鞏雪芳,謝壽安,楊 平,郭 莉,陳 迪,車顯榮,王延來,呂淑杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西楊陵 712100)

花椒窄吉丁Agriluszanthoxylumi屬鞘翅目(Coleoptera)吉丁科(Buprestidae)窄吉丁屬Agrilus，是我國(guó)花椒林中最主要的毀滅性蛀干害蟲(吳海,2006;權(quán)麗君,2016)。1987年在陜西省韓城市椒園首次發(fā)現(xiàn)花椒窄吉丁是致使花椒大量死亡的主要原因(薛耀宗,1989)。目前，主要分布于陜西、甘肅、山東、山西等地(黨國(guó)剛等,2017)。幼蟲主要蛀食枝干形成層，引起樹勢(shì)衰弱，產(chǎn)量品質(zhì)下降(李輝,2013)，主要危害特征是受害部位蟲疤松軟濕潤(rùn)，有無色或淡褐色液體滲出，俗稱“流油”(焦浩,2011)。成蟲取食葉片補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，造成葉片的缺刻、空洞，樹皮流膠、軟化、腐爛、干枯、龜裂最后脫落至整株死亡(杜平,2012;王燕等,2012)?；ń氛〉难芯恐饕杏谙x情調(diào)查、種群動(dòng)態(tài)、發(fā)生規(guī)律(李孟樓等,1990)及其化學(xué)防治(康克功等,2007)等方面。近年來，在花椒窄吉丁與寄主植物互作的分子機(jī)制方面，對(duì)寄主揮發(fā)物、后腸與糞便提取物對(duì)其引誘和驅(qū)避作用進(jìn)行了初步研究(袁麗芳等,2016;劉綏鵬等,2017)；對(duì)花椒窄吉丁雌、雄成蟲觸角差異表達(dá)基因的進(jìn)行了篩選(鞏雪芳等,2019)；對(duì)氣味結(jié)合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表達(dá)及組織表達(dá)譜分析也進(jìn)行了初探(鞏雪芳等,2020)，但是對(duì)其作用的分子靶標(biāo)尚不清楚。

觸角是昆蟲感受外界信號(hào)的主要器官，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了能夠感知各種化學(xué)信息物的高度靈敏且特異的嗅覺感受系統(tǒng)(王桂榮等,2002;修偉明等,2005;游靈等,2012;Britoetal.,2016)，在定位寄主、尋求配偶、覓食或產(chǎn)卵等種群生存及繁衍過程中均發(fā)揮重要作用(Zhangetal.,2015)。嗅覺識(shí)別過程需要多種蛋白的參與，主要有氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(odorant receptors,ORs)、離子型受體(ionotropic receptors,IRs)、感受神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)、氣味降解酶(odorant-degrading enzymes,ODEs)等(詹文會(huì),2018)。昆蟲感受器淋巴液內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩類作為環(huán)境信息分子結(jié)合載體的水溶性蛋白，即氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白(Angelietal.,1999;Yangetal.,2011)。

花椒窄吉丁是如何感知寄主氣味物質(zhì)并準(zhǔn)確定位到唯一的寄主植物，在尋找寄主過程中嗅覺是如何發(fā)揮作用的？深入研究花椒窄吉丁嗅覺系統(tǒng)有助于闡明其定位寄主及尋找配偶時(shí)識(shí)別信息物質(zhì)及其化學(xué)通訊與感受機(jī)制，而獲得大量嗅覺相關(guān)基因是進(jìn)行分子機(jī)制研究的前提。為此，本研究借助高通量測(cè)序?qū)ń氛〕上x觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得了參與嗅覺感受的一些重要化學(xué)感受基因OBP,CSP,OR,IR和SNMP家族基因，為今后花椒窄吉丁嗅覺感受蛋白的作用機(jī)制提供理論支撐，對(duì)開展害蟲行為調(diào)控劑的篩選及綠色防控技術(shù)研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

2018年5-7月于陜西省藍(lán)田縣普化鎮(zhèn)花椒園采集花椒窄吉丁成蟲后帶回實(shí)驗(yàn)室于25℃下飼養(yǎng)。選取1 000頭活動(dòng)能力較強(qiáng)的成蟲，用滅菌三蒸水沖洗蟲體表面，70%的酒精表面消毒30 s，滅菌三蒸水沖洗蟲體2次后解剖鏡下于冰上迅速切下觸角雌雄分開收集，液氮冷凍保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 雌雄成蟲觸角總RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)

