姜笑維,關(guān)丹陽(yáng),李清亞,劉 曉,Hongmei LI-BYARLAY,賀秉軍,*

(1.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071; 2.Central State University,Wilberforce,OH 45384,USA)

腸道是生物體中最大、最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，被認(rèn)為是生物的“微生物器官”(Possemiersetal.,2011;Byndloss and B?umler,2018)。昆蟲腸道內(nèi)棲息著大量微生物，它們與宿主相互影響，協(xié)同進(jìn)化，形成了復(fù)雜而動(dòng)態(tài)平衡的微生物區(qū)系(Dillon and Chamley,2002;王四寶和曲爽,2017)。腸道微生物及其代謝產(chǎn)物參與宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)，同時(shí)能夠降低宿主被病原微生物感染的機(jī)率(Dillon and Chamley,2002;Lietal.,2016)。有研究表明一些昆蟲腸道中的Gilliamella、乳酸桿菌Lactobacillus和雙歧桿菌Bifidobacterium參與合成果膠降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶等，從而幫助宿主消化吸收食物中的營(yíng)養(yǎng)成分(Engel and Moran,2012)，而腸道菌群紊亂則會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)失調(diào)、腸屏障破壞、對(duì)病原體的清除率降低，以及存活能力下降等病態(tài)現(xiàn)象(Round and Mazmanian,2009;徐興偉等,2017)。Cox-Forster等(2007)利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，感染蜂群衰竭失調(diào)病癥(colony collapse disorder,CCD)與未感染CCD蜂群的腸道優(yōu)勢(shì)菌群存在差異。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與宿主抗藥性相關(guān)，如腸球菌能介導(dǎo)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella對(duì)毒死蜱的抗性，沙門菌可以降低小菜蛾對(duì)毒死蜱的抗性(Xiaetal.,2018)；椿象共生菌可介導(dǎo)宿主對(duì)殺螟松的抗性(Kikuchietal.,2012)。腸道菌群的結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度一定程度上可反映昆蟲的健康狀況及其對(duì)體內(nèi)外不良環(huán)境的抵抗效力，因此對(duì)殺蟲劑等不利因子存在條件下腸道菌群變化的檢測(cè)與分析可一定程度上揭示昆蟲對(duì)這些因子的適應(yīng)機(jī)制。

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，食性廣，生活周期短，危害大。擬除蟲菊酯類殺蟲劑是防治此類害蟲的常用殺蟲劑，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用后的癥狀，可分為Ⅰ型擬除蟲菊酯和Ⅱ型擬除蟲菊酯兩大類。Ⅰ型擬除蟲菊酯不含α-氰基，如七氟菊酯(tefluthrin)，主要引發(fā)T綜合征(tremor-syndrome)，表現(xiàn)為不安、麻痹、過度興奮及身體震顫的癥狀；Ⅱ型擬除蟲菊酯含有α-氰基，如溴氰菊酯(deltamethrin)，主要引發(fā)CS綜合征(choreoathetosis-salivation-syndrome)，表現(xiàn)為動(dòng)作失調(diào)、身體扭曲、抽搐、流涎等癥狀。目前，棉鈴蟲已對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了嚴(yán)重抗藥性?；谇笆隼ハx腸道菌群與宿主抗藥性相關(guān)的重要線索，檢測(cè)分析擬除蟲菊酯類殺蟲劑作用前后棉鈴蟲腸道微生物結(jié)構(gòu)和代謝的變化，對(duì)擬菊酯類殺蟲劑作用機(jī)理以及棉鈴蟲抗藥性機(jī)理分析具有重要意義。目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過16S rDNA測(cè)序及Biolog-Eco分別分析飼喂普通人工飼料、含2%七氟菊酯(Ⅰ型擬除蟲菊酯)粉劑飼料和含2.5%溴氰菊酯(Ⅱ型擬除蟲菊酯)乳油飼料的棉鈴蟲幼蟲腸道微生物結(jié)構(gòu)以及腸道微生物對(duì)31種碳源代謝的變化，探究溴氰菊酯和七氟菊酯對(duì)棉鈴蟲腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝功能的影響，分析擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試蟲的飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用棉鈴蟲為擬除蟲菊酯敏感品系，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。飼養(yǎng)條件為：溫度25～28℃，相對(duì)濕度60%～80%，光周期14L∶10D。棉鈴蟲普通人工飼料配方參考卓樂姒等(1981)。

