莊金山 ，鄧均華 ，田克恭

（1.洛陽普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471000；2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000）

近年來，我國養(yǎng)豬業(yè)處于高速發(fā)展時(shí)期，年出欄肉豬7億頭左右，占世界生豬產(chǎn)量的一半以上，養(yǎng)豬業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展對(duì)我國農(nóng)業(yè)乃至整個(gè)國計(jì)民生的穩(wěn)定至關(guān)重要。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）在我國暴發(fā)以來，疫情迅速傳遍全國，給我國養(yǎng)豬業(yè)生物安全防控體系提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，該病也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）確定必須通報(bào)的六種重要豬病之一，我國將此病列為一類動(dòng)物疫病[1]。

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是有囊膜的雙鏈DNA病毒，根據(jù)p72基因的差異，可將ASFV分為至少22個(gè)基因型[2]，我國流行的毒株為基因Ⅱ型[3]，目前，ASF尚無疫苗上市。OIE推薦的ASF的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有兩類：一類是病原鑒定，包括血細(xì)胞吸附試驗(yàn)（haemadsorption，HAD）、熒光抗體試驗(yàn)（fluorescent antibody test，F(xiàn)AT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）；另一類是血清學(xué)試驗(yàn)，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、間接熒光抗體試驗(yàn)（indirect immunoinfluscent assay，IFA）、免疫印跡試驗(yàn)（immunoblotting test, IBT）。其中，以PCR原理為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)方法因其快速、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)，被快速廣泛地推廣應(yīng)用，在ASF的診斷、感染監(jiān)測(cè)、養(yǎng)殖復(fù)產(chǎn)過程中的生物安全評(píng)價(jià)等方面具有重要意義。

文章從核酸檢測(cè)技術(shù)的原理與特點(diǎn)、ASFV核酸檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用及核酸檢測(cè)新技術(shù)的應(yīng)用展望等3個(gè)方面進(jìn)行總結(jié)和分析，以期為養(yǎng)豬企業(yè)在ASF防控和核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)建立方面提供參考借鑒。

1 常用的核酸檢測(cè)技術(shù)與特點(diǎn)

核酸是生物遺傳物質(zhì)的載體，由核苷酸聚合而成，包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）；核酸是重要的生物標(biāo)志物，與生物的遺傳進(jìn)化密切相關(guān)，也是當(dāng)前疫病病原微生物檢測(cè)的目標(biāo)之一。自1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)、中心法則的提出和不斷完善為現(xiàn)代核酸檢測(cè)技術(shù)的建立與發(fā)展奠定了基礎(chǔ)；早在1961年，Hall等建立了利用探針和靶序列在溶液中進(jìn)行分子雜交的方法，隨后建立的Southern blot和Northern blot方法是對(duì)DNA和RNA檢測(cè)的經(jīng)典方法；1977年，F(xiàn)rederick Sanger發(fā)明了“雙脫氧終止法”完成了經(jīng)典的基因測(cè)序方法（一代核酸測(cè)序）的建立，開啟了核酸測(cè)序時(shí)代的序幕；1983年，Mullis發(fā)明的核酸體外擴(kuò)增的PCR技術(shù)極大提升了核酸檢測(cè)技術(shù)的敏感性和特異性。分子雜交、基因測(cè)序和PCR等三種技術(shù)是當(dāng)代核酸檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)，其中PCR技術(shù)及其衍生的核酸檢測(cè)技術(shù)在臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛。

PCR技術(shù)發(fā)展歷程可分為三個(gè)時(shí)代。第一代PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福尼亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)建，通過PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，操作繁瑣、容易交叉污染，且靈敏度和特異性較低，只能用于定性或半定量檢測(cè)。第二代PCR技術(shù)是最早由美國ABI公司推廣的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR），該方法通過增加熒光標(biāo)記的特異性核酸序列作為探針，極大地提高了檢測(cè)的特異性和敏感性，不僅能進(jìn)行定性分析，也可進(jìn)行定量分析；然而，qPCR在定量檢測(cè)方面仍然存在低拷貝核酸量檢測(cè)的穩(wěn)定性和絕對(duì)定量的準(zhǔn)確度問題。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近年來迅速發(fā)展的一種定量分析技術(shù)，被認(rèn)為是第三代PCR技術(shù)，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)不依賴擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值（Ct）判定結(jié)果，具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，且可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析；2006年，F(xiàn)luidigm公司率先推出基于芯片的dPCR儀，隨后，Life Technologies公司和Bio-Rad公司也推出了各自的商業(yè)化的dPCR儀。