采用Trizol法分別提取花椒窄吉丁雌、雄成蟲觸角總RNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和凱奧K5500分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度(OD260/OD280比值)，安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit檢測(cè)完整性和濃度，質(zhì)量合格的RNA樣品保存于-80℃?zhèn)溆没蛘吡⒓催M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

1.2節(jié)樣品RNA質(zhì)量及純度經(jīng)檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入片段緩沖液到mRNA中使其片段化成為短片段，以片段后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA PolymeraseⅠ繼續(xù)合成cDNA第2鏈，采用QIA Quick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。對(duì)洗脫純化后得到的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭處理，回收目的大小片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在獲得clean reads后需采用Trinity軟件對(duì)clean reads拼接和組裝，獲取分析所需的參考序列。轉(zhuǎn)錄本具有可變剪接的特點(diǎn)，組裝出全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)過濾，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean data)，在所有的轉(zhuǎn)錄本中，取最長(zhǎng)的contigs作為unigenes。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序中，Q20值是指測(cè)序時(shí)堿基識(shí)別過程中，對(duì)所識(shí)別的堿基給出的錯(cuò)誤概率，錯(cuò)誤識(shí)別概率是1%，正確率99%；質(zhì)量值Q30，錯(cuò)誤識(shí)別概率0.1%，正確率99.9%；N50即覆蓋50%核苷酸的最大unigene長(zhǎng)度或最大序列重疊群長(zhǎng)度。unigenes序列與NR,NT,Swiss-Prot,GO,KEGG,BLASTX,eggNOG,Pfam,TmHMM,SignalP,KO,Map,BLASTP和RNAMMER公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)獲得的所有unigenes進(jìn)行功能注釋及結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

1.5 嗅覺相關(guān)基因的鑒定與序列分析

BLAST同源搜索從觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定OBPs,CSPs,Ors,IRs和SNMPs嗅覺相關(guān)基因。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蘋果小吉丁A.mali和白蠟窄吉丁A.planipennis等其他鞘翅目昆蟲的嗅覺相關(guān)基因核酸序列，采用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA軟件鄰接法(neighbour-joining method,NJ method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)結(jié)果進(jìn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證。

1.6 嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)分析

衡量基因表達(dá)量時(shí)，單純以map到的read數(shù)計(jì)算基因的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)上是不合理的。本研究利用每百萬(wàn)條reads中來自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)(reads per kilobase per million mapped reads,RPKM)(Mortazavietal.,2008)，對(duì)嗅覺相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果及從頭組裝

花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SUB6796283)經(jīng)過濾后分別獲得43 124 393和45 854 648條clean read，組裝得到36 209條基因和90 982條轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本和基因的N50分別為2 523和2 103 bp (圖1)。樣品clean data均達(dá)到96%以上，Q20均為100%，Q30均不少于92%，組裝完整性較高(表1)。

圖1 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組unigenes長(zhǎng)度分布Fig.1 Length distribution of unigenes in the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi

表1 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Summary of assembly for the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi

2.2 基因功能注釋

使用BLAST軟件將獲得的花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組unigenes 序列與NR,Swiss-Prot，GO,BLASTX和BLASTP等公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)(表2)，并對(duì)注釋結(jié)果做比較韋恩圖(圖2)，共有36 209條unigenes得到注釋，其中包括29 927條(54.21%)雌成蟲觸角的和26 706條(50.78%)雄成蟲觸角的。NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的unigene最多(15 070條,41.62%)，同時(shí)注釋到NT,NR,BLASTX和BLASTP四大數(shù)據(jù)庫(kù)的有2 682條。同源蛋白的物種來源分析結(jié)果表明，與赤擬谷盜的相似基因最多(19%)(圖3)。

表2 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of gene function annotation in the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi

圖2 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋結(jié)果韋恩圖Fig.2 Venn diagram of gene annotation results of the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi

圖3 NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角unigenes的物種分布Fig.3 Species distribution of unigenes in the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi annotated in the NR database

