周 昊,李 鈺,滕子文,杜凌君,萬方浩,2,周洪旭,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東省植物病蟲害綜合防控實驗室,中澳農(nóng)業(yè)與環(huán)境健康聯(lián)合研究院,山東青島 266109; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因研究所,廣東深圳 518120)

蘋果綿蚜Eriosomalanigerum(癭綿蚜科Pemphigidae)、繡線菊蚜Aphiscitricola(蚜科Aphididae)和梨網(wǎng)蝽Stephanitisnashi(網(wǎng)蝽科Tingidae)是蘋果園中的刺吸式害蟲，它們都以刺吸式口器對蘋果樹造成不同程度的危害。蘋果綿蚜刺吸蘋果樹的枝條、樹干和根系，不為害葉片，能夠向蘋果樹表皮組織中分泌唾液，使被害組織非正常性增生腫脹，影響水分及養(yǎng)分的運輸，削弱樹勢。形成的腫瘤經(jīng)常會破裂，形成傷口，有利于各種病菌滋生，導(dǎo)致木質(zhì)部黑褐色壞死，被害根須根停止生長，喪失吸收能力，進一步腐爛，影響成花、成果，嚴(yán)重時導(dǎo)致整株死亡(Weber and Brown,1988;Kelmetal.,2004;Suetal.,2016)。繡線菊蚜主要群集在蘋果樹嫩梢、葉片背面，刺吸韌皮部汁液，影響新梢正常生長，嚴(yán)重時造成樹勢衰弱。繡線菊蚜在刺吸為害過程中能傳播植物病毒，同時分泌的蜜露可覆蓋蘋果樹葉片表面，利于病原菌的大量滋生，間接造成病害流行(殷萬東等,2013)。梨網(wǎng)蝽主要在植物葉片背面刺食葉片細(xì)胞，造成葉片失綠正面出現(xiàn)黃白色斑點，降低光合作用，嚴(yán)重時造成葉片脫落，影響果樹正常生長，降低果實產(chǎn)量和品質(zhì)。同時，梨冠網(wǎng)蝽成、若蟲在葉片背面排泄大量的黑褐色分泌物，污染下部葉片，利于病原菌的大量滋生，間接造成病害流行(孫學(xué)海,2007)。

植食性昆蟲為了適應(yīng)和突破植物的防御性狀，在漫長的進化中形態(tài)逐漸發(fā)生變異，分化出不同類型的口器，如刺吸式、咀嚼式以及銼吸式口器等(Hermsmeieretal.,2001)。其中，刺吸式口器害蟲種類繁多，具有繁殖數(shù)量大、繁殖速度快和發(fā)生世代數(shù)多等特點。該類昆蟲不僅直接刺吸作物，影響作物正常生長，還能直接或間接傳播病害。刺吸式口器昆蟲可分為兩大類：以蚜蟲、粉虱等為代表的維管束汁液取食昆蟲(vascular feeder)，該類昆蟲取食植物時將口針刺入植物組織表皮細(xì)胞和薄壁細(xì)胞間，吸取木質(zhì)部和(或)韌皮部的汁液(Tjallingii,2006)；另一類以蝽等為代表的葉肉細(xì)胞取食昆蟲(mesophyll feeder)，這類昆蟲取食時，先將口針刺穿植物表皮，然后插入植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，然后通過口針的劇烈活動破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并取食植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(Southwood,1973;Labandeira and Phillips,1996)。

刺吸電位(electrical penetration graph,EPG)技術(shù)可以顯示刺吸式昆蟲的口針在植物內(nèi)的不同部位以及昆蟲的刺探和吸食行為。該技術(shù)具有操作周期短、靈敏快捷等優(yōu)點，它最大的優(yōu)越性在于能夠準(zhǔn)確記錄昆蟲的口針在植物組織內(nèi)的每一種行為的起止時間及發(fā)生頻次，如細(xì)胞穿刺、唾液分泌、韌皮部吸食、木質(zhì)部吸食和口針的機械運動等。目前，該技術(shù)所涉及的昆蟲種類包括蚜蟲、粉虱、飛虱、介殼蟲、薊馬、木虱、葉蟬等(李靜靜等,2019)，主要用于研究刺吸式口器昆蟲對寄主植物的取食選擇性、傳毒機制、作物的抗蟲機制等，是農(nóng)業(yè)昆蟲行為生態(tài)學(xué)研究中不可缺少的一個環(huán)節(jié)(姜永幸和郭予元,1994;閆鳳鳴和王滿囷,2017)。