1.2 添加殺蟲劑飼料的配制和試蟲分組處理

分別配制2%七氟菊酯(Ⅰ型擬除蟲菊酯)粉劑和2.5%溴氰菊酯(Ⅱ型擬除蟲菊酯)乳油(有效成分25 g/L)的亞致死濃度(8 mg/L)，將普通人工飼料切成邊長(zhǎng)為1 cm的小塊分別浸泡在藥液中，5 min后將飼料取出，晾至半干。棉鈴蟲2和3齡幼蟲分別飼喂普通人工飼料(對(duì)照組,SS)、含2%七氟菊酯粉劑飼料(七氟菊酯處理組,Te)和含2.5%溴氰菊酯乳油飼料(溴氰菊酯處理組,DM)，36 h后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3 棉鈴蟲腸道基因組DNA的提取

隨機(jī)選取體型大小一致、生長(zhǎng)健康的SS,Te和DM組3齡幼蟲各150頭，饑餓處理后將幼蟲置于75%的酒精中30秒進(jìn)行體表消毒，然后用0.8%的生理鹽水漂洗3次，無菌條件下解剖取出腸道，放在1 mL玻璃勻漿器中，加入少許0.8%的生理鹽水，立即進(jìn)行勻漿，使用Magen Hipure Soil DNA Kit提取腸道基因組DNA備用。每個(gè)樣品50根腸道，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 棉鈴蟲腸道細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增、建庫(kù)和測(cè)序

使用金唯智設(shè)計(jì)的擴(kuò)增原核生物16S rDNA V3-V4區(qū)的引物，正向引物：5′-CCTACGGRRBGCA SCAGKVRVGAAT-3′；反向引物:5′-GGACTAC NVGGGTWTCTAATCC-3′。反應(yīng)體系(25 μL)：TransStart Buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL,正反向引物(10 mmol/L)各1 μL,TransStart Taq DNA 0.5 μL,模板DNA 20 ng,補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性5 s,57℃退火90 s,72℃延伸10 s,最終72℃延伸 5 min,24個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

通過PCR向16S rDNA的PCR產(chǎn)物末端加上帶有Index的接頭，以便進(jìn)行NGS測(cè)序。使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,美國(guó))檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，并通過Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad,CA)檢測(cè)文庫(kù)濃度。DNA文庫(kù)混合后，按Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,美國(guó))使用說明書進(jìn)行PE250/300雙端測(cè)序，由MiSeq自帶的MiSeq Control Software(MCS)讀取序列信息(蘇州金唯智生物科技有限公司)。

1.5 qPCR驗(yàn)證棉鈴蟲腸道細(xì)菌

利用qPCR驗(yàn)證SS,DM和Te棉鈴蟲腸道中變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)高通量測(cè)序結(jié)果。并用棉鈴蟲腸道總細(xì)菌量對(duì)這兩個(gè)菌門進(jìn)行相對(duì)定量。qPCR引物設(shè)計(jì)在16S rDNA的保守區(qū)域內(nèi)，引物序列參照夏曉峰(2014)，總細(xì)菌定量引物：正向引物：5′-CGGCAACGAGCGCAA CCC-3′；反向引物：5′-CCATTGTAGCACGTGTGTGTA GCC-3′。變形菌門定量引物：正向引物：5′-TCGTCA GCTCGTGTYGTGA-3′；反向引物：5′-CGTAAGGG CCATGATG-3′。厚壁菌門定量引物：正向引物：5′-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3′；反向引物：5′-AGCTGACGACAACCATGCAC-3′。qPCR反應(yīng)體系(25 μL):SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TakaRa) 12.5 μL,20 ng腸道細(xì)菌總DNA模板，正反向引物(10 mmol/L)各1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足。三步法qPCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 3 s,40次循環(huán);60℃ 30 s,95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。qPCR在Eppendorf 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Realplex2上進(jìn)行。qPCR產(chǎn)物相對(duì)豐富度用2-ΔΔCT法計(jì)算(Livak and Schmittgen,2001)。