2.3 GO功能分類

GO功能分類統(tǒng)計(jì)(圖4)表明，比對(duì)到11 614條unigenes，分為細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)與生物學(xué)進(jìn)程(biological process)三大類共57個(gè)分支。其中，生物學(xué)進(jìn)程大類中參與細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)基因最多(72.55%)，其次是代謝進(jìn)程(metabolic process)(58.15%)、生物學(xué)調(diào)控(biological regulation)(42.91%)，其余均在40%以下；細(xì)胞組分大類中細(xì)胞部分(cell part)基因最多(78.54%)，其次是細(xì)胞器(organelle)(49.19%)、細(xì)胞器部分(organelle part)(40.69%)、膜(membrane)(30.48%)與膜部分(membrane part)(27.00%)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex)(26.47%)，其余均低于10%；分子功能大類中結(jié)合(binding)(70.57%)與催化活性(catalytic activity)(45.51%)的基因最多，其余均在10%以下。

圖4 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角unigenes的GO分類Fig.4 GO classification of unigenes of female and male antennae of Agrilus zanthoxylumi

2.4 KEGG代謝通路分析

通過整合數(shù)據(jù)庫(kù)，分析unigenes可能參與或涉及的代謝途徑的注釋結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)有7 427條unigenes參與了5類代謝通路：細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)，環(huán)境信息處理(environmental information processing)，遺傳信息處理(genetic information processing)，新陳代謝(metabolism)和有機(jī)系統(tǒng)(organismal system)。其中unigenes注釋最多的代謝通路為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)(815條)，翻譯(translation)(586條)，內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system)(466條)，運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)(440條)，折疊、分揀和降解(folding,sorting and degradation)(417條),碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)(397條)。

圖5 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角unigenes的KEGG代謝通路Fig.5 KEGG metabolic pathways of the antennal unigenes of female and male adults of Agrilus zanthoxylumiA:細(xì)胞進(jìn)程Cellular process;B:遺傳信息處理Genetic information processing;C:環(huán)境信息處理Environmental information processing;D:新陳代謝Metabolism;E:有機(jī)體系統(tǒng)Organismal system.

2.5 嗅覺相關(guān)基因的篩選及進(jìn)化分析

初步鑒定到7個(gè)OBP基因(AzanOBP1-7)，其中只有5個(gè)OBP基因具有全長(zhǎng)開放閱讀框，AzanOBP1,AzanOBP2,AzanOBP3,AzanOBP4和AzanOBP5具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，符合氣味結(jié)合蛋白的特征(Cys-X15-39-Cys-X3-Cys-X21-44-Cys-X7-12-Cys-X8-Cys，X代表任意一種氨基酸)，為典型的OBP。5個(gè)具有全長(zhǎng)開放閱讀框的CSP基因(AzanCSP1-5)，3個(gè)OR基因(AzanOR1-3)，5個(gè)IR基因(AzanIR1-5)和5個(gè)SNMP基因(AzanSNMP1-5)?；贏zanOBP和AzanCSP基因以及其他類群昆蟲OBP和CSP基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)花椒窄吉丁的7個(gè)OBP基因分支聚類較為分散(圖6)，但都至少與一個(gè)鞘翅目昆蟲的OBP同源基因聚類在一支，且序列一致性很高。AzanOBP1和AzanOBP3的序列一致性較高，且分別與白蠟窄吉丁AgrilusplanipennisAplaGOBP83a (GenBank登錄號(hào):XM_025974145.1)和蘋果小吉丁AgrilusmaliAmalOBP2 (GenBank登錄號(hào):MF615491.1)聚到一支；AzanOBP2和AzanOBP4均與蘋果小吉丁的AmalOBP3 (GenBank登錄號(hào):MF615492.1)親緣關(guān)系近，三者聚到同一支。

圖6 應(yīng)用鄰接法基于核苷酸序列構(gòu)建的花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組中7個(gè)AzanOBP基因與其他鞘翅目昆蟲OBP基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig.6 Phylogenetic tree of seven AzanOBP genes in the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi and OBP genes from other coleopteran insect species based on nucleotide sequences by using neighbor-joining method (1 000 replicates)基因來源物種Origin species of genes:AzanOBP:花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi;AmalOBP:蘋果小吉丁Agrilus mali;AplaOBP:白蠟窄吉丁Agrilus planipennis;DhelOBP:花絨寄甲Dastarcus helophoroides;HparOBP:暗黑鰓金龜Holotrichia parallela;PaenOBP:榆綠毛螢葉甲Pyrrhalta aenescens;PmacOBP:榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta maculicollis;AcorOBP:銅綠麗金龜Anomala corpulenta;AchiOBP:星天牛Anoplophora chinensis;AglaOBP:光肩星天牛Anoplophora glabripennis;MaltOBP:松墨天牛Monochamus alternatus;TcasOBP:赤擬谷盜Tribolium castaneum;RdomOBP:谷蠹Rhyzopertha dominica;DarmOBP:華山松大小蠹Dendroctonus armandi.