蘋果綿蚜和繡線菊蚜為汁液取食者，而梨網(wǎng)蝽為細(xì)胞取食者，同時蘋果綿蚜在枝條上取食，而繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽取食葉片。因此本研究選取蘋果園中具有代表性的這3種刺吸式害蟲，利用EPG 分析其刺吸為害蘋果樹的刺吸電位波形，并與其取食的生物學(xué)意義相結(jié)合，揭示不同刺吸式口器昆蟲取食的異同點，有助于闡明其生態(tài)位分離機制以及取食行為學(xué)機制，對于有效防治蘋果園中刺吸式害蟲具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試蘋果品種為長勢相近的1年生新紅星，由山東省煙臺市棲霞苗圃提供，移栽至塑料花盆中，在玻璃溫室中培養(yǎng)(25±3℃,RH 70%±10%，自然光照)至株高60～70 cm。每株蘋果苗只測試1頭昆蟲，測試過EPG的蘋果苗將不再繼續(xù)試驗。

1.2 供試?yán)ハx

試驗用蘋果綿蚜、繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)玻璃溫室(25±3℃,RH 70%±10%，自然光照)內(nèi)的1-2年生蘋果苗上，未施用任何殺蟲劑。選取長勢相同蟲體完整的成蟲進行測定，測試過EPG的成蟲將不再用于其他試驗。

1.3 EPG波形記錄

在顯微鏡下檢查3種昆蟲的成蟲，以確保它們的口器和觸角沒有受損并用毛筆把蘋果綿蚜體表的白色蠟泌物清理干凈。使用Giga-8dd DC-EPG (輸入抵抗：1 GΩ；數(shù)模轉(zhuǎn)換器：100 Hz/14位分辨率) 系統(tǒng)(荷蘭瓦赫寧根大學(xué))記錄3種昆蟲的刺探電位圖譜。為屏蔽外界環(huán)境的電磁干擾，取食試驗分別在法拉第籠中(長×寬×高=80 cm×60 cm×100 cm)進行。將測試?yán)ハx放置在冰袋上，將直徑18 μm、長3～4 cm的金絲用導(dǎo)電銀膠粘在供試?yán)ハx的前胸背板上，金絲另一端用導(dǎo)電銀膠粘在銅絲端(銅絲和銅釘通過錫焊接)。將粘連好的昆蟲饑餓1 h，然后將銅釘插在EPG電極上，將粘在金絲上的蘋果綿蚜放置在蘋果嫩梢。用細(xì)膠帶將葉片背面朝上，并使葉片保持完整，將繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽放置在葉片背面進行試驗。隨后，將長約10 cm的銅質(zhì)棒狀植物電極插入蘋果盆栽土壤中。所有試驗均在安靜的室內(nèi)進行(25±3℃，RH 50%±10%，人工光源1 000 lx)。當(dāng)蚜蟲的探針刺穿植物的組織時，電路閉合并放大，然后轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，并通過Giga-8d控制單元進行放大，將其存儲在計算機中。然后，該數(shù)字信號被轉(zhuǎn)換為波形，并使用Stylet+d軟件顯示在屏幕上。每種昆蟲試驗數(shù)據(jù)記錄15次，每次試驗記錄8 h。在記錄的8 h內(nèi)未顯示取食波或無波形的昆蟲不記錄在數(shù)據(jù)中。記錄結(jié)束后，使用Stylet+a軟件根據(jù)Sandanayaka與Hale(2003)和何應(yīng)琴(2015)的標(biāo)準(zhǔn)，將蚜蟲的EPG波形劃分為非刺探波(np)、路徑波(C)、非主動細(xì)胞內(nèi)取食波(pd)、木質(zhì)部取食波(G)、韌皮部唾液分泌波(E1)、韌皮部取食波(E2)。根據(jù)前人研究及對比，將梨網(wǎng)蝽的EPG 波形劃分為非刺探波(np)、刺探波(A)，口針在葉肉組織中的刺探和吸食波形(Gc)和木質(zhì)部取食波形(E) (蔡曉明等,2008;趙秋劍等,2011;張瓊,2017)。并對8 h波形進行區(qū)分標(biāo)注，得到包含波形代碼的數(shù)據(jù)文件，然后計算EPG指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS19.0 軟件對蘋果綿蚜和繡線菊蚜在蘋果苗非韌皮部的各種EPG指標(biāo)的差異進行獨立樣本T檢驗;利用Microsoft Excel 2010和SPSS19.0軟件對梨網(wǎng)蝽、蘋果綿蚜、繡線菊蚜3種害蟲在蘋果韌皮部的刺探次數(shù)、第1次刺探時間、np波總時間(s)的差異進行單因素方差分析，其均值差異采用最小顯著差異法(LSD)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 蘋果綿蚜和繡線菊蚜成蚜取食行為比較

