曾 杰，房海靈*，梁呈元*，亓希武，郭 強(qiáng)，于 盱

(1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014；2.句容市虎耳山無花果專業(yè)合作社，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

無花果(Ficuscarica)為桑科(Moraceae)榕屬植物，因其樹體及果實(shí)分布乳汁管而具有分泌白色乳汁的功能[1]。前期研究者對無花果分泌乳汁進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其富含的巰基蛋白水解酶，穩(wěn)定性好，耐高溫，催化活性強(qiáng)，作用范圍廣，被廣泛應(yīng)用于蛋白水解、活性肽生成、乳制品凝固等醫(yī)藥和食品等行業(yè)[2-4]。

傳統(tǒng)提取無花果蛋白酶的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑法、柱層析法以及超濾法等，然而以上方法所得的酶存在活性低、易變性、純度低及專一性差等缺點(diǎn)[5]，尋找一種高效、綠色的無花果蛋白酶提取純化技術(shù)迫在眉睫。

雙水相萃取技術(shù)(ATPS)利用組分在兩水相間選擇性分配而達(dá)到組分的分離提純，具有條件溫和、易于放大、不存在有機(jī)試劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蛋白酶的提取純化中[6-7]。目前，僅見利用PEG/鹽雙水相系統(tǒng)提純無花果蛋白酶，分配系數(shù)可達(dá)3.6[8]。離子液體/鹽雙水相系統(tǒng)是近年來發(fā)展的新型雙水相體系，其中離子液體是一種由特定的陰陽離子組成的室溫下呈液態(tài)的低溫熔融鹽，為近年來新興的綠色溶劑，形成的雙水相體系具有分相快、黏度低、萃取率高及兩相界面清晰等優(yōu)點(diǎn)[9]，可有效萃取植物蛋白酶。王偉濤等[10]運(yùn)用離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶，結(jié)果表明木瓜蛋白酶酶活回收率為91.2%，純化倍數(shù)為1.73。

本研究采用[Cnmim]Cl(n=2，4，6)-K2HPO4雙水相法萃取無花果蛋白酶，通過優(yōu)化雙水相體系中關(guān)鍵因子，分析其對無花果蛋白酶的分配行為及活力影響，確定最優(yōu)萃取體系，為后期無花果蛋白酶的提純及應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

無花果青果采自句容市虎耳山無花果專業(yè)合作社；([C2mim]Cl、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl)購自上海成捷有限公司；K2HPO4(AR)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，L-半胱氨酸，干酪素購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 無花果粗蛋白酶的制備 利用物理擠壓法收集無花果未成熟果實(shí)中白色乳汁，參考Mostafaie等[11]的方法，采用鹽析法提取無花果蛋白粗酶，備用于下一步試驗(yàn)。

1.2.2 [Cnmin]Cl(n=2,4,6)-K2HPO4離子液體雙水相萃取無花果蛋白酶 (1)在離子液體([C2mim]Cl、[C4mim]Cl和[C6mim]Cl)質(zhì)量濃度分別設(shè)定為0.30 g/mL、體系pH 7.0、30 ℃、酶添加量為3.0 mg/mL的條件下，體系K2HPO4質(zhì)量濃度分別為0.25，0.30，0.35，0.40，0.45 g/mL時(shí)，考察離子液體側(cè)鏈烷基長度及K2HPO4質(zhì)量濃度對無花果蛋白酶的萃取效果；(2)在雙水相體系K2HPO4質(zhì)量濃度為0.30 g/mL、體系pH 7.0、30 ℃、酶添加量3.0 mg/mL條件下，設(shè)定離子液體[C4mim]Cl質(zhì)量濃度分別為0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 g/mL，考察離子液體質(zhì)量濃度對無花果蛋白酶的萃取效果；(3)在0.30 g/mL [C4mim]Cl，0.30 g/mL K2HPO4，pH 7.0，30 ℃雙水相體系中，設(shè)定無花果粗酶粉添加量分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mg/mL，考察酶添加量對無花果蛋白酶的萃取效果；(4)在0.30 g/mL [C4mim]Cl、0.30 g/mL K2HPO4、酶添加量3.0 mg/mL、30 ℃條件下，設(shè)定體系pH分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，考察體系pH值對無花果蛋白酶的萃取效果。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對離子液體質(zhì)量濃度(A)、K2HPO4質(zhì)量濃度(B)、酶添加量(C)和pH值(D)這4個因素進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)Box-Benhnken中心區(qū)組試驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶回收率和純化倍數(shù)作為考察指標(biāo)，獲得無花果蛋白酶的最佳萃取參數(shù)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 因素水平