花椒窄吉丁5個(gè)CSP基因聚類較為集中(圖7)；AzanCSP1,AzanCSP2和AzanCSP3聚集到同一分支，5個(gè)CSP基因均與蘋果小吉丁的AmalCSP親緣關(guān)系最近。對(duì)于鞘翅目其他不同種的昆蟲的CSP基因，也出現(xiàn)一定的聚類關(guān)系分別在進(jìn)化樹中形成多個(gè)獨(dú)立的小分支；同一種昆蟲的不同CSP基因聚類關(guān)系較分散也形成了多個(gè)獨(dú)立的小分支。

圖7 應(yīng)用鄰接法基于核苷酸序列構(gòu)建的花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組中5個(gè)AzanCSP基因與其他鞘翅目昆蟲CSP基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig.7 Phylogenetic tree of five AzanCSP genes in the antennal transcriptome of female and male adults of Agrilus zanthoxylumi and CSP genes from other coleopteran insect species based on nucleotide sequences by using neighbor-joining method (1 000 replicates)CSP基因來源物種Origin species of CSP genes:AzanCSP:花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi;AmalCSP:蘋果小吉丁Agrilus mali;AplaCSP:白蠟窄吉丁Agrilus planipennis;TmolCSP:黃粉蟲Tenebrio molitor；AchiOBP:星天牛Anoplophora chinensis;TcasCSP:赤擬谷盜Tribolium castaneum;RdomCSP:谷蠹Rhyzopertha dominica;DarmCSP:華山松大小蠹 Dendroctonus armandi；DponCSP:中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae;PmacCSP:榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta maculicollis;PaenCSP:榆藍(lán)葉甲Pyrrhalta aenescens；AglaCSP:光肩星天牛Anoplophora glabripennis;CbowCSP:大猿葉甲Colaphellus bowringi;MaltCSP:松墨天牛Monochamus alternatus;GdauCSP:沙蔥螢葉甲Galeruca daurica;HparCSP:暗黑鰓金龜Holotrichia parallela;AcorCSP:銅綠麗金龜Anomala corpulenta;AgraCSP:棉鈴象甲Anthonomus grandis;DhelCSP:花絨寄甲Dastarcus helophoroides.