1.6 Biolog-Eco檢測(cè)棉鈴蟲幼蟲腸道菌群代謝活性

Biolog-Eco技術(shù)可以用于分析微生物對(duì)Eco板上31種碳源的利用情況。Biolog-Eco板的每孔平均顏色變化率(average well color development,AWCD)是反映環(huán)境微生物代謝活性，即利用單一碳源能力的重要指標(biāo)。Biolog-Eco板的碳源有31種單一碳源和空白對(duì)照，每種碳源和空白對(duì)照有3個(gè)平行。31種碳源按照化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)分成6類，即胺/氨基化合物、氨基酸類、糖類、羧酸類、雙親化合物類和聚合物(孔濱和楊秀娟,2011)。分別取對(duì)照組(SS)、溴氰菊酯處理組(DM)和七氟菊酯處理組(Te)棉鈴蟲2齡和3齡幼蟲各35頭，在無菌條件下解剖取出腸道，放在1 mL玻璃勻漿器中，加入少許0.8%的生理鹽水，立即進(jìn)行勻漿，用0.8%生理鹽水定容至12.5 mL。無菌條件下將腸道樣品懸浮液加樣到Biolog-Eco微孔板中，每孔120 μL，將加樣后的Biolog-Eco板置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)，1 h后用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，此次讀數(shù)設(shè)為初始值，之后每隔24 h讀數(shù)1次，連續(xù)7～10次。

棉鈴蟲腸道微生物代謝活性用每孔平均顏色變化率(AWCD)表示，計(jì)算公式：AWCD=[∑(Ai-ACK)]/n(李文紅等,2018)。

其中，Ai為i孔碳源590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值，OD590與OD750的差值大于0.2的為可利用的碳源；ACK為對(duì)照孔的吸光度值。n為碳源總數(shù)。

利用各樣品培養(yǎng) 96 h 的數(shù)據(jù)，利用下列公式計(jì)算棉鈴蟲3組樣品微生物群落多樣性的 Shannon指數(shù)(H)(Braunetal.,2006)和McIntosh指數(shù)(U)(Xietal.,2003)：

H=-∑Pi×lnPi;

其中，Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比值；ni是第i孔的相對(duì)吸光值。

采用 Microsoft Excel 2010軟件和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，Origin 8.0軟件和Adobe Illustrator CS6軟件作圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對(duì)1.4節(jié)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，去除嵌合體，得到優(yōu)化序列，在97%的相似度下將其聚類為物種分類的OTU(operational taxonomic units)，OTU Venn圖分析不同樣品中共有及特有的OTU數(shù)目。運(yùn)用Mothur v.1.30.1軟件，采用α多樣性指數(shù)(Shannon,Simpson,Coverage,Chao1,Sobs,Ace)分析樣品的豐富度、均勻度及覆蓋度等；選用T檢驗(yàn)，即在樣本方差相等時(shí)，分析樣本的均值是否存在顯著性差異，群落組成圖在不同分類水平分析物種的組成及相對(duì)豐度，組間差異性檢驗(yàn)分析不同組間物種是否差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 棉鈴蟲腸道細(xì)菌測(cè)序信息分析

SS,DM和Te組9個(gè)棉鈴蟲腸道樣品共得到有效序列571 002條，平均每個(gè)樣品63 445條，有效序列平均長(zhǎng)度為450 bp。為了研究腸道細(xì)菌的物種組成多樣性，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU。隨著測(cè)序深度增加，物種稀釋曲線趨于平緩，說明本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品的處理已達(dá)到了一定的深度和廣度，完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。此外，全部樣本的Coverage指數(shù)都在99.5%以上(表1)，說明測(cè)序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

SS,DM和Te組腸道樣品共有的OTU數(shù)目為209個(gè)，SS與Te共有的OTU數(shù)目為230個(gè)，SS與DM共有的OTU數(shù)目為219個(gè)，DM與Te共有的OTU數(shù)目為220個(gè)。SS特有的OTU為9個(gè)，Te特有的OTU數(shù)目為22個(gè)，DM特有的OTU數(shù)目為14個(gè)。這些數(shù)據(jù)說明SS,DM和Te之間有相同的菌群，但也有差異(圖1)。

圖1 棉鈴蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌OTUs Venn圖Fig.1 Venn diagram of gut bacteria in the 3rd instar larvae of Helicoverpa armigeraDM:飼喂2.5%溴氰菊酯乳油飼料的處理組Treatment group fed with the diet containing 2.5% deltamethrin emulsifiable concentrate;SS:飼喂普通人工飼料的對(duì)照組Control group fed with the normal artificial diet;Te:飼喂2%七氟菊酯粉劑飼料的處理組Treatment group fed with the diet containing 2% tefluthrin powder.下同The same below.

