趙 倩，凌志峰，鮮慈英，黃 斌，楊 夢(mèng)，詹 杰，羅洪斌,2,3*

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學(xué)神經(jīng)精神共患病研究所(湖北 恩施 445000) 3.湖北民族大學(xué)科技學(xué)院(湖北 恩施 445000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一種起病隱匿且呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病[1]。臨床上多以記憶減退、認(rèn)知理解能力下降、反應(yīng)遲鈍、性格和行為改變等表現(xiàn)為主要特征。隨著社會(huì)老齡化趨勢(shì)的不斷發(fā)展，AD的發(fā)病率日趨增高，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量及身心健康。因此，對(duì)于AD的發(fā)病機(jī)制及防治研究也日益受到科研人員的高度重視。臨床上AD的一線治療藥物主要為乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetycholinesterase 1,AchE1)和非競(jìng)爭(zhēng)性的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，但由于上述藥物有較多不良反應(yīng)，給患者帶來(lái)了一定痛苦，故AD的臨床防治需尋找既能延緩疾病發(fā)展同時(shí)又較少不良反應(yīng)的藥物。

AD在中醫(yī)中屬于癡呆范疇，中醫(yī)解釋為髓減腦消，神機(jī)失用。其病因病機(jī)復(fù)雜，總體可分為本虛標(biāo)實(shí)，腎為先天之本，主骨生髓，而腦為髓海，腎精虧損，則腦失所養(yǎng)。情志不暢或驚恐導(dǎo)致肝郁氣滯、氣血瘀阻、痰蒙神竅也可致呆。故中醫(yī)對(duì)癡呆的治療多以補(bǔ)虛、活血化瘀、化痰開(kāi)竅等為基本。

菟絲子(CuscutachinensisLam.)是旋花科菟絲子屬植物的種子，具有補(bǔ)陽(yáng)益陰、固精縮尿、明目止瀉的功效，是常用的補(bǔ)益類(lèi)中藥。該藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，2010版《中國(guó)藥典》收載，菟絲子具有滋補(bǔ)肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等藥效，可用于陽(yáng)痿遺精，尿有余瀝，尿頻，腰膝酸軟，目昏耳鳴，腎虛胎漏，胎動(dòng)不安，脾腎虛瀉等[2]。菟絲子的現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[3-4]，其化學(xué)成分主要包括黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、甾體類(lèi)、揮發(fā)油以及木質(zhì)素等化合物，還含有大量的糖苷、16種氨基酸以及鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅等微量元素，具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善記憶、抗氧化、降低炎癥反應(yīng)等多種作用。

目前關(guān)于菟絲子治療AD作用機(jī)制方面的報(bào)道較少。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)菟絲子防治AD的作用靶點(diǎn)以及信號(hào)通路進(jìn)行分析與總結(jié)，闡述菟絲子在防治AD中可能的作用靶點(diǎn)，為深入研究菟絲子防治AD作用機(jī)制提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1菟絲子成分的整理與篩選以“菟絲子或tusizi”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)(TCMSP)中查詢菟絲子的主要成分信息，以藥物口服生物利用度(OB)≥30%和類(lèi)藥性(DL)≥0.18為條件，篩選出菟絲子的部分潛在有效成分。

1.2藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因信息的收集在TCMSP中以“菟絲子或tusizi”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，“Related Targets”選項(xiàng)所示即為所找藥物相關(guān)靶點(diǎn)，將顯示的菟絲子全部靶基因復(fù)制保存。然后通過(guò)運(yùn)行perl軟件，用靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Uniprot)(https://www.uniprot.org/)對(duì)菟絲子的靶點(diǎn)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

在GeneCards(https://www.Genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索得到AD相關(guān)靶點(diǎn)基因并導(dǎo)出數(shù)據(jù)信息。

