劉爾黎，鐘雯怡，劉增一，楊 琨，劉 琪

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

2型糖尿病與多種疾病有密切關(guān)系，牙周炎現(xiàn)已被普遍認(rèn)為是2型糖尿病的并發(fā)癥之一，已被學(xué)者確認(rèn)為糖尿病的第六大并發(fā)癥[1]。牙周炎是牙齒周圍組織的慢性炎癥，而目前研究許多的關(guān)注點(diǎn)都在于牙齦的退縮、牙槽骨的吸收以及牙齒的松動(dòng)脫落[2]。但是患者可存在牙齒冷熱刺激敏感的癥狀，很大程度上取決于牙根面的牙骨質(zhì)破壞以及再生修復(fù)能力的降低。2型糖尿病作為全身因素可促進(jìn)牙周炎的發(fā)展，通常其嚴(yán)重程度與血糖水平呈正相關(guān)關(guān)系[3]，并且牙周炎的治療有利于糖尿病患者血糖值以及糖化血紅蛋白的控制，而治療糖尿病也有利于牙周炎各項(xiàng)指標(biāo)的恢復(fù)[4]，因此，對(duì)糖尿病伴牙周炎造成的更為嚴(yán)重的牙周炎癥狀機(jī)理的研究，有利于此類患者疾病病理狀態(tài)的合理解釋、治療以及預(yù)后效果的評(píng)估。

牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)來(lái)源于牙根周圍的韌帶組織牙周膜，因其具有分化成為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞的能力，在牙周組織再生中可能扮演重要角色[5]，自Seo等[6]成功把牙周膜干細(xì)胞從牙周膜中分離出來(lái)，對(duì)其相關(guān)研究目前仍在不斷深入，Gay 等[7]體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDLSCs具有較強(qiáng)的克隆形成能力。

目前有學(xué)者研究表明，來(lái)源于牙周膜的間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞[5,8-9]，成牙骨質(zhì)細(xì)胞是牙骨質(zhì)形成的重要功能細(xì)胞，在牙根形成、牙骨質(zhì)修復(fù)中起著關(guān)鍵性作用。我們的研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，2型糖尿病伴牙周炎的牙周膜干細(xì)胞骨向分化能力降低[10]，但PDLSCs的成牙骨質(zhì)分化能力是否發(fā)生改變目前還不甚清楚。為此，本研究擬對(duì)2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干細(xì)胞的成牙骨質(zhì)分化能力進(jìn)行探索，為解釋2型糖尿病伴牙周炎狀態(tài)下，牙周組織再生修復(fù)能力降低，牙骨質(zhì)破壞所導(dǎo)致的牙本質(zhì)暴露，患者冷熱刺激敏感的可能原因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 胎牛血清FBS(四季青公司)；胰蛋白酶、α-MEM培養(yǎng)基、膠原酶、(Gibco 公司)；鼠抗人 CD29、CD44、CD45、stro-1、CD90、CD271、CD166單克隆抗體(Abcam公司)；CCK-8(日本Dojindo Kagaku 公司)；BD流式細(xì)胞儀、濕度CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、細(xì)胞總RNA提取試劑盒(生工生物公司)；cNCPs英國(guó)伯明翰大學(xué)的Smith教授提供，Real Time-PCR儀、凝膠成像分析儀、分光光度計(jì)、PCR逆轉(zhuǎn)錄儀、Western blot相關(guān)試劑、ALP定量試劑盒(南京建成)。