2.2 棉鈴蟲腸道細(xì)菌物種組成

對(duì)腸道菌群測(cè)序的OUT進(jìn)行物種注釋，在門(phylum)水平主要有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。其中，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和藍(lán)藻菌門占90%以上，屬于優(yōu)勢(shì)菌門。SS組中第1優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門(50.2%)，第2優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門(38.1%)，第3優(yōu)勢(shì)菌是變形菌門(7.3%)，藍(lán)藻菌門占1.6%。DM組中第1優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門(50.6%)，第2優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門(26.1%)，第3優(yōu)勢(shì)菌門是藍(lán)藻菌門和擬桿菌門(分別占10.8%和6.5%)。七氟菊酯組(Te)中第1優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門(51.3%)，第2優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門(29.1%)，第3優(yōu)勢(shì)菌門是擬桿菌門(13.5%)，藍(lán)細(xì)菌門占2.9%(圖2:A)。與SS相比，DM和Te的厚壁菌門和藍(lán)藻菌門相對(duì)豐度升高，擬桿菌門相對(duì)豐度下降，但差異不顯著(P>0.05)(圖3:A)。qPCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，溴氰菊酯處理組和七氟菊酯處理組棉鈴蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌中厚壁菌門占比大于對(duì)照組的，此結(jié)果與16S rDNA測(cè)序分析結(jié)果相似。

圖2 棉鈴蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌在門(A)和屬(B)水平的組成Fig.2 Proportional composition of gut bacteria in the 3rd instar larvae of Helicoverpa armigera at the phylum (A) and genus (B) levels

圖3 棉鈴蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌門(A)和屬(B)水平的相對(duì)豐度差異圖Fig.3 Relative abundance differences at the phylum (A) and genus (B) levels of gut bacteria in the 3rd instar larvae of Helicoverpa armigera圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，星號(hào)示差異顯著(P<0.05,單因素方差分析，95%置信區(qū)間)。Data in the figure are mean±SD,and the asterisk indicates significant difference (P<0.05,one-way ANOVA analysis,95% confidence interval).

圖4 qPCR檢測(cè)棉鈴蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌門水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of gut bacteria at the phylum level in the 3rd instar larvae of Helicoverpa armigera by qPCR

在屬水平(圖2:B)，與SS相比，DM和Te的擬桿菌屬Bacteroides、假單胞菌屬Pseudomonas和普氏菌屬Prevotella相對(duì)豐度下降。狹義梭菌屬Clostridiumsensustricto1、norankfPeptostreptococcaceae、魏斯氏菌屬Weissella、埃希菌屬-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、鹽單胞菌屬Halomonas的相對(duì)豐度上升。其中，鹽單胞菌屬Halomonas的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)(圖3:B)。

2.3 棉鈴蟲腸道細(xì)菌多樣性

基于16S rDNA測(cè)序?qū)M,SS和Te 3組樣品中細(xì)菌α多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，3組樣品的α多樣性指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)?；贐iolog-Eco實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌多樣性指數(shù)分析結(jié)果如表2所示，2齡幼蟲期各組的Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)沒有顯著性差異(P>0.05)。3齡幼蟲期DM組McIntosh指數(shù)有顯著(P<0.05)降低。2齡幼蟲期各組的Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)均大于3齡期的。

表1 基于16S rDNA測(cè)序的棉鈴蟲3齡幼蟲腸道細(xì)菌α多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indices of gut bacteria in the 3rd instar larvae of Helicoverpa armigera based on 16S rDNA sequencing

表2 基于Biolog-Eco實(shí)驗(yàn)的棉鈴蟲幼蟲腸道細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of larval gut bacteria of Helicoverpa armigera based on Biolog-Eco assay

2.4 棉鈴蟲幼蟲腸道菌群代謝活性

根據(jù) AWCD計(jì)算公式，本研究中SS,DM和Te組棉鈴蟲幼蟲腸道樣品中細(xì)菌利用31種碳源的AWCD變化曲線如圖5所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AWCD值基本持續(xù)升高，說明腸道細(xì)菌對(duì)碳源的利用力呈逐漸增加的趨勢(shì)。不同組中2齡幼蟲的AWCD值均大于3齡幼蟲的(圖5:A-C)，說明2齡幼蟲的代謝要高于3齡幼蟲的。2齡幼蟲腸道樣品中，SS,Te和DM組的AWCD值相似，Te的稍高(圖5:D)；3齡幼蟲腸道樣品中，Te的AWCD稍高，DM的AWCD值最低(圖5:E)。