表1結(jié)果表明，兩種蚜蟲成蚜在蘋果苗非韌皮部取食時，繡線菊蚜的刺探次數(shù)、np波總時間和pd波次數(shù)均顯著高于蘋果綿蚜，而蘋果綿蚜的pd波平均時間顯著高于繡線菊蚜的(P<0.05)，其他EPG指標(biāo)(第1次開始刺探、C波總時間、G 波總時間和pd波總時間)無顯著性差異(P>0.05)。

表1 蘋果綿蚜和繡線菊蚜成蚜在蘋果苗非韌皮部的EPG指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of EPG parameters of Eriosoma lanigerum and Aphis citricola adults in the non-phloem of apple seedlings

表2表明，蘋果綿蚜和繡線菊蚜分別有56.25%和70.00%的蚜蟲第1次到達韌皮部即能持續(xù)吸食。同時蘋果綿蚜第1次出現(xiàn)E2波的時間顯著高于繡線菊蚜的，而蘋果綿蚜第1次到達韌皮部所用時間雖然沒有顯著高于繡線菊蚜的(P=0.055)，但其所用時間高于繡線菊蚜的，其他與韌皮部取食相關(guān)指標(biāo)沒有顯著性差異(P>0.05)。

表2 蘋果綿蚜和繡線菊蚜成蚜在蘋果苗韌皮部的EPG指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of EPG parameters of Eriosoma lanigerum and Aphis citricola adults in the phloem of apple seedlings

2.2 梨網(wǎng)蝽、蘋果綿蚜和繡線菊蚜成蟲刺吸行為比較

表3表明梨網(wǎng)蝽取食蘋果苗產(chǎn)生4種波形(np波、A波、Gc波和E波)，其np波總時間顯著高于蘋果綿蚜和繡線菊蚜的(P<0.05)。蘋果綿蚜的第1次刺探時間顯著高于繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽的(P<0.05)。

表3 梨網(wǎng)蝽、蘋果綿蚜和繡線菊蚜成蟲在蘋果苗上取食行為的比較Table 3 Comparison of feeding behaviors of Stephanitis nashi，Eriosoma lanigerum and Aphis citricola adults on apple seedlings

2.3 蘋果綿蚜、繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽成蟲產(chǎn)生波形的比重分析

統(tǒng)計3種刺吸式口器昆蟲在蘋果苗取食時各波形所占比例，做出波形比重分析圖，圖1表明，梨網(wǎng)蝽的np波總時間最長(53%)，其次是繡線菊蚜的(24%)，蘋果綿蚜的最低(1%)。從兩個汁液取食者(vascular feeder)的C波所占比例來看，蘋果綿蚜的C波占取食時間的51%,明顯高于繡線菊蚜的37%，而np波的持續(xù)時間為1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于繡線菊蚜的24%和梨網(wǎng)蝽的53%。蘋果綿蚜花費5%的時間在木質(zhì)部取食(G波)，而繡線菊蚜則花費8%的時間在木質(zhì)部取食。蘋果綿蚜和繡線菊蚜在蘋果苗上取食時,E2波(在韌皮部取食)所占總時間比例分別為35%和25%，而梨網(wǎng)蝽的取食波為Gc波(植物細(xì)胞取食，占總時間比例為36%)和E波(韌皮部取食，占總時間比例為11%)。

圖1 蘋果綿蚜、繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽成蟲在蘋果苗上取食8 h各種波形平均持續(xù)時間的占比Fig.1 Proportions of duration of various waveforms of Eriosoma lanigerum,Aphis citricola and Stephanitis nashi adults feeding on apple seedlings for 8 h

