型分成3 組，分別用ADSCs 衍生的EXOs、ADSC 或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進行ICI。結果顯示，與ADSCs 類 似，ADSCs 衍生 的EXOs 能 夠 通過抑制細胞凋亡來增加海綿體內皮細胞和平滑肌細胞的數(shù)量，從而促進2 型糖尿病大鼠勃起功能的恢復。Ouyang 等［31］使 用 同 樣 方 法 獲 得 了MSCs 的EXOs。將雙側CNI 模擬神經性ED 的大鼠模型分成3 組，分 別 用PBS、MSCs 或MSCs-EXOs 進 行ICI，并且還分離培養(yǎng)了陰莖海綿體平滑肌細胞（corpus cavernosum smooth muscle cells，CCSMCs）用于體外實驗。結論顯示，MSCs-EXOs 可通過抑制CCSMCs 中的細胞凋亡來改善CNI 誘導的大鼠ED，其效力與MSCs 處理組相似。另一組研究人員使用USCs-EXOs 也得到了相似的結論，他們還通過RNA 測序發(fā)現(xiàn)USCs-EXOs 中富集了促進血管生成的多種的miRNA（miR-21-5p，let-7 家族，miR-10家族，miR-30 家族和miR-148a-3p）［31］。因此，與傳統(tǒng)的干細胞注射療法相比，EXOs 這種無細胞的細胞衍生療法在ED 治療方面可能具有更大的應用潛力。

臨床試驗Bahk 等［33］使用1.5×107單位的臍帶血干細胞對7 名糖尿病伴發(fā)ED 的患者（藥物治療至少6 個月未能正常勃起）進行了ICI，之后與口服PDE5i 聯(lián)合應用時可明顯改善性功能。跟蹤檢測9個月后沒有患者表現(xiàn)出對注射的不良反應，3 名參與者在1 個月內恢復了晨勃，2 名參與者6 個月后在口服PDE5i 的情況下成功完成性生活，除1 名以外的所有參與者都表示性欲增加。

Demour 等［34］首先進行了Ⅰ期臨床試驗并實現(xiàn)了長期隨訪，首次使用自體骨髓間充質干細胞（BMMSCs）進行連續(xù)2 次的ICI。參與者是4 名糖尿病性難治性ED 患者，并隨訪了2 年。結論是注射耐受性良好，患者沒有顯著的不良反應，勃起功能和硬度也有顯著的改善。

Yiou 等［35］對行RP 后出 現(xiàn)ED 的12 名 患 者（最大劑量藥物治療無效）給予BMSCs 的ICI，4 組相同情況的患者注射劑量逐步增加BMSCs（分別為2×107，2×108，1×109和2×109）。之后全面 評估勃起功能。12 名患者在聯(lián)合口服PDE5i 的情況下有9 名出現(xiàn)性功能明顯改善。分組比較后發(fā)現(xiàn)，隨著注射劑量增加，自發(fā)勃起發(fā)生率增加，且該研究沒有報告嚴重的注射后不良反應。實驗的第二階段［36］增加了6 名患者，并注射了第一階段確定的最佳劑量（1×109）的BMSCs，結果顯示，在第一階段參加實驗的患者中，沒有前列腺癌復發(fā)，但勃起功能較1 年前時間點相比略低，這表明使用BMSCs 進行ICI 是安全的，但隨著時間的推移可能需要重復多次的注射以維持更好的療效。

Haahr 等［37］使 用ASCs 對17 名 有RP 手 術 史 的ED 患者（藥物治療無法恢復）進行ICI，以確定安全性、耐受性以及療效。結果顯示海綿體內注射ASCs具有良好的耐受性，僅5 例患者出現(xiàn)與吸脂有關的輕微不良事件，2 例患者在注射部位出現(xiàn)紅腫或腫脹，1例患者出現(xiàn)陰囊和陰莖血腫，并發(fā)現(xiàn)其中有8 名能夠在沒有使用口服藥物的情況下實現(xiàn)勃起并完成性交。隨訪1 年后分析顯示［38］，RP 術后恢復了尿控力的患者通過注射可以明顯改善性功能。

未來方向無論是針對ED 的動物實驗還是臨床試驗，干細胞相關療法大都顯示出對ED 癥狀的明顯改善，但關于ED 的干細胞療法仍然存在許多問題。比如，干細胞的免疫原性的問題，同種異體或自體的干細胞的選擇都有待明確。雖然自體干細胞會減輕免疫原性問題，但其獲得比同種異體的干細胞更加復雜。某些類型的干細胞可能會在后續(xù)增殖的過程中產生不良影響，且不同類型的干細胞，細胞的最佳傳代數(shù)可能不同［39］。注射的最佳細胞濃度，注射量是否應基于患者體重或基于靶器官內干細胞的標準濃度也有待確定［40］。標準的給藥時間表也尚未建立，確定單次注射是否足夠還是在不同時間點進行多次注射也是很有必要的。此外，干細胞治療效果的詳細機制也有待闡明，這也有助于明確將來的應用治療范圍［41］。干細胞外泌體的研究可能會解決一些直接應用干細胞進行治療的障礙，但其分離方法較為困難，治療機制以及注射后的長期療效也尚未闡明。在大規(guī)模臨床試驗之前，必須建立起規(guī)范的檢驗標準，諸如國際勃起功能指數(shù)和勃起硬度量表。相信隨著ED 相關機制的研究不斷進行以及對干細胞及其衍生物的認識不斷深入，干細胞療法將會在ED 的治療中發(fā)揮更加重要的作用。