圖5 Biolog-Eco檢測(cè)棉鈴蟲幼蟲腸道細(xì)菌AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.5 Changes in AWCD of larval gut bacteria of Helicoverpa armigera with culturing time detected by Biolog-EcoA,B,C:分別為SS (A),DM (B)和Te (C)組2和3齡幼蟲在1-168 h內(nèi)腸道細(xì)菌的AWCD隨時(shí)間變化情況AWCD change in the gut bacteria of the 2nd and 3rd instar larvae in SS (A),DM (B) and Te (C) groups,respectively,within 1-168 h.D,E:分別為SS,DM和Te組2齡(D)和3齡(E)幼蟲在1-168 h內(nèi)腸道細(xì)菌的AWCD隨時(shí)間變化情況AWCD change in the gut bacteria of the 2nd instar (D) and 3rd instar (E) larvae in SS,DM and Te groups,respectively,within 1-168 h.AWCD:平均顏色變化率，反映環(huán)境微生物代謝活性Average well color development,reflecting the metabolic activity of environmental microorganisms.2 SS,3 SS:分別為SS組的2和3齡幼蟲2nd and 3rd instar larvae in SS group,respectively;2 DM,3 DM:分別為DM組的2和3齡幼蟲2nd and 3rd instar larvae in DM group,respectively;2 Te,3 Te:分別為Te組的2和3齡幼蟲2nd and 3rd instar larvae in Te group,respectively.

為分析棉鈴蟲腸道細(xì)菌對(duì)不同類型碳源的利用情況，調(diào)查1-168 h各腸道樣品在Biolog-Eco板上的讀數(shù)，結(jié)果如表3所示，SS,Te和DM組都能代謝的碳源：α-環(huán)式糊精、D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇和N-乙酰-D-葡萄糖胺7種，其中α-環(huán)式糊精是聚合物，其他是糖類；都不能利用的碳源：D-葡萄糖胺酸、D-半乳糖酸內(nèi)酯、2-羥基苯甲酸、γ-羥基丁酸、L-蘇氨酸和腐胺6種。

表3 棉鈴蟲幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)Biolog-Eco板上碳源的利用情況Table 3 Use of carbon substrates on Biolog-Eco plate by larval gut bacteria of Helicoverpa armigera

DM組2齡幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)丙酮酸甲酯、4-羥基苯甲酸、衣康酸、D-蘋果酸、α-丁酮酸、苯乙胺、L-天門冬氨酸和D-半乳糖醛酸的代謝能力降低；Te組2齡幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸和赤蘚糖醇的代謝增強(qiáng)，對(duì)L-天門冬氨酸、D-蘋果酸和D-半乳糖醛酸的代謝能力下降。DM組3齡幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)1-磷酸葡萄糖、DL-α-磷酸甘油、肝糖和L-苯丙氨酸的代謝能力下降；Te組3齡幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)DL-α-磷酸甘油、肝糖和L-苯丙氨酸的代謝能力下降。

3 討論

昆蟲腸道菌群與昆蟲的健康狀況密切相關(guān)，與昆蟲的抗藥性也有一定關(guān)系(李文紅等,2018;Xiaetal.,2018)，因此，研究溴氰菊酯和七氟菊酯作用后棉鈴蟲腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝變化，一定程度上有助于分析腸道菌群與棉鈴蟲抗藥性的聯(lián)系，從不同角度闡明擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用機(jī)理。

16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明棉鈴蟲腸道菌群主要屬于6個(gè)菌門，分別是厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻菌門、放線菌門和異常球菌-棲熱菌門(圖2:A)。其中厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和藍(lán)藻菌門占90%以上，屬于優(yōu)勢(shì)菌門。對(duì)照組、溴氰菊酯處理組和七氟菊酯處理組棉鈴蟲腸道菌群的菌門種類基本一致，比例有所不同，溴氰菊酯處理組和七氟菊酯處理組的厚壁菌門相對(duì)豐度比對(duì)照組高12%，擬桿菌相對(duì)豐度比對(duì)照組分別低44.7%和36.7%，藍(lán)藻菌門分別是對(duì)照組的3和2倍(圖3:A)。與對(duì)照組相比，溴氰菊酯處理組和七氟菊酯處理組棉鈴蟲腸道菌群的擬桿菌屬Bacteroides、假單胞菌屬Pseudomonas和普氏菌屬Prevotella的相對(duì)豐度降低。鹽單胞菌屬Halomonas、狹義梭菌屬Clostridiumsensustricto1、norankfPeptostreptococcaceae、魏斯氏菌屬Weissella、埃希菌屬-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、鹽單胞菌屬Halomonas的相對(duì)豐度升高。其中，鹽單胞菌屬Halomonas的相對(duì)豐度顯著(P<0.05)升高(圖3:B)。