1.2.3 蛋白酶活性測定及酶活回收率計(jì)算 參考王偉濤等[10]的方法，無花果蛋白酶活性測定以酪蛋白為底物。酶活回收率(Ye)=(EtopVtop/Me)×100。其中，Etop為上相酶活性濃度(U/mL)，Vtop為上相體積(mL)，Me為初始總酶活性(U)。

1.2. 4 蛋白含量測定及純化倍數(shù)計(jì)算 采用Bradford法來測定蛋白質(zhì)含量[10]，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。PF(純化倍數(shù))=SAtop/SAI，其中，SAtop為上相酶比活力，SAI為初始酶比活力。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert 8.0.5和Microsoft Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與作圖，P<0.05，表示具有處理間顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 K2HPO4質(zhì)量濃度與[Cnmim]Cl(n=2，4，6)對無花果蛋白酶的萃取效果

如圖1所示，[C4mim]Cl體系中酶活回收率在K2HPO4質(zhì)量濃度為0.25—0.45 g/mL 范圍內(nèi)均高于[C2mim]Cl和[C6mim]Cl體系。從理論方面來講，延長離子液體側(cè)烷基鏈，可提高其疏水性，有利于蛋白質(zhì)選擇性分配至其中[13]。然而研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)烷基鏈過長在一定程度上破壞了無花果蛋白酶的活性[12]，故舍去[C6mim]Cl體系。

圖1 離子液體類型和K2HPO4質(zhì)量濃度對無花果蛋白酶萃取效果的影響

比較[C2mim]Cl和[C4mim]Cl體系發(fā)現(xiàn)，同等鹽質(zhì)量濃度下，[C4mim] Cl體系中無花果蛋白酶酶活回收率和純化倍數(shù)均較高，表明該體系對無花果蛋白酶的選擇性較好。分析[C4mim]Cl體系中鹽質(zhì)量濃度對蛋白酶萃取效果，可看出K2HPO4質(zhì)量濃度低于0.25 g/mL時(shí)，未形成雙水相，之后隨著K2HPO4的增加，酶活回收率和純化倍數(shù)也隨之升高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)0.35 g/mL時(shí)，酶活回收率和純化倍數(shù)達(dá)到最高，分別為93.11%和1.56。因此，選擇[C4mim]Cl體系、0.35 g/mL K2HPO4為中心實(shí)驗(yàn)值。

2.2 離子液體[C4mim]Cl質(zhì)量濃度對無花果蛋白酶萃取效果的影響

由圖2所示，雙水相體系中在相同K2HPO4質(zhì)量濃度條件下，無花果蛋白酶活回收率和純化倍數(shù)隨著[C4mim]Cl質(zhì)量濃度增加表現(xiàn)為上升趨勢。當(dāng)[C4mim]Cl質(zhì)量濃度為0.30 g/mL時(shí)，酶活回收率和純化因子均達(dá)到最大，分別為91.4%和1.70，此后繼續(xù)添加[C4mim]Cl，酶活回收率和純化倍數(shù)逐漸下降。因此，選取質(zhì)量濃度為0.30 g/mL[C4mim]Cl為中心實(shí)驗(yàn)值。