1.2 方法

1.2.1 取材標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)分組 健康組(H-PDLSCs)牙周膜組織獲取主要對(duì)象為在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院就診，18～25歲需拔出前磨牙或第三磨牙患者(因正畸或智齒異位萌出)。入選患者的標(biāo)準(zhǔn)為不吸煙，無(wú)糖尿病病史及家族史，血糖水平正常、口內(nèi)余留牙不少于20顆；無(wú)系統(tǒng)疾病或感染。2型糖尿病伴牙周炎組(DP-PDLSCs):就診于遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的2型糖尿病伴重度牙周炎癥病患，平均年齡為30～45歲入選標(biāo)準(zhǔn):患者被診斷為2型糖尿病，病程為1年及以上，未有其他嚴(yán)重全身疾病及并發(fā)癥;用藥量近期未見(jiàn)明顯變化，無(wú)吸煙史。并符合以下條件:①口內(nèi)殘留牙數(shù)不少于15顆，因重度牙周炎需拔除的患牙，無(wú)明顯齲壞、牙髓及根尖周病;②X線片上牙槽骨的損失情況超過(guò)根長(zhǎng)1/2者，半年內(nèi)應(yīng)無(wú)牙周病治療史。組織塊與單克隆分離培養(yǎng)法：收集到的牙周膜組織PBS緩沖液沖洗3次，收集沖洗液，800 rpm離心3 mim，1%Ⅰ型膠原酶消化，培養(yǎng)基中和離心，組織均勻平鋪于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入預(yù)配制濃度為100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液約4～5 mL全覆蓋碎屑組織，置于37 ℃含5%CO2的恒溫箱中貼壁培養(yǎng)觀察到4 h后見(jiàn)細(xì)胞貼壁形態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)20 h換液，于細(xì)胞匯聚率為90%～100%時(shí)進(jìn)行常規(guī)消化傳代，稀釋為1/200 μL的PDLSCs細(xì)胞，接種于96孔板，24 h換液，待單克隆細(xì)胞長(zhǎng)滿孔板底部后消化傳代即為第3代PDLSCs。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)表面分子 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代PDLSCs，常規(guī)消化離心后，稀釋并計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)量為5×105個(gè)/1.5 mL EP管，加入已配制好的含3%胎牛血清PBS重懸細(xì)胞，加入CD45、CD90、CD44、CD29、CD166 2 μL，4 ℃冰箱避光孵育12 h(過(guò)夜)，12 000 r/min 離心5 min，加入單抗相對(duì)應(yīng)的熒光二抗避光孵育2 h，無(wú)需熒光的加入等量PBS。加入含3%胎牛血清的PBS混合均勻溶液，吹勻，3% 胎牛血清PBS清洗，12 000 r/min離心5 min，清洗2～3次后加300 μL 3%胎牛血清 PBS，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞表面分子。實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)3次。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 利用CCK-8試劑盒對(duì)比兩組細(xì)胞7 d增殖能力，利用第3代生長(zhǎng)增殖狀態(tài)良好的H-PDLSCs及DP-PDLSCs兩組細(xì)胞，EDTA+胰蛋白酶消化離心，均勻稀釋并上機(jī)細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度為1×103/孔接種至96孔板，分別在每日正午12時(shí)測(cè)7 d增殖曲線，每孔細(xì)胞培養(yǎng)基加入預(yù)配制200 μL 10%胎牛血清 DMEM-F12。各組細(xì)胞加入10 μL CCK-8，置于37 ℃含5%CO2的恒溫箱4 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度值，繪制7d H-PDLSCs及DP-PDLSCs連續(xù)生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)3次。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA表達(dá)取培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間狀態(tài)良好的兩組細(xì)胞，用10 μg/mL cNCPs[11]和礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成牙骨質(zhì)培養(yǎng)基)處理，培養(yǎng)7 d。各組細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)3次。按TRIzol說(shuō)明書(shū)方法提取EMSCs總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，基因號(hào)分別為：ALP(ID:249)、OPN(ID:6696)、OCN(ID:43567)、CEMP1(ID:752014)、CAP(ID:36084)，以Primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物；以GAPDH為內(nèi)參照，采用Real Time-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各0.5 μL、樣本模板2 μL；反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min、 94℃ 30 s 、65℃ 30 s、 40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列見(jiàn)表1。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白GAPDH、OCN、CEMP1、CAP的表達(dá) 取14d后牙周膜干細(xì)胞用10 μg/mL cNCPs成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)[11]和礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理后H-PDLSCs及DP-PDLSCs兩組細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫反應(yīng)，以GAPDH內(nèi)參蛋白對(duì)相關(guān)蛋白OCN、CEMP1、CAP進(jìn)行顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)3次。

表1 引物基因序列

1.2.6 ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成量分析 常規(guī)消化處理增殖良好的兩組細(xì)胞，10 μg/mL cNCPs成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，取兩組細(xì)胞分別用ALP試劑盒(AKP/ALP)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè) PDLSCs 表面標(biāo)志物 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織塊法與單克隆法成功分離并培養(yǎng)擴(kuò)增出健康來(lái)源牙周膜干細(xì)胞與2型糖尿病伴牙周炎來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)PDLSCs 表面標(biāo)志物 CD45、CD90、CD44、CD29、CD166其檢出率分別為0.02%、99.94%、99.59%、100.00%、99.99%，證明本細(xì)胞提取方法獲得的細(xì)胞都為間充質(zhì)來(lái)源(見(jiàn)圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PDLSCs 各表面標(biāo)志物的檢出率

2.2 CCK-8檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖 在連續(xù)7 d相同條件培養(yǎng)情況下，CCK-8檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖情況，H-PDLSCs增殖能力高于DP-PDLSCs，兩組用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)檢測(cè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 CCK-8檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖情況比較