擬桿菌屬Bacteroides和普氏菌屬Prevotella對(duì)于加固腸上皮、維持腸道功能具有重要意義，特別是擬桿菌屬對(duì)腸道的保護(hù)作用尤為重要(鄭藝等,2014)；此外，擬桿菌屬Bacteroides對(duì)糖代謝起到調(diào)節(jié)作用(Tao,2014)。假單胞菌屬Pseudomonas對(duì)昆蟲病原真菌的拮抗作用(Indiragandhietal.,2008)等。飼喂含溴氰菊酯和七氟菊酯的飼料后，棉鈴蟲腸道中擬桿菌門(Bacteroides)、假單胞菌屬Pseudomonas和普氏菌屬Prevotella的相對(duì)豐度下降，可能會(huì)導(dǎo)致棉鈴蟲腸道保護(hù)作用下降，免疫力降低，使棉鈴蟲更易死亡。本研究中相對(duì)豐度升高的菌中有些是動(dòng)物致病菌，如狹義梭菌屬Clostridiumsensustricto1能夠引起食物中毒和壞死性腸炎等疾病(Bryant and Stevens,2010;Kiyonobuetal.,2019)，破壞宿主的免疫反應(yīng)(Ellemoretal.,1999;Bryantetal.,2000)，引起腸毒素血癥，破壞血腦屏障等(Lindenetal.,2019)。

Biolog-Eco實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AWCD值基本持續(xù)升高(圖5)，說明棉鈴蟲幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)碳源的利用呈逐漸增加的趨勢(shì)，2齡幼蟲對(duì)碳源的利用高于3齡幼蟲。溴氰菊酯處理組能夠利用的碳源種類最少。溴氰菊酯處理組2齡幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)羧酸類碳源的代謝能力下降，七氟菊酯處理組對(duì)氨基酸類代謝能力增強(qiáng)，七氟菊酯處理組和溴氰菊酯處理組3齡幼蟲腸道細(xì)菌對(duì)DL-α-磷酸甘油、肝糖和L-苯丙氨酸等碳源的利用能力下降(表3)。但是多樣性分析發(fā)現(xiàn)，各組腸道菌群多樣性和豐富度沒有形成明顯差異(表1)。棉鈴蟲2齡幼蟲腸道菌群的多樣性和豐富度比3齡幼蟲的有優(yōu)勢(shì)(表2)。七氟菊酯和溴氰菊酯處理的棉鈴蟲的幼蟲腸道細(xì)菌的代謝功能不同，可能與七氟菊酯和溴氰菊酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，七氟菊酯是Ⅰ型擬除蟲菊酯，不含有α-氰基，而溴氰菊酯是Ⅱ型擬除蟲菊酯，含有α-氰基。有研究表明Ⅰ型擬除蟲菊酯和Ⅱ型擬除蟲菊酯的作用機(jī)制可能有很大區(qū)別(Breckenridgeetal.,2009)，這兩種擬除蟲菊酯的結(jié)構(gòu)差異可能是導(dǎo)致棉鈴蟲的腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能差異的原因之一。

本研究檢測(cè)了七氟菊酯和溴氰菊酯對(duì)棉鈴蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝的影響，結(jié)果顯示擬除蟲菊酯可改變棉鈴蟲腸道菌群的結(jié)構(gòu)，主要是使益生菌的相對(duì)豐度降低，致病菌的相對(duì)豐度升高。研究結(jié)果對(duì)開展腸道微生物的功能研究有重要參考價(jià)值，為擬除蟲菊酯類殺蟲劑對(duì)棉鈴蟲作用機(jī)制分析提供了參考，也為通過腸道菌群調(diào)控治理棉鈴蟲的抗藥性提供了新思路。

致謝本實(shí)驗(yàn)使用了美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在此表示感謝。