圖2 [C4mim]Cl質(zhì)量濃度對無花果蛋白酶萃取效果的影響

2.3 酶添加量對無花果蛋白酶分配行為的影響

如圖3所示，在無花果蛋白酶添加量為2.0 mg/mL時(shí)，由于體系需分配的蛋白質(zhì)未達(dá)到體系最大分配值，故酶活回收率和純化倍數(shù)均較低；隨著無花果蛋白酶添加量的繼續(xù)增加，酶活回收率和純化倍數(shù)也隨之不斷升高，在酶添加量為3.0 mg/mL，酶活回收率達(dá)到最大為91.28%；因此，酶添加量3.0 mg/mL為中心實(shí)驗(yàn)值。

圖3 酶添加量對無花果蛋白酶萃取效果的影響

2.4 pH值對無花果蛋白酶分配行為的影響

由圖4所示，在選取的pH范圍內(nèi)，酶活回收率和純化倍數(shù)變化趨勢一致，均為先增加后減少。當(dāng)pH 9.0時(shí)，兩者達(dá)到最大分別為92.19%和1.72。綜合考慮，選擇pH值9.0為中心實(shí)驗(yàn)值。

圖4 pH值對無花果蛋白酶萃取效果的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過Design expert軟件中Box-Behnken模塊對單因素試驗(yàn)結(jié)果中影響無花果蛋白酶純化效果較為顯著的離子液體質(zhì)量濃度、K2HPO4質(zhì)量濃度、酶添加量及pH值進(jìn)行試驗(yàn)，以酶回收率和純化倍數(shù)為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

對表2所示數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，分別得到酶活回收率(Ye)和純化倍數(shù)(PF)對離子液體質(zhì)量濃度(A)、K2HPO4質(zhì)量濃度(B)、酶添加量(C)及pH值(D)的二次多元回歸方程：

Ye=86.27-0.19A-0.92B-1.19C-0.33D-0.81
AB-2.28AC+1.50AD-1.77BC+0.091BD-
1.21CD+0.88A2+2.11B2+1.00C2-0.30D2

(1)

PF=1.57-0.003 4A-0.009 5B-0.02 1C-
0.014D-0.072AB-0.059AC-0.090AD-
0.070BC+0.006 25BD+0.026CD+0.025A2+
0.077B2+0.004 4C2-0.014D2

(2)

方程(1)和(2)的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為94.04%和96.79%，表明模型擬合度良好。對所得響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，4。以酶活回收率(Ye)和純化倍數(shù)(PF)為響應(yīng)值的2個模型P值<0.000 1，表明所得回歸方程的F檢驗(yàn)極顯著；失擬項(xiàng)均表現(xiàn)為不顯著(PYe=0.713 8；PPF=0.066 1。P>0.05)，表明方程擬合度很好。通過比較回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對值,判定試驗(yàn)因素的影響主次性，各因素對無花果蛋白酶活回收率的影響順序?yàn)椋好柑砑恿?、K2HPO4質(zhì)量濃度、pH值及離子液體質(zhì)量濃度；對蛋白酶純化倍數(shù)的影響順序：酶添加量、pH值、K2HPO4質(zhì)量濃度和離子液體質(zhì)量濃度。從表3，4分析結(jié)果看出，所選因素水平中，B，C，AB，AC，AD，BC，BD，CD，A2，B2和C2對Ye值影響顯著，C，D，AB，AC，AD，CD，A2和B2對PF值影響顯著。通過已建立的模型設(shè)定目標(biāo)響應(yīng)值Ye值和PF值最大，得到模型預(yù)測的最優(yōu)條件是：[C4mim]Cl 為 0.35 g/mL，K2HPO4質(zhì)量濃度為 0.3 g/mL，酶添加量為 2.5 mg/mL，pH為 8.5。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測條件的可靠性，以預(yù)測條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)值Ye為 92.64%,PF為1.81，與預(yù)測值(Ye為92.29%，PF為1.83)，偏差分別為0.38%和1.09%，表明預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值一致性較好。

