鄭 宏

(龍巖市新羅區(qū)森林病蟲害防治檢疫站,福建龍巖 364000)

羅漢松Podocarpusmacrophyllus和竹柏Podocarpusnagi四季常青、樹形優(yōu)美，國內(nèi)分布于秦嶺至長江下游以南至海南和臺灣(吳征鎰,2004)，尤其在福建、廣東、廣西、海南、臺灣等省區(qū)廣泛種植，是重要的園林綠化、庭院觀賞樹種，除了具有較高的美學(xué)觀賞價值外，還具有較高的醫(yī)學(xué)藥用價值(夏聰?shù)?2015;黃相玲等,2018)。

橙帶藍尺蛾Milioniabasalis又名黃帶枝尺蛾、羅漢松尺蛾、橙帶丹尺蛾，屬鱗翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)，目前發(fā)現(xiàn)其幼蟲只取食羅漢松和竹柏這兩種羅漢松科植物；其成蟲色彩艷麗，在白天活動，有人誤認為是蝴蝶(圖1)。據(jù)報道，該蟲曾在日本嚴重危害羅漢松(Kamata,2002)；國內(nèi)最早在2012年廣西博白林場發(fā)現(xiàn)嚴重危害竹柏(王緝健等,2014)，其后在海南、廣東和臺灣等地陸續(xù)有羅漢松上成災(zāi)的報道(余海濱等,2015;林偉等,2017)，肖斌等(2019)報道2017年在江西省大余縣也發(fā)現(xiàn)該蟲。嚴重發(fā)生時，每株蟲口密度高的達數(shù)百頭，食量驚人，可將植物的葉片取食殆盡。由于該蟲一年多代，世代重疊，部分植株因遭受連續(xù)危害而無法萌發(fā)新葉導(dǎo)致死亡。橙帶藍尺蛾近年在福建省也有零星發(fā)生，起初并未引起重視。2018年以來該蟲危害區(qū)域和危害程度迅速擴大，特別是在閩南(泉州、廈門、漳州)以及閩西龍巖新羅區(qū)發(fā)生嚴重，德化縣美湖鎮(zhèn)桂格村一株360余年、樹圍達6 m的“狀元樹”竹柏，葉片被取食后只剩光禿的枝干；2019年在福州、三明、南平等地也有數(shù)十株至數(shù)百株連片林木葉片被吃光的現(xiàn)象，同年8月在福州市晉安區(qū)壽山鄉(xiāng)林陽寺內(nèi)一株千年羅漢松，數(shù)天內(nèi)葉片被取食60%以上。

圖1 橙帶藍尺蛾成蟲及其幼蟲在竹柏上的危害狀Fig.1 Damage symptoms of Milionia basalis adults and larvae on Podocarpus nagiA:停息在羅漢松樹干上的成蟲Adult resting on the trunk of P.macrophyllus;B:幼蟲群集取食竹柏Larvae feeding in group on P.nagi.

目前，關(guān)于該蟲的防治技術(shù)研究很少，在發(fā)現(xiàn)蟲口密度較高時大多以噴灑觸殺性化學(xué)農(nóng)藥進行防治，雖可快速抑制蟲口，但是其負面效應(yīng)也明顯，尤其是羅漢松、竹柏基本上是園林綠化樹種，種植區(qū)域多是人員活動比較頻繁的地方，蟲害的發(fā)生和防治更易受到關(guān)切，顯然不宜過多使用化學(xué)農(nóng)藥。因此，探尋該蟲高效、環(huán)保的生物防治資源十分迫切。綠僵菌Metarhiziumspp.是應(yīng)用最為廣泛的蟲生真菌之一，因其具有致病力強、對人類和脊柱動物安全、對環(huán)境友好和易大量培養(yǎng)等優(yōu)點，在國內(nèi)外農(nóng)林害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用(蒲蟄龍和李增智,1996;周燚等,2006;Zimmermann,2007;何學(xué)友等,2011;潘春燕等,2016;楊華等,2018;Bogdányietal.,2019)，甚至作為生物殺蟲劑在巴西等國應(yīng)用于防治牛身上的蜱螨——微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus(Beys-da-Silvaetal.,2020)。福建省林業(yè)科學(xué)研究院的研究人員通過比較不同來源金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力，篩選出了一株優(yōu)良綠僵菌菌株MaFZ-13(何學(xué)友等,2020)。本研究在此基礎(chǔ)上，利用時間-劑量-死亡率模型(TDM)分析了綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾幼蟲的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)的互作，并進行了初步林間防治試驗，為今后開展綠僵菌防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試蟲

