葉方疊（綜述） 楊 宸（審校） 姜昊文

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科 上海 200032）

條件重編程（conditional reprogramming，CR）培養(yǎng)技術(shù)目前應(yīng)用于多種原代細胞系的培養(yǎng)，由人誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)體系改良，并經(jīng)過試驗專用于培養(yǎng)動物組織來源的上皮細胞。CR 培養(yǎng)的具體步驟是細胞與輻射過的小鼠成纖維J2 細胞（滋養(yǎng)細胞）在配有Rho 相關(guān)激酶（Rho-associated kinase，ROCK）抑制劑（Y-27632）的條件培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。ROCK 抑制劑可提高骨髓源性間充質(zhì)干細胞和人角質(zhì)形成細胞的增殖能力，誘導(dǎo)細胞無限增殖，故加入Y-27632 的培養(yǎng)基可以用來增加患者來源的正?；蚰[瘤上皮細胞的細胞株，以及肝細胞系的存活能力。該模型保持了原代細胞的生物學(xué)特性，含有藥物代謝酶及相應(yīng)的輔助因子，可為藥敏試驗提供相關(guān)信息，為研究藥物代謝和藥物相互作用提供了良好的體外模型，應(yīng)用于腫瘤細胞培養(yǎng)有較好前景。CR 細胞培養(yǎng)技術(shù)作為原代細胞培養(yǎng)技術(shù)的新興技術(shù)，目前僅用于膀胱癌、前列腺癌、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、小鼠神經(jīng)母細胞瘤等相關(guān)領(lǐng)域。隨著技術(shù)的逐步成熟，CR培養(yǎng)技術(shù)將廣泛應(yīng)用于各個系統(tǒng)腫瘤。本文對CR培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于不同腫瘤細胞及其在藥物代謝中的應(yīng)用進展進行了綜述。

CR 培養(yǎng)體系概述多年來科學(xué)家致力于尋找一種能對人類正常細胞和腫瘤細胞進行永久體外培養(yǎng)的培養(yǎng)體系［1］，但是傳統(tǒng)的細胞體外培養(yǎng)方法會改變細胞的表型、染色體組型、蛋白表達量。更為重要的是腫瘤細胞在體外培養(yǎng)會喪失原代腫瘤細胞的異質(zhì)性，同時沒有基因突變的正常細胞由于端粒酶等限制無法在體外培養(yǎng)中長時間存活，阻礙了對不同疾病進行分子和細胞層面的深入研究。

一般采用SV 病毒（simian vacuolating virus）大T 抗原與管家蛋白相互作用［2］誘導(dǎo)細胞體外永生化或者過表達人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）［3］，使細胞獲得持續(xù)增殖的生物學(xué)特性。然而，通過基因操作的方式對細胞進行培養(yǎng)可能會造成染色體不穩(wěn)定，比如在傳代之后造成不可逆的關(guān)鍵基因或者性狀的丟失。大多數(shù)原代細胞難以維持體外擴增，一般經(jīng)過有限代數(shù)就會停止生長并逐漸死亡。

CR 培養(yǎng)技術(shù)由人誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)體系改良并經(jīng)過試驗，專用于培養(yǎng)動物組織來源的上皮細胞。經(jīng)過CR 培養(yǎng)體系建立的原代細胞可以維持來源組織的染色體特征，并保持正常組織來源的生物學(xué)特性。例如人類前列腺癌的CR 細胞維持了來源組織第13 號染色體的突變，故原代細胞具有在基質(zhì)膠中生長和在免疫缺陷小鼠皮下成瘤等生物學(xué)特征［4］。CR 技術(shù)用于肺部上皮、乳腺上皮［5］、結(jié)腸上皮、食管上皮［6］、包皮上皮和子宮頸陰道部及尿液脫落膀胱癌細胞，均獲得成功［7-8］。同時，重編程培養(yǎng)細胞（CR cell，CRC）在成人上皮細胞中表現(xiàn)出干細胞特性［9］。不同于其他細胞模型，CR 技術(shù)可以早期建立患者來源的正?；蚰[瘤細胞培養(yǎng)株，并保持無限擴增而無需基因處理，從而保留了原代細胞的性狀和染色體特性。Y-27632 對細胞的永生化誘導(dǎo)和人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV-16）E6和E7 致癌基因誘導(dǎo)永生化的作用相同，E6 和滋養(yǎng)細胞的作用都是激活端粒酶，然而E7 和Y-27632 都能破壞肌動蛋白細胞骨架并使Rho13 失活［10］。CR培養(yǎng)是可逆的，將培養(yǎng)細胞移出CR 培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)條件不同，細胞停止增殖或終末分化。CRC 區(qū)別于胚胎干細胞（embryonic stem cell，EC）和誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPC），CRC不是挑選的結(jié)果，也不是通過基因操作誘導(dǎo)的結(jié)果。CR 技術(shù)能快速建立所需細胞模型，維持原代細胞的表型、腫瘤異質(zhì)性（主要指腫瘤內(nèi)異質(zhì)性）［11］、染色體組型和藥物敏感性等特征。