2.6 嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)量

利用RPKM值評(píng)估不同嗅覺相關(guān)基因在雌雄成蟲觸角中的表達(dá)量，結(jié)果表明(圖8)，AzanOBP1和AzanOBP2在雌成蟲觸角中不表達(dá)，在雄成蟲觸角中微量表達(dá)；AzanOBP3在雄成蟲觸角中高豐度表達(dá)(RPKM>1 000)，在雌成蟲觸角中中量表達(dá)。AzanOBP4在雄成蟲觸角中中量表達(dá)(RPKM>400)，AzanOBP基因在雄成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanOBP3 (RPKM=1 160.57)>AzanOBP4(RPKM=244.93)>AzanOBP6 (RPKM=145.09)>AzanOBP7(RPKM=44.78)>AzanOBP5(RPKM=42.36)>AzanOBP1(RPKM=2.30)和AzanOBP2(RPKM=1.79)，在雌成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanOBP3(RPKM=205.25)>AzanOBP6(RPKM=42.94)>AzanOBP4(RPKM=39.69)>AzanOBP7(RPKM=30.66)>AzanOBP5(RPKM=14.04)>AzanOBP1(RPKM=0)和AzanOBP2(RPKM=0)(圖8:A)。除AzanCSP1(RPKM>200)在雄成蟲觸角中中量表達(dá)外，其他AzanCSP基因在雌雄成蟲觸角中表達(dá)量均較低(RPKM<200);AzanCSP2在雌成蟲觸角中不表達(dá)(RPKM=0)，在雄成蟲觸角中微量表達(dá)(RPKM=3.064);AzanCSP基因在雄成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanCSP1(RPKM=302.16>AzanCSP5(RPKM=64.58)>AzanCSP4(RPKM=32.07)>AzanCSP3(RPKM=8.64)>AzanCSP2(RPKM=3.06)，AzanCSP基因在雌成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)椋篈zanCSP1(RPKM=207.85)>AzanCSP5(RPKM=79.65)>AzanCSP4(RPKM=27.21)>AzanCSP3(RPKM=4.24)>AzanCSP2(RPKM=0)(圖8:B)。氣味受體基因AzanOR基因在雌成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanOR1(RPKM=3.89)>AzanOR2(RPKM=0.28)>AzanOR3(RPKM=0.18)，AzanOR基因在雄成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)椋篈zanOR1(RPKM=18.13)>AzanOR3(RPKM=2.81)>AzanOR2(RPKM=1.33)(圖8:C)。離子型受體基因AzanIR基因在雌成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanIR4(RPKM=2.86)>AzanIR2(RPKM=1.89)>AzanIR3(RPKM=1.73)>AzanIR1(RPKM=0.95)>AzanIR5(RPKM=0.14)，在雄成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanIR2(RPKM=6.08)>AzanIR4(RPKM=4.21)>AzanIR1(RPKM=3.70)>AzanIR3(RPKM=2.08)>AzanIR5(RPKM=0.48)(圖8:D)。神經(jīng)元感受膜蛋白基因AzanSNMP5在雌成蟲觸角中不表達(dá)(RPKM=0)，在雄成蟲觸角中微量表達(dá)(RPKM=0.24)，AzanSNMP基因在雌成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanSNMP2(RPKM=19.90)>AzanSNMP1(RPKM=0.42)>AzanSNMP3(RPKM=0.05)>AzanSNMP4(RPKM=0.02)>AzanSNMP5(RPKM=0)，在雄成蟲觸角中的表達(dá)量排序?yàn)?AzanSNMP2(RPKM=105.17)>AzanSNMP4(RPKM=0.46)>AzanSNMP1(RPKM=0.32)>AzanSNMP5(RPKM=0.24)>AzanSNMP3(RPKM=0.06)(圖8:E)。

圖8 花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組中嗅覺相關(guān)基因的RPKM值Fig.8 RPKM values of olfaction-related genes in the antenna of female and male adults of Agrilus zanthoxylumiA:AzanOBP;B:AzanCSP;C:AzanOR;D:AzanIR;E:AzanSNMP.AnF:雌成蟲觸角Antenna of female adult;AnM:雄成蟲觸角Antenna of male adult.

3 討論與結(jié)論

嗅覺相關(guān)基因的鑒定可為基于反向化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究提供潛在分子靶標(biāo)(Zhuetal.,2017)，利用昆蟲行為調(diào)節(jié)劑和分子干擾技術(shù)調(diào)控昆蟲個(gè)體間、昆蟲與寄主間的化學(xué)通訊來防控害蟲是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)(楊海博等,2018)。RNA-Seq技術(shù)已成為轉(zhuǎn)錄組研究的重要手段，成功運(yùn)用于非模式昆蟲功能基因挖掘(鄭海霞等,2018)，為深入研究昆蟲嗅覺相關(guān)基因功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究對(duì)花椒窄吉丁雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共獲得90 982條轉(zhuǎn)錄本。GO功能分類表明，分子功能分類中參與結(jié)合的基因占比最多(70.57%)，猜測(cè)花椒窄吉丁成蟲觸角中存在大量結(jié)合化學(xué)信息物質(zhì)的蛋白。仍有59%的unigenes未被注釋到公共數(shù)據(jù)庫(kù)，這些序列可能是一些非編碼序列或者新發(fā)現(xiàn)的基因序列，也可能是因?yàn)槟承﹗nigene長(zhǎng)度過短并未能與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有基因序列比對(duì)到，此外，也與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的鞘翅目昆蟲吉丁科的參考序列的數(shù)量不夠豐富有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)僅在花椒窄吉丁觸角中存在的氣味結(jié)合蛋白基因，這些特異表達(dá)的基因可能與花椒窄吉丁物種生境中所特有的化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，與它的強(qiáng)隱蔽性和對(duì)寄主專一性也緊密關(guān)聯(lián)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)花椒窄吉丁成蟲觸角的unigenes可能參與或涉及的代謝途徑的注釋結(jié)果分析表明，花椒窄吉丁信號(hào)感受與傳遞的主要場(chǎng)所是觸角。前期我們已經(jīng)對(duì)雌雄成蟲觸角中這些靶標(biāo)基因的表達(dá)差異進(jìn)行了初步探討(鞏雪芳等,2019)。本研究中AzanOBP3在觸角中高豐度表達(dá)(圖8:A)，與前期的研究結(jié)果(鞏雪芳等,2020)不一致，主要是因?yàn)楸狙芯繉?duì)象是花椒窄吉丁觸角(不包含頭部)，而前期目的基因(AzanOBP3)在觸角中的表達(dá)研究中的研究對(duì)象是花椒窄吉丁頭部(包含觸角)，且根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)AzanOBP3與鞘翅目昆蟲的性信息素結(jié)合蛋白聚類到同一分支，初步猜測(cè)并推斷其很可能是與花椒窄吉丁性信息素相關(guān)的氣味結(jié)合蛋白(鞏雪芳等,2020)，所以在雌雄成蟲觸角中的表達(dá)量差異是顯著的，在雌雄成蟲頭部的表達(dá)量差異是不顯著的。