3 討論與結(jié)論

無花果蛋白酶是廣泛存在于無花果莖、葉和果實(shí)中的一類活性中心為半胱氨酸的肽鏈內(nèi)切酶，具有活性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于食品和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域[8]。目前已報(bào)道的分離純化無花果蛋白酶的方法有鹽析法、乙醇法、單寧法和柱層析法等，然而這些方法存在諸如提取效率低、純度低等局限性[8,12]。離子液體雙水相法是利用新型綠色溶劑、無機(jī)鹽和水形成分離效果好且溫和的分離體系，近年來被用于蛋白質(zhì)、酶等活性物質(zhì)的分離純化[13]。本研究分析[Cnmim]Cl(n=2，4，6)-K2HPO4離子液體雙水相法萃取無花果蛋白酶效果，結(jié)果顯示在[Cnmim]Cl(n=2，4，6)體系中，無花果酶活回收率和純化倍數(shù)均隨鹽濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，這與王偉濤等[10]在利用離子液體雙水相純化木瓜蛋白酶所得結(jié)果一致，分析原因可能是鹽析作用是形成雙水相的主要原因，隨著鹽濃度的增加促進(jìn)了鹽析作用的增強(qiáng)，有利于無花果蛋白酶分配于上相，然而鹽濃度的增加同時(shí)會與上相競爭水分，導(dǎo)致上相黏度增加，不利于無花果蛋白酶的轉(zhuǎn)移。離子液體是雙水相體系組成的一部分，其濃度的大小影響提取效率，本研究顯示當(dāng)離子液體質(zhì)量濃度<0.3 g/mL時(shí)，隨著離子液體質(zhì)量濃度的增大，蛋白酶提取率也逐漸增大；然而離子液體質(zhì)量濃度超過0.3 g/mL時(shí)，會使蛋白質(zhì)在相間的傳遞和擴(kuò)散受阻，不利于無花果蛋白酶進(jìn)入離子液體相，進(jìn)而引起酶活回收率和純化倍數(shù)明顯下降[14]。

表3 響應(yīng)值為酶活回收率(Ye)的方差分析

表4 響應(yīng)值為純化倍數(shù)(PF)的方差分析

無花果蛋白酶在離子液體雙水相體系的分配還受酶添加量的影響，施婭楠等[15]利用[C4mim]Br/K2HPO4提取辣木葉凝乳酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶添加量超過20 mg/mL時(shí)，凝乳蛋白酶活回收率降低。本研究中亦出現(xiàn)相似結(jié)果，當(dāng)酶添加量超過0.3 g/mL時(shí)，上相液出現(xiàn)微乳化現(xiàn)象，相界不明顯，且酶活回收率和純化倍數(shù)均下降，分析原因，可能是酶加入量超過上相體系承載量后，多余的酶被分配于兩相之間，不利于相界面的分離，引起酶活回收率下降。

體系pH值是影響萃取效率的另一重要因子。本研究中當(dāng)體系pH值在8—10時(shí)，分離效果較好。無花果蛋白酶為兩性分子，其帶電狀態(tài)受體系pH值和蛋白質(zhì)本身等電點(diǎn)的影響，無花果蛋白酶的等電點(diǎn)約為9.0，當(dāng)pH值與等電點(diǎn)接近時(shí)對蛋白質(zhì)的分配行為影響最小，而兩者相差過大時(shí)，引起離子液體咪唑分子與蛋白質(zhì)之間的靜電作用發(fā)生變化，進(jìn)而影響了蛋白質(zhì)在兩相中分配。

響應(yīng)面法通過對過程的回歸擬合和響應(yīng)曲面值的繪制尋找最佳組合條件的方法，廣泛應(yīng)用于工藝優(yōu)化研究，本研究基于單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面法，通過已建立的模型設(shè)定目標(biāo)響應(yīng)值Ye值和PF值最大，得到無花果蛋白酶純化最優(yōu)條件：0.35 g/mL [C4mim]Cl，0.3 g/mL K2HPO4，2.5 mg/mL酶添加量，pH值8.5。在此條件下酶活回收率和純化倍數(shù)分別為92.64%和1.81，與預(yù)測值具有較好的一致性。