近年來，患者來源的異種移植物（patientderived tumor xenograft，PDX）逐漸發(fā)展成為更加系統(tǒng)的研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的模型。泛組織來源的CRC 可用于類器官PDX 模型的建立，因此CR 技術(shù)具有基礎(chǔ)研究、臨床診斷、治療和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用前景（圖1）。

CR 應(yīng)用

CR 建立穩(wěn)定的患者來源的PDX 細胞株 目前抗腫瘤活性藥物的篩查依舊使用標(biāo)準(zhǔn)的癌癥細胞系。由于腫瘤細胞系易于擴增的特性，利用這些細胞系已經(jīng)對癌癥的惡變機制以及藥物反應(yīng)有了一定的了解。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在藥物毒性作用下腫瘤細胞系選擇壓力導(dǎo)致細胞系發(fā)生分化，故難以代表原來腫瘤的特性。因此需要建立更多的代表腫瘤生物學(xué)特性的細胞株，用于藥物臨床前期的抗癌藥效篩選及驗證。

PDX 是患者腫瘤和基質(zhì)組織直接移植入嚴(yán)重免疫缺陷小鼠，并在體內(nèi)維持，可用于臨床前藥物試驗和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)試驗［12］。PDX 模型相比于標(biāo)準(zhǔn)癌癥細胞株，優(yōu)點在于維持了腫瘤的生物學(xué)特性，缺點是動物消耗大，培養(yǎng)時間長，移植率不一致，缺乏持續(xù)的體外生長，不適合大批量使用。傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的PDX 細胞多數(shù)停止增殖或在幾代內(nèi)發(fā)生凋亡。

Borodovsky 等［13］將CR 技術(shù)與PDX 技術(shù)結(jié)合，在體外以較高成功率傳代培養(yǎng)患者來源的PDX 組織。標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細胞系不能明確代表原代腫瘤的遺傳學(xué)和異質(zhì)性，所以在臨床藥物敏感試驗以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中作用有限。作者通過300 個基因?qū)ν砥趥鞔腃R-PDX 細胞系進行靶向序列分析，數(shù)據(jù)顯示CR-PDX 成功維持了同位基因的頻率，沒有發(fā)生基因漂移，證明CR-PDX 維持了遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。另一方面，結(jié)果證明CR-PDX 與原發(fā)腫瘤的藥物敏感性相同，可以用作藥物篩查試驗。標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細胞系的優(yōu)點在于能夠通過靶向敲除基因改變基因表達來判斷基因型和表型的關(guān)系。用靶向或打亂的對照小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染CR-PDX 細胞，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）證明敲除成功，在研究結(jié)束時評估基因敲除對存活率的影響，研究數(shù)據(jù)顯示CR-PDX 細胞可以用來進行基因操作研究，以探討細胞生理學(xué)，并為臨床相關(guān)細胞群的機制研究提供證據(jù)［13］。

CR 培養(yǎng)的尿液來源的膀胱癌細胞在精準(zhǔn)治療膀胱癌中的作用 在中國，膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中最常見的腫瘤［14］。膀胱癌的癥狀不明顯，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)大部分是中晚期，膀胱癌的治療方案不僅和臨床分期有關(guān)，而且與患者個體臨床情況有關(guān)。根據(jù)膀胱癌的不同分型，無肌層浸潤膀胱癌的5 年生存率為60%~70%［15］，肌層浸潤性膀胱癌的5 年生存率僅為35%。因此，需要一種新型無創(chuàng)模型來早期診斷膀胱癌，并根據(jù)患者個體臨床情況選擇適當(dāng)?shù)姆呕熂笆中g(shù)，以提高患者生存率和改善患者生存質(zhì)量。