2.3 RT-PCR檢測(cè)DP-PDLSCs中各組基因表達(dá)量比較 兩組細(xì)胞成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)7 d后RT-PCR結(jié)果表明DP-PDLSCs ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA的表達(dá)量，DP-PDLSCs中各組基因表達(dá)量較H-PDLSCs低(見(jiàn)圖3)。

*：與DP-PDLSCs比較，P<0.05。圖3 RT-PCR檢測(cè)DP-PDLSCs中各組基因表達(dá)量

2.4 Western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá) 成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)14 d后OCN、CEMP1和CAP蛋白表達(dá)，OCN、CEMP1、CAP蛋白表達(dá)量DP-HPDLSCs較H-PDLSCs低(見(jiàn)圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)

2.5 ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成量分析 常規(guī)消化處理增殖良好的兩組細(xì)胞，成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，H-PDLSCs成牙骨質(zhì)礦化能力高于DP-PDLSCs成牙骨質(zhì)礦化能力。

A:H-PDLSCs;B:DP-PDLSCs。圖5 ALP分析兩組細(xì)胞的活性和礦化結(jié)節(jié)形成量

3 討論

目前，已經(jīng)有很多研究證實(shí)，慢性牙周炎作為2型糖尿病的第六大并發(fā)癥[11]，并且糖尿病患者牙周炎患病的風(fēng)險(xiǎn)是健康者的2～3倍[12]，嚴(yán)重的影響到中老年患者的生活質(zhì)量。因此，對(duì)糖尿病及牙周炎相互影響的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程仍是牙周醫(yī)學(xué)研究的熱門話題。

PDLSCs作為牙周組織再生的重要細(xì)胞之一，在牙周組織內(nèi)的核心作用主要是是通過(guò)干細(xì)胞克隆增殖以及分化來(lái)形成不同數(shù)量以及不同種類的牙周組織。本實(shí)驗(yàn)我們選取了CD45、CD90、CD44、CD29、CD166細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果顯示牙周膜干細(xì)胞具備間充質(zhì)來(lái)源的特點(diǎn)，并且存在良好的干細(xì)胞干性以及優(yōu)良的增殖能力。值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病伴牙周炎患者牙周組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞的增殖及分化能力降低。而牙周膜干細(xì)胞是一種獨(dú)特的間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠分化為多種牙周組織包括：牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨等。牙骨質(zhì)是特殊的無(wú)血管礦化組織，類似骨樣組織，牙骨質(zhì)基質(zhì)由成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌而形成，是牙周組織再生的關(guān)鍵[13]。 并且最近相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細(xì)胞能夠分化成為成牙骨質(zhì)細(xì)胞[5,8-9]，成牙骨質(zhì)細(xì)胞是牙周組織中牙骨質(zhì)形成的重要功能細(xì)胞，在牙根形成、牙周病牙骨質(zhì)修復(fù)及牙根吸收與修復(fù)過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。牙根表面修復(fù)性牙骨質(zhì)的形成，成牙骨質(zhì)細(xì)胞附著的干預(yù)，最終起到防止牙根吸收的目的。成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌的牙骨質(zhì)基質(zhì)礦化起著決定作用，所以成牙骨質(zhì)細(xì)胞是牙骨質(zhì)修復(fù)和再生的基礎(chǔ)。成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞均可由牙周膜干細(xì)胞分化而成，生成牙骨質(zhì)基質(zhì)的唯一組織細(xì)胞是成牙骨質(zhì)細(xì)胞，其與牙槽骨內(nèi)的成骨細(xì)胞來(lái)源于同一前體細(xì)胞，位于牙周膜內(nèi)側(cè)[14]。因此，2型糖尿病伴牙周炎患者牙周組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞的增殖及分化能力降低進(jìn)一步表明了此類疾病患者牙周組織再生能力的減弱，病態(tài)細(xì)胞的各種能力降低也是由于糖尿病及牙周炎兩種疾病狀態(tài)的疊加所導(dǎo)致。