1.1.1菌株：供試菌株為金龜子綠僵菌M.anisopliaeMaFZ-13(以下簡稱綠僵菌MaFZ-13)，該菌株由福建省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護研究所研究人員分離、保存。

1.1.2試蟲來源及飼養(yǎng)：供試橙帶藍尺蛾為3齡幼蟲，采集于福建省尤溪縣羅漢松苗圃。幼蟲采集后置于大養(yǎng)蟲籠中，帶回實驗室以新鮮羅漢松枝葉飼養(yǎng)1 d后，挑選健康幼蟲分裝入昆蟲飼養(yǎng)盒中，每飼養(yǎng)盒放置15頭作為室內(nèi)生物測定試驗的1個重復(fù)。

1.2 生物測定

1.2.1孢子懸浮液配制：試驗前，將供試綠僵菌菌株斜面上孢子轉(zhuǎn)接到PDA平板(直徑9 cm)培養(yǎng)基上，置于25±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，待平板培養(yǎng)基上長滿墨綠色孢子后，即可收集孢子用于試驗接種。參考何學(xué)友等(2011)方法，收集平板培養(yǎng)基表面的孢子后用0.03%吐溫-80水溶液配制孢子懸浮液，依次配制成1.0×109,1.0×108,1.0×107,1.0×106和1.0×105孢子/mL 5個濃度的孢子懸浮液。

1.2.2人工接種和致病力測定：將上述1.1.2節(jié)試蟲進行接種試驗。每個濃度孢子懸浮液處理6個重復(fù)，即每個濃度處理90頭幼蟲；對照組用0.03%吐溫-80水溶液處理，4個重復(fù)，共60頭幼蟲。使用微量噴霧器將孢子懸浮液均勻噴在試蟲的體表，每重復(fù)噴菌液2 mL，處理完后，將試蟲置于吸水紙上置放20 s，以避免蟲體上太多液體易導(dǎo)致死亡。處理后將幼蟲重新置于干凈的養(yǎng)蟲盒，以新鮮的羅漢松枝葉飼養(yǎng)，每2 d更換一次。每天記錄不同處理的幼蟲存活情況。死亡后的幼蟲保濕處理，以便觀察是否為綠僵菌感染。接種測定在2019年5月下旬至6月上旬進行，室內(nèi)環(huán)境溫度為18～31℃。

1.3 林間防治試驗

1.3.1菌液配制：林間防治用綠僵菌孢子使用液固雙相發(fā)酵法生產(chǎn)(由福建省林業(yè)科學(xué)研究院森保所研究人員制作并提供)，制成的粗粉劑為5.0×109孢子/g，干燥后密封置于4℃冰箱保存。防治時用0.03%吐溫-80水溶液將菌粉配制成濃度為1.0×108孢子/mL孢子懸浮液，配制后用雙層紗布過濾，使用背負式電動噴霧器進行林間噴霧。菌液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2林間施菌：試驗地在龍巖市新羅區(qū)紅坊鎮(zhèn)船巷村竹柏苗圃，位于山腳東坡，竹柏高2～5 m，蟲口密度40～156頭/株。2019年7月13日16∶00時以后噴菌1次，菌液在苗圃的植株上全面噴施，以噴濕全部葉片(微微滴水)為準。噴施后，選取葉片受害率在30%～50%之間，間距在8～10 m的5株竹柏作為調(diào)查樣株，每樣株上選取樹冠中部合適的3根枝條進行套籠，套籠為長100 cm，直徑60 cm的尼龍紗籠，每籠中有15～20頭幼蟲，施菌后每天觀察橙帶藍尺蛾幼蟲的活力及取食情況，在3,6和9 d調(diào)查幼蟲死亡率。對照為距離施菌圃地30～40 m遠沒有施菌的竹柏，噴灑0.03%吐溫-80的清水，設(shè)置4個套籠60頭幼蟲。

1.4 數(shù)據(jù)分析

時間-劑量-死亡率(time-dose-mortality,TDM)模型分析試驗數(shù)據(jù)在DPS數(shù)據(jù)處理軟件(v7.05版本)進行分析處理，使用軟件自帶的模型對生測數(shù)據(jù)進行模擬，得到綠僵菌對橙帶藍尺蛾幼蟲致病力的TDM模型參數(shù)估計，進而分析時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)(馮明光,1998;唐啟義和馮明光,2002)。