膀胱癌患者進行活檢來獲取腫瘤組織構(gòu)建PDX 的藥敏模型和確認(rèn)膀胱癌患者的臨床分期屬于有創(chuàng)操作。尿液病理能提供精確、動態(tài)的臨床信息，可以捕獲復(fù)雜的基因突變情況以及原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤的特點，同時尿液是易于獲取且無創(chuàng)檢查，已廣泛應(yīng)用于臨床，通過細胞學(xué)和生物標(biāo)記物來診斷膀胱癌。因此，通過CR 技術(shù)建立的尿液來源的腫瘤細胞培養(yǎng)是臨床上理想的方法（圖2）。

我們實驗室通過CR 技術(shù)建立源于原發(fā)腫瘤樣本和尿液的腫瘤細胞集落，并進行3D 培養(yǎng)形成球體，HE 染色結(jié)果顯示CRC 表現(xiàn)出的腫瘤細胞特性與相應(yīng)的腫瘤病理切片相同；使用IHC 染色尿液中CRC 觀察細胞類型特異性標(biāo)記物（GATA3、P40、P63）的表達，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)原發(fā)性腫瘤細胞相一致；對尿液CRC 進行全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）分析，與相應(yīng)的親代腫瘤進行比較，發(fā)現(xiàn)CR 細胞與原發(fā)腫瘤組織共有79.7%~82.6%的變異譜。對原發(fā)腫瘤和尿液CRC 變異率分析表明，單核苷酸變異和插入、缺失在培養(yǎng)過程中保持一致［16］。因此，CR 技術(shù)維持了原發(fā)腫瘤細胞的分子特性以及遺傳結(jié)構(gòu)。這種快速有效建立尿液或患者來源的膀胱癌CRC 的方法有利于進行大范圍的藥物篩查試驗，以及了解細胞發(fā)生耐藥性的機制，這種新穎、無創(chuàng)、快速建立體外膀胱腫瘤系統(tǒng)的方法為特異患者的藥物反應(yīng)和個體化藥物治療提供了基礎(chǔ)［17］。

CR 用于體外長期培養(yǎng)原代肝細胞 盡管肝細胞在體內(nèi)擁有相當(dāng)強的增殖能力，但在體外保持增殖和分化能力相當(dāng)困難，理想的培養(yǎng)方法應(yīng)滿足細胞數(shù)量大、密度高、細胞功能強而持久、易獲取等臨床應(yīng)用需求。前期研究主要在于培養(yǎng)永生化肝細胞，但永生化肝細胞勢必會丟失一部分原代肝細胞性狀，且在體外不能維持正常增殖和功能，所以需要一種新型技術(shù)培養(yǎng)非永生化肝細胞以維持原代肝細胞基因型、表型和功能。通過評價CYP3A4、1A1 和2C9 的活性以及白蛋白、s100a4、krt8、krt18、cyp1a1、cyp3a4、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9 和cyp2d6 的mRNA 表達情況來評估肝細胞功能；同時使用短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）分析比較這些細胞的DNA 指紋圖譜：它們與原代肝組織擁有同一組織來源［18］。來源于年輕患者的原代肝細胞培養(yǎng)的CRC 能在體外培養(yǎng)長達3 個月，即使來源于年老患者的原代肝細胞培養(yǎng)的CRC 也能培養(yǎng)長達2~3 個月，遠遠超過市面上的肝細胞株，最為重要的是這些CRC 在培養(yǎng)早期保持較高水平的CYP3A4、1A1 和2C9，意味著CRC 在早期具有較強的肝細胞功能。CR 培養(yǎng)的成本低，耗材少，可為臨床肝病研究以及解決肝源不足提供可行的體外培養(yǎng)模型（圖3）。

CR 提供去勢抵抗性前列腺癌藥物篩查模型（圖4） 據(jù)統(tǒng)計，至2019 年曾經(jīng)被診斷患有前列腺癌美國男性將超360 萬人，確診患者的中位年齡為66 歲［19］。早期前列腺癌可以通過外科手段干預(yù)治療，進展期前列腺癌缺乏有效的治療手段，常規(guī)的去勢藥物或者手術(shù)治療均會導(dǎo)致前列腺癌發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）［20］。個體化癌癥治療基于患者的腫瘤譜系、組織病理學(xué)、表達分析和/或腫瘤DNA 或RNA 分析，因此需要一個標(biāo)準(zhǔn)的CRPC 模型來進行藥物和放療療效篩查［21］。不同于其他腫瘤細胞，前列腺癌細胞不易獲取，來源單一，最常見的前列腺癌模型是PC-3、DU145 和LNCaP，均來源于轉(zhuǎn)移癌，既不能涵蓋全部前列腺癌，也不能代表個體原代前列腺癌細胞［22］。