1.3藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析先將整理歸納后的菟絲子有效成分和靶點(diǎn)基因?qū)氲紺ytoscape V3.2.1軟件，然后再把GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到和AD相關(guān)的靶點(diǎn)基因也導(dǎo)入至Cytoscape V3.2.1軟件中，構(gòu)建出藥物、疾病、靶點(diǎn)、成分之間相互作用的中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。再將所整理得到的菟絲子活性成分與靶點(diǎn)基因通過(guò)R×64 4.0.2軟件及相應(yīng)腳本進(jìn)行程序篩選，可得出兩者之間的交集，將篩選出的核心靶點(diǎn)基因輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，生成蛋白相互作用(PPI)核心基因網(wǎng)絡(luò)圖。最后將菟絲子可能對(duì)AD起作用的靶點(diǎn)基因?qū)隦×64 4.0.2軟件中，使用相應(yīng)腳本進(jìn)行程序運(yùn)算，進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析可得到基因生物途徑(BP)、分子功能(MF)的分類(lèi)。再進(jìn)行基因組百科全書(shū)KEGG通路富集分析，得到菟絲子干預(yù)AD的通路圖。

2 結(jié)果

2.1菟絲子活性成分及靶點(diǎn)的篩選結(jié)果在TCMSP平臺(tái)中最終確定菟絲子潛在有效成分11個(gè)，見(jiàn)表1，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化分析后得到10個(gè)。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)提供的菟絲子相關(guān)靶點(diǎn)共490個(gè)，經(jīng)Uniprot標(biāo)準(zhǔn)化后對(duì)應(yīng)基因的有108個(gè)。

表1 菟絲子潛在有效成分

2.2 AD作用靶點(diǎn)獲取結(jié)果從GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞搜索AD相關(guān)靶基因，得到8 628個(gè)。

2.3藥物與疾病相關(guān)性分析

2.3.1 菟絲子主要有效成分-靶點(diǎn)基因-藥物-疾病網(wǎng)的建立 利用軟件R×64 4.0.2將藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)算，所得交集即為菟絲子可能對(duì)AD起作用的相關(guān)靶點(diǎn)，共得到90個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 菟絲子與AD靶點(diǎn)交集圖

利用Cytoscape V3.6.1軟件將菟絲子有效成分的相關(guān)靶基因與AD相關(guān)作用靶基因相對(duì)應(yīng)，構(gòu)建出菟絲子主要有效成分-靶點(diǎn)基因-藥物-疾病網(wǎng)。其相互作用見(jiàn)圖2：該網(wǎng)絡(luò)共包含102個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物節(jié)點(diǎn)和疾病節(jié)點(diǎn)各1個(gè)，成分基因節(jié)點(diǎn)10個(gè)，疾病基因節(jié)點(diǎn)90個(gè)。由圖可知，菟絲子的有效成分可作用于多靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)多種成分，故此網(wǎng)絡(luò)提示菟絲子對(duì)AD的干預(yù)可能具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。其中可能起到關(guān)鍵作用的成分為槲皮素(quercetin)、山奈黃素(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。

注：藍(lán)色代表疾病，黃色代表疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)，紫色代表藥物，綠色代表藥物有效成分圖2 菟絲子主要成分-靶點(diǎn)基因-藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用R軟件將疾病與藥物的靶點(diǎn)進(jìn)行分析和篩選，將所得共同靶點(diǎn)輸入String網(wǎng)站，進(jìn)行蛋白相互作用分析，在菟絲子干預(yù)AD的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中，選取關(guān)聯(lián)程度排名前30個(gè)靶點(diǎn)，其中關(guān)聯(lián)度最高的5個(gè)靶點(diǎn)分別為半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、重組人2,4-雙烯酰輔酶A還原酶1(DECR1)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、ESR1、內(nèi)皮-氧化氮合酶3(NOS3)，這些靶點(diǎn)可能是此干預(yù)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 菟絲子與AD蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 菟絲子干預(yù)AD的PPI核心靶點(diǎn)基因

2.3.3 GO生物功能分析 將菟絲子干預(yù)AD的潛在靶點(diǎn)輸入R×64 4.0.2軟件，進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，其生物途徑主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，此過(guò)程涉及12個(gè)靶點(diǎn)，可能為最主要的生物過(guò)程，此外也與泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等方面有一定關(guān)系。其分子功能主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性和RNA聚合酶II特異性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性等方面，見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

2.3.4 KEGG通路富集分析 將上述所得潛在靶點(diǎn)運(yùn)用R軟件進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示，該干預(yù)過(guò)程在PI3K-Akt信號(hào)通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、蛋白聚糖在癌癥中的信號(hào)通路最為富集，可能是菟絲子干預(yù)AD的最主要信號(hào)通路，見(jiàn)圖7、圖8、圖9、圖10。此外，該干預(yù)過(guò)程與流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、MAPK信號(hào)通路也有一定關(guān)系。