牙骨質(zhì)附著蛋白(Cementum attachment protein，CAP)表達(dá)于牙骨質(zhì)與成牙骨質(zhì)細(xì)胞中[15]，牙槽骨中未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)[16]，CAP被認(rèn)為可以作為成牙骨質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志分子。因此本實(shí)驗(yàn)選定CAP蛋白作為檢驗(yàn)成牙骨質(zhì)方向分化的指標(biāo)之一。堿性磷酸酶(ALP) 是有骨化潛能的細(xì)胞標(biāo)志性酶之一，它在細(xì)胞體外鈣化起關(guān)鍵作用。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是間充質(zhì)干細(xì)胞重要的礦化相關(guān)基因之一，在上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath，HERS)的發(fā)育中就已經(jīng)存在，并且在牙骨質(zhì)礦化過(guò)程中調(diào)節(jié)晶核的生長(zhǎng)和礦化速度[17]。骨鈣素(Osteocalcin，OCN )是反映成骨細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)，能準(zhǔn)確反映成骨細(xì)胞的成骨功能，研究表明牙根面靠近牙周膜區(qū)域的牙骨質(zhì)內(nèi)有高濃度的OCN表達(dá)[18]，能夠作為細(xì)胞礦化的關(guān)鍵因子促進(jìn)牙骨質(zhì)再生。牙骨質(zhì)蛋白1(Cementum protein 1,CEMP1)是一種新的牙骨質(zhì)成分，其存在僅限于成牙骨質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞-牙周膜干細(xì)胞中也高度表達(dá)，牙周膜干細(xì)胞CEMP1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了成牙骨質(zhì)分化和牙周及成骨細(xì)胞表型的減弱，表明CEMP1緊密參與了牙骨質(zhì)的再生及形成[19]。

本實(shí)驗(yàn)以ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP為指標(biāo)對(duì)2型糖尿病伴牙周炎來(lái)源的人牙周膜干細(xì)胞成牙骨質(zhì)礦化功能的變化對(duì)比。通過(guò)RT-PCR結(jié)果表明DP-PDLSCs： ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA的表達(dá)量均低于H-PDLSCs；Western blot檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)與RT-PCR結(jié)果相一致，成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)14d OCN、CEMP1、CAP蛋白表達(dá)量DP-HPDLSCs較低。ALP試劑盒染色結(jié)果顯示，DP-PDLSCs成牙骨質(zhì)礦化能力也減弱，由此，可推測(cè)疾病狀態(tài)下牙周組織遭到影響與破壞，進(jìn)一步影響了牙周膜干細(xì)胞增殖及分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞的能力，導(dǎo)致牙周組織再生修復(fù)受到障礙。

牙周炎是以牙周軟硬組織的破壞和改建為主要表現(xiàn)的發(fā)病率較高的疾病，嚴(yán)重影響口腔健康，并且可能影響糖尿病等其它系統(tǒng)性疾病。在牙周組織破壞中起著重要作用的炎性細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素-1β(Interleukin，IL- 1β)和腫瘤壞死因子- α(Tumor necrosis factor alpha，TNF- α)[20-21]。這些炎性細(xì)胞因子在牙周的炎癥病變部位和組織破壞期間顯著升高[20]。此外，在牙周治療和組織恢復(fù)到健康狀態(tài)后，這些細(xì)胞因子顯著降低[21]。

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于胰島素分泌缺陷或其生物學(xué)功能受損而引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，其典型特征為高血糖。2型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，即胰島 β細(xì)胞能夠產(chǎn)生足夠濃度的胰島素，但機(jī)體組織細(xì)胞對(duì)正常濃度的胰島素反應(yīng)不足，需要更高濃度的胰島素才能發(fā)揮正常的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，感染導(dǎo)致胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)胰島素敏感性有顯著影響[22]。已經(jīng)證明，IL-1β通過(guò)凋亡機(jī)制促進(jìn)蛋白激酶C的激活，導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞的破壞[23]。此外，IL-1β通過(guò)耗盡細(xì)胞儲(chǔ)能和產(chǎn)生一氧化氮，對(duì)β細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。在動(dòng)物模型和人體研究中，TNF-α已被認(rèn)為是胰島素抵抗和2型糖尿病的病因[24-25]。TNF-α的升高水平會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)(抑制胰島素受體的酪氨酸激酶活性)并減少其合成。胰島素反應(yīng)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，產(chǎn)生類似于2型糖尿病的胰島素抵抗的胰島素抵抗綜合征[25-26]。

綜上所述，2型糖尿病伴牙周炎疾病狀態(tài)下，牙周膜干細(xì)胞的向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化能力降低，并且細(xì)胞的礦化水平也降低，牙周組織再生修復(fù)能力較差，出現(xiàn)此類情況可能源于高血糖狀態(tài)、以及牙周毒力因子和局部微環(huán)境因素的影響，但牙周炎以及全身疾病狀態(tài)的糖尿病如何協(xié)同影響牙周組織再生修復(fù)內(nèi)在分子機(jī)制的探索仍是研究學(xué)者們應(yīng)該進(jìn)一步關(guān)注的方向。