人類前列腺的上皮組織有3 種類型：分泌性上皮細胞、基底細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞［23］。分泌性上皮細胞是柱狀上皮細胞，含有前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶和細胞標(biāo)記物，如細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）和 雄 激 素 受 體（androgen receptor，AR）。基底細胞位于分泌性上皮細胞下層，表達標(biāo)記物包括CK5 和CK14，僅表達低水平AR，基底細胞具有干細胞功能［24］。神經(jīng)內(nèi)分泌細胞是罕見的細胞類型，表達內(nèi)分泌標(biāo)志物，如突觸素和嗜鉻蛋白A，而不表達AR。建立和長期維持來源于患者的前列腺腫瘤組織樣本的體外培養(yǎng)一直難以實現(xiàn)。近年來CR 技術(shù)的誕生使原代細胞體外培養(yǎng)有了突破性的進展，生成了患者來源的去勢敏感的前列腺腫瘤到去勢抵抗的前列腺腫瘤的CRC，以及正常前列腺組織來源的CRC 作為對照組［25］。通過qRT-PCR 和流式細胞術(shù)比較源于患者腫瘤病理標(biāo)本的CRC 和已建立的前列腺癌細胞模型LNCaP，所有CRC 都表達高水平的基底細胞標(biāo)記物CK5、CK14 和TP63，幾乎不表達分泌性上皮細胞標(biāo)記物（如AR 和CK18），蛋白質(zhì)表達水平與LNCaP 相似，用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)對這些CRC 進一步確認(rèn)，表明CR 技術(shù)成功培養(yǎng)了細胞模型。通過CR 技術(shù)獲取的CRC-CRPC 用于藥物敏感試驗，分別使用306 種臨床或新興抗腫瘤藥物，分成5 種濃度階梯，在72 h 后檢測細胞的生存率，以確定腫瘤細胞對藥物的敏感性［26-27］，顯示出幾種潛在抗腫瘤藥物的療效，如紫杉烷類、甲帕克林、奧沙利鉑和韋納托克拉司。最有效的是Navitoclax（ABT-263），它與bcl-2 家族成員過表達和誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。該研究建立的CRC 培養(yǎng)體系既驗證了新興的抗前列腺癌藥物的療效，也為CRPC 新藥的重新定位提供了依據(jù)。CR 技術(shù)可以用來對前列腺癌進行大范圍的藥物篩查，以獲取最好的藥效學(xué)（圖4）。

CR 用于人類NSCLC 建模 NSCLC 占肺癌總數(shù)13%，NSCLC 占肺癌總數(shù)87%。肺癌診斷時多數(shù)為中晚期，約18%選擇手術(shù)治療，62%采取放化療?；熓侵委煇盒阅[瘤最重要的手段之一，腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥常常導(dǎo)致化療失敗。臨床前試驗有助于新藥的開發(fā)和個體化治療。目前的NSCLC 臨床前模型不能很好地反映患者腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性，因此以細胞為基礎(chǔ)的NSCLC體外模型成為研究熱點。Hynds 等［28］分享了從12例肺腺癌患者（Ⅱ期9 例，Ⅲ期3 例）中獲得原發(fā)性NSCLC 細胞培養(yǎng)的經(jīng)驗，以及如何提高NSCLC 體外培養(yǎng)的成功率。

利用CR 技術(shù)對NSCLC 原代細胞與小鼠成纖維細胞J3 共培養(yǎng)（加入ROCK 抑制劑），獲得10 組（83.3%）原代上皮細胞培養(yǎng)物。為了驗證CR 技術(shù)培養(yǎng)的原代腫瘤細胞是否被正?；准毎廴荆瑢ζ渲? 個細胞株進行3D 培養(yǎng)分化，結(jié)果顯示細胞形成管腔，形成了含有分化的氣道上皮細胞類型的上皮球狀物，提示在腫瘤原代細胞培養(yǎng)中擴增了正常氣道基底細胞，并過度增殖。通過向免疫缺陷小鼠注射1×106細胞懸液進行高通量測序，僅1 例表現(xiàn)原代腫瘤細胞特性，表明原代腫瘤細胞培養(yǎng)中NSCLC 樣本被正?；准毎廴?。因此，CR 技術(shù)用于NSCLC 培養(yǎng)的關(guān)鍵在于分離腫瘤細胞和正?；准毎３膊‰A段對細胞培養(yǎng)成功率有影響外，腫瘤基因型可能也是培養(yǎng)成功的決定因素之一。在進行肺部腫瘤原代培養(yǎng)時應(yīng)徹底分離腫瘤細胞和正?；准毎?，以防在細胞培養(yǎng)過程中因正?；准毎^度生長而抑制原代腫瘤細胞生長。CR 技術(shù)有望作為建立NSCLC 模型的新手段（圖5）。