林間防治試驗防治效果計算方法見下式：

防治效果(%)=

2 結(jié)果

2.1 接種孢子懸浮液后幼蟲累計死亡率變化

橙帶藍尺蛾幼蟲接種綠僵菌MaFZ-13不同濃度孢子懸浮液后，累計死亡率情況見圖2。累計死亡率隨時間增大，孢懸液濃度越大，幼蟲的死亡速度越快。接種1.0×109孢子/mL孢子懸浮液6 d后，幼蟲死亡率超過80%；8 d時達到100%；接種1.0×108孢子/mL孢子懸浮液7 d時，幼蟲死亡率超過80%，10 d時死亡率達到100%。接種1.0×107孢子/mL孢子懸浮液時，幼蟲死亡速度略慢一些，死亡高峰出現(xiàn)在3-8 d，接種9 d后，死亡達到80%；接種15 d后，幼蟲死亡率為95.6%。接種1.0×106和1.0×105孢子/mL兩個濃度的孢子懸浮液時，幼蟲死亡速度相對較慢，接種后15 d，累計死亡率分別為82.7%和71.1%。處理組蟲尸經(jīng)保濕培養(yǎng)后，大部分表現(xiàn)出綠僵菌感染的情況，體表先長出白色菌絲，隨后產(chǎn)生大量墨綠色孢子(圖3)。

圖2 橙帶藍尺蛾幼蟲接種不同濃度綠僵菌MaFZ-13菌株孢子懸浮液后的累計死亡率Fig.2 Cumulative mortality of Milionia basalis larvae inoculated with different concentrations of spore suspension of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13

圖3 橙帶藍尺蛾幼蟲被綠僵菌感染狀Fig.3 Symptoms of Milionia basalis larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.2 時間-劑量-死亡率模型分析

表1 綠僵菌MaFZ-13菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的時間-劑量-死亡率(TDM)模型模擬與參數(shù)估計Table 1 Parameters estimated from modeling of the time-dose-mortality (TDM) by bioassay of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 against Milionia basalis larvae

各處理濃度與時間效應(yīng)參數(shù)的t測驗值均達到極顯著水平(P<0.01)，說明綠僵菌MaFZ-13菌株劑量效應(yīng)與時間效應(yīng)極顯著。該菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的劑量效應(yīng)參數(shù)β為0.4483，時間效應(yīng)參數(shù)在橙帶藍尺蛾幼蟲接種后第7天 (γ7) 達到最大，表明該時間段幼蟲死亡數(shù)較多。

2.3 綠僵菌MaFZ-13對幼蟲的劑量和時間效應(yīng)

綠僵菌MaFZ-13菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲死亡率的TDM模型估計的劑量效應(yīng)見圖4，隨著接種時間的延長，LC50和LC90值逐漸下降，綠僵菌接種橙帶藍尺蛾幼蟲后4,5,6和7 d的半致死劑量(LC50)對數(shù)值分別為7.99,7.12,6.46和5.83。接種后3 d以內(nèi)幼蟲死亡率較小，所以LC50和LC90估計值偏大。

圖4 綠僵菌MaFZ-13菌株接種橙帶藍尺蛾幼蟲后各時段LC50和LC90的對數(shù)值Fig.4 Logarithms of the time-dependent LC50and LC90 values for Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 against Milionia basalis larvae

綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾致病力的時間效應(yīng)見表2。致死時間(LT50和LT90)隨著孢懸液濃度的增加而遞減(表2)，1.0×107,1.0×108和1.0×109孢子/mL孢子懸浮液引起的LT50值分別為5.19,3.99和2.81 d，對應(yīng)的LT90值分別為10.89,8.07和6.26 d。1.0×105和1.0×106孢子/mL兩個濃度孢子懸浮液接種后幼蟲死亡率未達到90%，無法估計出LT90的值。

表2 不同濃度綠僵菌MaFZ-13菌株孢子懸浮液對橙帶藍尺蛾幼蟲的LT50和LT90值Table 2 The LT50and LT90 values for different concentrations of spore suspension of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 against Milionia basalis larvae