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖9 PI3K-Akt信號(hào)通路圖

圖10 卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路圖

3 討論

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，AD的發(fā)病率日趨增高，但其發(fā)病原因至今未明，當(dāng)前較為公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制主要有：膽堿能假說(shuō)、毒性β淀粉樣(Aβ)蛋白的沉積假說(shuō)、Tau蛋白過(guò)度磷酸化假說(shuō)、自由基損傷假說(shuō)、炎癥假說(shuō)等。從病理學(xué)角度看，AD的病理改變主要出現(xiàn)在主導(dǎo)學(xué)習(xí)與記憶功能的大腦皮層和海馬區(qū)域，包括膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿(Ach)含量顯著減少、腦部出現(xiàn)大量由Aβ蛋白組成的老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等方面[5]，且這些病理改變之間會(huì)形成一個(gè)惡性病理循環(huán)[6]，因此AD患者臨床上主要表現(xiàn)為不可逆的漸進(jìn)性記憶喪失和認(rèn)知功能障礙。

AD的病理過(guò)程涉及多條信號(hào)通路與基因調(diào)控，因此聯(lián)合分析幾大數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠更全面地把握AD的發(fā)病原因及其潛在發(fā)病機(jī)制。本次研究運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出菟絲子干預(yù)AD的標(biāo)準(zhǔn)化后潛在有效成分10個(gè)[7]，相關(guān)靶點(diǎn)108個(gè)，與AD的相交靶點(diǎn)共有90個(gè)，提示菟絲子靶點(diǎn)映射AD的治療概率是83.33%(90/108)，說(shuō)明藥物-疾病靶點(diǎn)映射率很可觀。通過(guò)相關(guān)軟件分析預(yù)測(cè)，得到菟絲子可能對(duì)AD起作用的主要作用靶點(diǎn)為CASP3、DECR1、MAPK8、ESR1、NOS3，菟絲子中的有效成分可直接作用于這些靶點(diǎn)，也可通過(guò)其他靶點(diǎn)產(chǎn)生間接相關(guān)性。CASP3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶[8],該基因編碼的蛋白質(zhì)也參與了淀粉樣前體蛋白APP的裂解[9]，APP裂解后產(chǎn)生Aβ，在AD患者大腦中過(guò)多堆積，形成老年斑，造成周?chē)窠?jīng)元變性與凋亡，誘導(dǎo)AD的發(fā)生。ESR1是雌激素受體1,已有研究表明[10]雌激素表達(dá)水平的高低與GSK-3β的活性密切相關(guān)，GSK-3β是一種重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要作用于神經(jīng)細(xì)胞的分化與增殖，在神經(jīng)退行性疾病中具有重要的影響。GSK-3β異?；钴S會(huì)導(dǎo)致Tau蛋白的異常磷酸化，造成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。說(shuō)明菟絲子對(duì)AD的干預(yù)也可從調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素的途徑發(fā)揮作用。DECR1是一種在不飽和脂肪酸的β-氧化途徑中起催化反應(yīng)的限速酶，參與體內(nèi)脂肪堆積的調(diào)節(jié)，說(shuō)明AD的產(chǎn)生可能與肥胖因素存在某種潛在關(guān)系，但此觀點(diǎn)尚未得到證實(shí)。MAPK8參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、對(duì)藥物及環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理及病理過(guò)程[11-12]。MAPK8高表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)Tau蛋白的異常磷酸化[13]，故而引起AD的發(fā)病。NOS3存在于神經(jīng)元中，具有協(xié)助細(xì)胞通訊的作用。由此可見(jiàn)菟絲子的干預(yù)作用也可能通過(guò)以上途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

疾病-藥物靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖顯示出菟絲子對(duì)AD的干預(yù)過(guò)程屬于多成分作用于多靶點(diǎn)的結(jié)果。PPI網(wǎng)絡(luò)說(shuō)明菟絲子的靶點(diǎn)蛋白之間發(fā)揮著相互作用。在GO功能富集化分析結(jié)果顯示得出菟絲子作用于AD主要的生物過(guò)程包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等方面。KEGG通路富集分析結(jié)果表明PI3K-Akt信號(hào)通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染是菟絲子干預(yù)AD的重要信號(hào)通路。