CR 培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)母細胞瘤保留了原代腫瘤的異質(zhì)性（圖6） 神經(jīng)母細胞瘤是嬰幼兒最常見的顱外腫瘤，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部分，常見發(fā)生部位是腎上腺。近一半的神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生于2 歲以內(nèi)的嬰幼兒。不同神經(jīng)母細胞瘤患者預(yù)后差別很大，約一半的神經(jīng)母細胞瘤患者盡管接受了強化的多模式治療，但預(yù)后不佳，而其他患者腫瘤可自行消退或分化為良性神經(jīng)節(jié)神經(jīng)瘤［29］，即神經(jīng)母細胞瘤間存在廣泛的腫瘤異質(zhì)性。因此，需要準(zhǔn)確的臨床前模型測試新的治療方法。CR 技術(shù)可以利用患者來源的少量細胞進行快速繁殖，并維持腫瘤細胞的異質(zhì)性，克服傳統(tǒng)細胞系的缺點。現(xiàn)階段CR 技術(shù)成功建立了以TH-MYCN 小鼠轉(zhuǎn)基因纖維母細胞瘤模型中分離出來的腫瘤細胞株為原代細胞的細胞系（圖6），保留了懸浮生長的能力，并成功傳代、冷凍和生物包埋，細胞系維持了原代腫瘤細胞的異質(zhì)性，有利于解決成纖維母細胞瘤患者中廣泛存在的腫瘤間異質(zhì)性的問題［30］。

CR 的優(yōu)缺點CR 能快速有效地體外培養(yǎng)原代細胞，并且保持染色體組型的完整性，只需要微量細胞量即可建系。CR 能迅速將患者腫瘤相關(guān)信息提供給臨床，達到精準(zhǔn)的抗腫瘤藥物敏感性篩查以及免疫治療。對患者腫瘤穿刺標(biāo)本進行CR 培養(yǎng)，短時間內(nèi)就能提供精確的治療方案，即個體化醫(yī)療。CR 還可以用于擴增癌旁組織（或癌前病變組織）、明確癌癥侵襲范圍及提前發(fā)現(xiàn)癌癥。

CR 技術(shù)用于3T3 小鼠成纖維細胞引起的人基質(zhì)細胞的生長，以至于無法評估人基質(zhì)細胞對腫瘤生長發(fā)育及藥物敏感性的影響。其次，Y-27632 可能潛在干擾腫瘤細胞的遷移實驗和入侵試驗。第三，人類活組織標(biāo)本中含有正常細胞和腫瘤細胞，在CR 培養(yǎng)時正常細胞可能生長快于腫瘤細胞，甚至侵占整個培養(yǎng)基。最后，滋養(yǎng)細胞與目標(biāo)細胞共培養(yǎng)存在污染目標(biāo)細胞的可能。

結(jié)語CR 技術(shù)作為一門新興方法，相比于傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)能夠快速、有效地建立細胞系，為基礎(chǔ)和臨床試驗提供系統(tǒng)的分子模型，有助于從細胞分子角度了解腫瘤的發(fā)病機制?？茖W(xué)家致力于建立人類腫瘤樣本來源相關(guān)的成纖維細胞模型，以期為基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究提供一個更具潛力的癌癥模型系統(tǒng)，用以捕獲腫瘤細胞群和基質(zhì)成分（成纖維細胞）的相互作用。目前正在嘗試用CR 技術(shù)解決疾病，如通過基因編輯技術(shù)修復(fù)CRC，校正導(dǎo)致疾病的缺陷基因，再將修復(fù)的細胞導(dǎo)入機體，重新生長得到這些校正的健康細胞，由于源自自身組織，避免了免疫排斥。