3 討論

3.1 蘋果綿蚜、繡線菊蚜與梨網(wǎng)蝽的取食行為的比較

EPG技術(shù)是研究刺吸式害蟲取食行為不可缺少的一個重要環(huán)節(jié)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，EPG技術(shù)也越來越完善，蚜蟲、粉虱、薊馬、盲蝽和葉蟬等昆蟲的各個EPG波形生物學(xué)意義也相繼得到了明確闡述(Kimmins and Tjallingii,1985;羅晨等,2005)。由于刺吸式口器昆蟲與寄主植物的對應(yīng)關(guān)系較復(fù)雜，因此不斷有新的波形被發(fā)現(xiàn)和描述，其結(jié)果均證實EPG波形不僅具有穩(wěn)定性，同時也有其多樣性(羅晨等,2005)。本研究運用EPG技術(shù)對蘋果園中的3種刺吸式昆蟲試驗發(fā)現(xiàn)，蘋果綿蚜和繡線菊蚜這兩種汁液取食者均能產(chǎn)生np波、C波、pd波、G波、E1波和E2波6種主要取食波形，且波形形狀和其代表的生物學(xué)意義基本相同(表1)。張瓊(2017)利用EPG技術(shù)對華南冠網(wǎng)蝽Stephanitislaudata和杜鵑冠網(wǎng)蝽S.pyrioides在杜鵑上取食行為進行試驗分析，發(fā)現(xiàn)兩種網(wǎng)蝽科害蟲的波形大致相同，分為np波、A波、G波、E1波和E2波。

而本研究發(fā)現(xiàn)梨網(wǎng)蝽在蘋果上取食的波形(表2)與張瓊(2017)發(fā)現(xiàn)的波形大體一致。同時張瓊(2017)中網(wǎng)蝽E1和E2波形的頻率特征非常相似，可以表明網(wǎng)蝽E1和E2其實是一類波形的不同變型。梨網(wǎng)蝽是細(xì)胞取食者，為區(qū)分與蚜蟲波形命名，遂將梨網(wǎng)蝽波形命名為np波、A波、Gc波和E波4種波形。我們將蚜蟲和梨網(wǎng)蝽的波形并結(jié)合前人研究進行比較發(fā)現(xiàn)(蔡曉明等,2008;趙秋劍等,2011;張瓊,2017)，蚜蟲的G波與梨網(wǎng)蝽的E波的特征大體一致，因為G波為蚜蟲吸食木質(zhì)部水分的波形，所以我們推測E波為木質(zhì)部取食波形，今后可結(jié)合透射電鏡、同位素示蹤、口針切割等技術(shù)，對上述波形進行驗證。

經(jīng)過以上對比分析蘋果綿蚜、繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽的EPG取食波譜及其特征，我們發(fā)現(xiàn)，這3種刺吸式昆蟲均經(jīng)歷了口針未進行刺探-口針進入植物組織刺探-口針到達取食部位進行取食的過程，而對應(yīng)的波形則是按照非刺探波(np)-路徑波(A,C和pd)-吸食波(Gc,E1,E2,G和E)依次發(fā)生(表1～3)。蘋果綿蚜、繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽的非刺探波都為np波，蘋果綿蚜和繡線菊蚜這類汁液取食者需要刺破表皮，并通過細(xì)胞間隙到達韌皮部，所以蚜蟲的路徑波為C波和pd波，而梨網(wǎng)蝽為細(xì)胞取食者只需刺破植物表皮就可取食植物細(xì)胞，所以其路徑波A波總時間很短，一般為1～5 s。蘋果綿蚜和繡線菊蚜取食波為E1與E2波(韌皮部取食波)和G波(木質(zhì)部吸食水分波)，而梨網(wǎng)蝽取食波為Gc波(口針在葉肉組織中的刺探和吸食波形)、E波木質(zhì)部取食波形。

植食性刺吸式昆蟲接觸寄主植物時，會首先對寄主植物的表面進行識別和判斷，確定是否符合刺探取食的要求(劉向東等,2004)。從本次試驗可以看出蘋果綿蚜第1次開始刺探的時間長于繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽，蘋果綿蚜需要更長的時間對寄主植物的表面物質(zhì)進行識別(表3)。有研究表明，植物表面的結(jié)構(gòu)、蠟質(zhì)和揮發(fā)物等能直接和間接地影響植食性昆蟲的取食行為(閻鳳鳴,2000;王美芳等,2009)。我們推測，因為蘋果綿蚜是取食蘋果枝條的刺吸式昆蟲，繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽為取食植物葉片的刺吸式昆蟲，葉片相對于主干更容易找到適宜取食位點，因此蘋果綿蚜第一次開始刺探的時間較長，要花費較長時間尋找適合的取食位點。