篩選到7個(gè)候選OBP基因，相比于其他鞘翅目昆蟲的觸角轉(zhuǎn)錄組研究，本研究所獲得的嗅覺基因數(shù)量較偏少，除了受NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nih.gov/)中參考序列的數(shù)量的影響外，還可能是因?yàn)榛瘜W(xué)感受基因中的氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白兩個(gè)家族進(jìn)化速率較高，這些基因進(jìn)化很可能與識(shí)別特定植物化合物有關(guān)，本研究中的研究對(duì)象花椒窄吉丁為單食性昆蟲，目前發(fā)現(xiàn)寄主植物只有花椒一種，這可能造成其OBP和CSP基因不如其他昆蟲的數(shù)量多。發(fā)現(xiàn)花椒窄吉丁OBP并非都是典型的OBP(含有6個(gè)保守的半胱氨酸)(鞏雪芳等,2019)，這7個(gè)OBP基因中，只有5個(gè)OBP基因具有全長(zhǎng)開放閱讀框；AzanOBP1,AzanOBP2,AzanOBP3,AzanOBP4和AzanOBP5的編碼蛋白具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，符合氣味結(jié)合蛋白的特征(Cys-X15-39-Cys-X3-Cys-X21-44-Cys-X7-12-Cys-X8-Cys，X代表任意一種氨基酸)，為典型的OBP；AzanOBP6的編碼蛋白序列中總共有10個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，是非典型的氣味結(jié)合蛋白(atypical OBPs)；AzanOBP7的編碼蛋白具有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，初步鑒定為DimerOBP類。

利用RPKM值對(duì)基因表達(dá)量的評(píng)估結(jié)果表明(圖8)，AzanOBP1和AzanOBP2在雌成蟲觸角中不表達(dá)(RPKM=0)，在雄成蟲觸角中微量表達(dá)；AzanOBP3在雄成蟲觸角中高豐度表達(dá)(RPKM>1 000)，在雌成蟲觸角中中量表達(dá)(RPKM=205.25)，推測(cè)其在觸角中高豐度表達(dá)的OBPs功能與雄成蟲識(shí)別同類異性釋放的信息素或寄主植物釋放的揮發(fā)物有關(guān)。

本研究首次構(gòu)建了花椒蛀干害蟲花椒窄吉丁的雌雄成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并成功篩選得到了部分嗅覺相關(guān)基因，為將來利用嗅覺靶標(biāo)無公害防治農(nóng)林害蟲提供了重要分子信息；基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)把從已經(jīng)完整測(cè)序的花椒窄吉丁觸角轉(zhuǎn)錄組中得到的基因目錄與更高級(jí)別的細(xì)胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關(guān)聯(lián)起來。研究結(jié)果為鞘翅目其他近緣物種昆蟲的觸角轉(zhuǎn)錄組的研究提供了豐富的轉(zhuǎn)錄本基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息，對(duì)鞘翅目吉丁科非模式昆蟲的研究有重要的推動(dòng)意義。