2.4 綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾的林間防治效果

用1.0×108孢子/mL孢子懸浮液在林間噴霧防治結(jié)果見圖5。根據(jù)林間套籠觀察，幼蟲死亡率隨時間增高；噴菌后3 d，雖幼蟲死亡率不高，但大部分幼蟲活力下降，取食量減少，危害性降低；噴菌后6 d死亡率為65.4%，防治效果為64.03%；噴菌后9 d幼蟲死亡率可達到85.8%，防治效果為85.05%。

圖5 1.0×108孢子/mL綠僵菌MaFZ-13菌株孢子懸浮液對橙帶藍尺蛾幼蟲的林間防治效果Fig.5 Control efficacy of spore suspension of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 at the concentration of 1.0×108 conidia/mL against Milionia basalis larvae in the field

3 討論

橙帶藍尺蛾是近年來危害羅漢松和竹柏的一種新害蟲，其危害呈現(xiàn)明顯的暴發(fā)性特點，在局部區(qū)域造成了嚴重的損失(王緝健等,2014;余海濱等,2015;林偉等,2017;肖斌等,2019)。目前關(guān)于該蟲的發(fā)生規(guī)律尚沒有系統(tǒng)的研究報道。由于幼蟲在取食過程中可將寄主植物含有的羅漢松內(nèi)酯A糖苷(inumakilactone A glucoside)、竹柏內(nèi)酯(nagilactone)等有毒成份轉(zhuǎn)移入體內(nèi)，使鳥類避食(Yasui,2001)，據(jù)林農(nóng)反映，捉其幼蟲飼喂家禽，罕見取食；其成蟲、幼蟲顏色和斑紋醒目，具有明顯的警戒色；該蟲的天敵少見，我們在調(diào)查與飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)幼蟲被球孢白僵菌Beauveriabassiana、蛹期有棒束孢(擬青霉)寄生外，其他天敵較少。這些也可能是造成暴發(fā)成災(zāi)的原因之一。因此，篩選對致病力強的優(yōu)良綠僵菌菌株，為防治該蟲提供高效的生物防治資源十分必要。

研究結(jié)果顯示接種綠僵菌MaFZ-13后，橙帶藍尺蛾幼蟲的累計死亡率隨時間增大，孢懸液濃度越大，幼蟲的死亡速度越快(圖2)。時間-劑量-死亡率(TDM)模型分析結(jié)果表明綠僵菌對其致死過程中的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)存在顯著的互作關(guān)系(表1)，當孢子濃度為1.0×108孢子/mL時，致死中時(LT50)值為3.99 d(表2)，可見綠僵菌MaFZ-13是一株對其幼蟲具有較強致病力的菌株，具有較好的應(yīng)用潛力。林間防治試驗結(jié)果(圖5)顯示，1.0×108孢子/mL孢子懸浮液噴菌9 d后防治效果可達85%，研究結(jié)果為利用該菌株進行防治提供了依據(jù)。從節(jié)約成本考慮，林間防治推薦使用1.0×107～1.0×108孢子/mL是較理想的施菌濃度。同時，要加強該蟲發(fā)生的預(yù)測預(yù)報工作，目前生產(chǎn)上防治明顯滯后，如果能在其低齡幼蟲期防治，易取得較好的效果，達到事半功倍的目的。另外，由于該蟲在地面枯枝落葉或淺層土壤中化蛹，可以考慮在地面噴撒粉劑，操作更為簡便。羅漢松、竹柏等大多是園林綠化樹種，野外環(huán)境復(fù)雜多樣，合適的施用劑型和最佳的施菌時間需要進一步研究。

任何殺蟲劑生物活性的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)之間是互作的，TDM模型可以將時間和劑量(濃度)效應(yīng)統(tǒng)一到一個模型(Nowierskietal.,1996;王聯(lián)德等,2003;Qiuetal.,2013;王定峰等,2013)，避免了機率分析中時間效應(yīng)和劑量(濃度)效應(yīng)相互排斥的問題，能充分利用生物測定的數(shù)據(jù)信息，在評價真菌殺蟲劑的致病性方面具有較好的應(yīng)用價值，應(yīng)用該模型來分析評價菌株的生防潛力更加全面可靠。

致謝研究工作中，福建省林業(yè)科學(xué)研究院何學(xué)友教授級高級工程師、蔡守平高級工程師、宋海天博士等給予大力支持，在此表示衷心感謝！