從np波總時間和刺探次數(shù)來看，蘋果綿蚜的指標(biāo)顯著小于繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽(表3)，蘋果綿蚜一旦確定適宜的刺吸位點就進行長期取食，很少移動更換取食位點，而繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽則經(jīng)常更換取食位點，這是可能是因為繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽刺吸葉片后，該區(qū)域的營養(yǎng)不支持繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽繼續(xù)取食，因此它們?yōu)榱双@得更好的營養(yǎng)，經(jīng)常轉(zhuǎn)移為害其他葉片，更換取食位點。與葉片相比，枝條被蘋果綿蚜刺吸為害后，其組織結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)來源比較穩(wěn)定，所以蘋果綿蚜一旦固定在枝條上刺吸為害后，就很少移動，更換取食位點。因此，我們推測寄主植物被取食部位的營養(yǎng)變動情況，是影響刺吸式昆蟲取食效率行為的一個重要因素。

蚜蟲角質(zhì)層柔嫩，易脫水死亡，所以對木質(zhì)部水分的吸收可能是恢復(fù)和維持蚜蟲水分平衡的一種常見和有效的方法。本研究發(fā)現(xiàn)蘋果綿蚜花費5%的時間在木質(zhì)部取食，而繡線菊蚜則花費8%的取食時間在木質(zhì)部(圖1)，說明繡線菊蚜相對于蘋果綿蚜更需要水分，這可能與蘋果綿蚜體表有較厚的蠟泌物覆蓋，減少水分散失有關(guān)。蚜蟲除了吸收水分外，還需要充足的營養(yǎng)物質(zhì)，它們在韌皮部取食會產(chǎn)生E1(分泌可溶性唾液)和E2波(被動取食汁液)這兩種波形。從本研究中兩種蚜蟲的韌皮部EPG指標(biāo)來看，除第1次出現(xiàn)E2波外，其他各指標(biāo)沒有顯著差異(表1)。但蘋果綿蚜的E2波占總時間比例(35%)比繡線菊蚜的E2波占總時間比例(25%)多(圖1)，說明蘋果綿蚜相對繡線菊蚜更需要營養(yǎng)。梨網(wǎng)蝽作為細(xì)胞取食者，其取食波為Gc波(植物細(xì)胞取食)和E波(韌皮部取食)，分別占取食行為總時間的36%和11%(圖1)。昆蟲攝取的營養(yǎng)除了需滿足自身正常的生長發(fā)育外，還需促使其產(chǎn)生正常的取食活動(殷萬東等,2013)，網(wǎng)蝽的體型和活動量均大于蚜蟲所以要用近一半的時間進行取食營養(yǎng)，以支持其取食活動。

3.2 取食行為與傳毒的關(guān)系

絕大多數(shù)的植物病毒依賴于媒介昆蟲進行傳播，而昆蟲取食行為則是病毒傳播的一個重要環(huán)節(jié)。刺吸式口器昆蟲占傳毒昆蟲的92%以上，僅蚜蟲傳播的植物病毒就有13個屬約316個種 (韋石泉,1991;Candiceetal.,2012)。蚜蟲口針一般通過短暫地刺吸表皮細(xì)胞來獲取病毒，最初的刺吸可獲取半持久性病毒。而蚜蟲的獲毒效率與pd波次數(shù)呈正相關(guān)(張鵬飛等,2001;王斌等,2003)。同時當(dāng)介體昆蟲獲毒后，介體昆蟲在植物上的滯留時間越短，就越有利于病毒的傳播(Palaciosetal.,2002;施艷等,2013)。繡線菊蚜可以傳播植物病毒，而未見蘋果綿蚜能傳播植物病毒的報道(李尉民和濮祖芹,1991;周彥等,2015)。通過蘋果綿蚜和繡線菊蚜的EPG指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)蘋果綿蚜的pd波次數(shù)和刺探次數(shù)也都顯著低于繡線菊蚜，說明蘋果綿蚜的口針刺穿植物細(xì)胞的頻率很低，同時又在同一刺吸位點滯留時間很長，很難使病毒相對快速地在植物體內(nèi)和種間傳播，這在某種程度上解釋了蘋果綿蚜未見傳播病毒的現(xiàn)象。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)蚜蟲類汁液取食者的波EPG波形和生物學(xué)意義基本一致，不會因其取食部位不同而改變。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)繡線菊蚜和梨網(wǎng)蝽這類葉片取食者會頻繁地更改取食位點，而蘋果綿蚜這種枝條取食者一旦確定取食位點就基本不會改變。因此，我們推測寄主植物被取食部位的營養(yǎng)變動情況，是影響刺吸式昆蟲取食效率行為的一個重要因素。本研究闡釋了蘋果園刺吸式口器害蟲的生態(tài)位分離機制以及取食行為學(xué)機制，為果園刺吸式口器害蟲的綜合治理提供了理論依據(jù)。