PI3K-Akt信號(hào)通路作為AD發(fā)病機(jī)制中的一條經(jīng)典通路，在誘導(dǎo)APP過(guò)度裂解、Aβ過(guò)度堆積、Tau蛋白過(guò)度磷酸化和細(xì)胞凋亡方面有著密切聯(lián)系，對(duì)神經(jīng)突觸可塑性具有重要影響[14]。PI3K的表達(dá)能夠激活A(yù)KT的磷酸化位點(diǎn)，從而激活A(yù)KT，進(jìn)而導(dǎo)致GSK-3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化，Ser9位點(diǎn)屬于非活性位點(diǎn)，使得GSK-3β的活性被抑制[15]。然而在AD中，由于該信號(hào)通路部分蛋白表達(dá)異常，導(dǎo)致GSK-3β過(guò)度表達(dá)而活性上升。GSK-3β又是Tau蛋白磷酸化的重要激酶之一，其過(guò)表達(dá)將誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多載脂蛋白E4(Apo-E4)和Aβ，造成Aβ過(guò)度堆積，形成老年斑，引起細(xì)胞凋亡和Tau蛋白過(guò)度磷酸化。相反，毒性Aβ堆積也進(jìn)一步升高GSK-3β的活性，加重Tau蛋白的過(guò)度磷酸化和神經(jīng)元死亡，使神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)不斷受到損害，造成神經(jīng)元細(xì)胞功能進(jìn)一步損傷，引起神經(jīng)元發(fā)生不可逆的慢性病變，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。由此可見(jiàn)，本研究推測(cè)PI3K-Akt信號(hào)通路是菟絲子干預(yù)AD的重要信號(hào)通路之一。

神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最基本的結(jié)構(gòu)，是傳遞信息和影響學(xué)習(xí)記憶能力的重要功能單位。大量研究表明[16]皰疹病毒與AD的發(fā)病相關(guān)，其中1型單純皰疹病毒(HSV-1)是一種DNA嗜神經(jīng)性病毒，會(huì)誘導(dǎo)AD標(biāo)志物的累積；人皰疹病毒4(HHV4，也稱為EBV)是一種與多種癌癥相關(guān)的皰疹病毒，在臨床上也與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，例如原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，多發(fā)性硬化癥，AD，小腦過(guò)失癥和腦炎等，是老年人認(rèn)知能力下降和發(fā)展為AD的環(huán)境危險(xiǎn)因素。另有研究表明[17]卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)與EBV一樣，能夠高效感染神經(jīng)細(xì)胞并進(jìn)行子代復(fù)制，其感染具有一定時(shí)間的潛伏期和定期激活特點(diǎn)，這種感染直接導(dǎo)致了系統(tǒng)免疫反應(yīng)的壓力，誘導(dǎo)相應(yīng)的慢性炎癥反應(yīng)(激活神經(jīng)炎癥標(biāo)志物—星形膠質(zhì)細(xì)胞)，使神經(jīng)細(xì)胞變得腫脹，繼而破裂，導(dǎo)致其凋亡，最終引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。故卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒信號(hào)通路提示菟絲子對(duì)于感染該病毒導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)具有一定的改善作用。

菟絲子的現(xiàn)代藥理研究已證實(shí)其具有延緩衰老、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防心腦血管等多種藥理作用，作為臨床常用中藥，菟絲子也能通過(guò)補(bǔ)腎填精、補(bǔ)陽(yáng)益陰起到濡養(yǎng)腦竅的作用，故通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)菟絲子干預(yù)AD主要作用靶點(diǎn)基因具有一定可行性和研究基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建出了相關(guān)靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)對(duì)菟絲子干預(yù)AD靶點(diǎn)基因的生物過(guò)程與通路富集分析，清楚地闡明了菟絲子干預(yù)AD的潛在作用機(jī)制，得出菟絲子可能在抑制Tau蛋白異常磷酸化、調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)、降低病毒感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)神經(jīng)元突觸可塑性、調(diào)節(jié)雌激素等方面具有一定作用，為后續(xù)研究菟絲子干預(yù)AD的相關(guān)作用機(jī)制及研發(fā)相關(guān)藥物提供了一定的理論支持及科學(xué)依據(jù)，具有潛在的藥物研究應(yīng)用價(jià)值。