主流的PCR技術(shù)所匹配的設(shè)備、試劑和耗材價(jià)格較昂貴，操作過程繁瑣，更適用于科研和大型醫(yī)學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，對(duì)于臨床即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）需要更為便捷、性價(jià)比更高的產(chǎn)品和技術(shù)。對(duì)流PCR（convective PCR，cPCR）是近年來發(fā)展起來的一種核酸快速檢測(cè)技術(shù)，最早由Benett等于2001年提出，其原理是通過在毛細(xì)管的上下兩端進(jìn)行加溫，通過溫度差異形成毛細(xì)管中液體密度的差異，無需外部的循環(huán)泵即可形成循環(huán)流動(dòng)，通過樣品自身的流動(dòng)完成PCR的過程[4]。2017年，第一臺(tái)用于商業(yè)化的8孔cPCR擴(kuò)增儀問世[5]。這種原理使PCR反應(yīng)的變性、退火、延伸能夠在同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，省去了PCR擴(kuò)增時(shí)各個(gè)階段的升降溫時(shí)間（圖1 B），也降低了儀器的能耗，與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR儀相比，cPCR擴(kuò)增儀體積大幅縮小，重量僅有4.5 kg左右（圖1 A），操作界面便于理解，單孔可獨(dú)立控制，便于現(xiàn)場(chǎng)樣品的隨時(shí)檢測(cè)（圖1 C），反應(yīng)倉操作便捷，雙層反應(yīng)倉蓋，可減少熒光信號(hào)的損失（圖1 D）。洛陽普泰生物技術(shù)有限公司已在獸醫(yī)領(lǐng)域首次推出基于cPCR技術(shù)檢測(cè)ASFV的便攜式POCT設(shè)備和快速檢測(cè)試劑盒[6]。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也是近年來發(fā)展起來的一類核酸快速檢測(cè)技術(shù)，包括多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）、依賴核酸序列擴(kuò)增(nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)、依賴解旋酶擴(kuò)增(helicase-dependent amplification，HDA)、滾環(huán)核酸擴(kuò)增(rolling circle amplifi cation, RCA)、鏈替代擴(kuò)增(strand displacement amplification, SDA)等[7]，在臨床診斷領(lǐng)域以LAMP和RPA應(yīng)用最為廣泛。這些方法的共同特點(diǎn)是可在恒溫條件下通過利用不同功能的DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)目的核酸模板的快速擴(kuò)增，降低了反應(yīng)體系的溫度要求[8]，同時(shí)結(jié)合熒光探針技術(shù)，保證了檢測(cè)的靈敏性和特異性，反應(yīng)體系溫度的降低，也簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的熒光定量PCR對(duì)儀器工作環(huán)境的苛刻要求，更有利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用。

2 ASFV核酸檢測(cè)方法的應(yīng)用

國內(nèi)外研究人員很早就建立了針對(duì)ASFV核酸的檢測(cè)方法。早在1992年[9]，瑞士研究人員就建立了針對(duì)ASFV基因組核酸的套式PCR方法，對(duì)豬的脾臟和血清進(jìn)行了檢測(cè)，并使用人工合成的質(zhì)粒DNA作為對(duì)照品；2003年，西班牙研究人員[10]建立了基于凝膠電泳的熱啟動(dòng)PCR方法，該方法明顯提升了對(duì)ASFV核酸的檢測(cè)靈敏度，擴(kuò)大了臨床樣品的檢測(cè)范圍，可檢測(cè)組織、血清及經(jīng)過EDTA處理過的血液樣品、甚至變質(zhì)或腐敗的組織，靈敏度優(yōu)于當(dāng)時(shí)OIE推薦方法；該研究也結(jié)合了限制性內(nèi)切酶酶切的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析，省去了測(cè)序鑒定的步驟。同年，英國研究人員King[11]等也建立了針對(duì)ASFV VP72 基因序列的TaqMan熒光探針法，大幅提升了檢測(cè)靈敏度，縮短了檢測(cè)時(shí)間，可在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行結(jié)果的判定，省去了可能存在污染的瓊脂糖凝膠電泳的步驟，上述兩種方法也是當(dāng)前OIE推薦的方法。

熒光定量PCR方法與基于凝膠電泳的傳統(tǒng)PCR方法相比具有的明顯優(yōu)勢(shì)而被很多科研機(jī)構(gòu)所認(rèn)可。2007年，國內(nèi)學(xué)者李維彬等[12]建立了針對(duì)ASFV VP72基因序列的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，使用質(zhì)粒作為參比模板，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100個(gè)拷貝。2010年，郭少平等[13]針對(duì)ASFV K205R基因設(shè)計(jì)了引物和探針，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)質(zhì)粒模板的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10個(gè)拷貝。2009年，江彥增等[14]針對(duì)ASFV P72基因建立了LAMP的檢測(cè)方法，可在30 min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)質(zhì)粒模板的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到5個(gè)拷貝。2016年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的研究人員與瑞典、烏干達(dá)等國的研究人員聯(lián)合建立了一種新的熒光定量PCR方法，用于檢測(cè)ASFV VP72基因序列，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到60個(gè)拷貝[15]。除了熒光定量PCR方法外，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（RPA）等技術(shù)也有被應(yīng)用于ASFV核酸檢測(cè)的報(bào)道。2017年，哈登楚日亞等針對(duì)ASFV P72基因建立了RPA的檢測(cè)方法，在39 ℃、20 min內(nèi)即可檢測(cè)到10個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA模板[16]。

正是基于ASFV核酸檢測(cè)的儲(chǔ)備性研究，自2018年8月ASF傳入我國之后，國內(nèi)企業(yè)和相關(guān)研究機(jī)構(gòu)快速啟動(dòng)了ASFV核酸檢測(cè)產(chǎn)品研發(fā)，并快速推出了一系列的產(chǎn)品。2019年1月和6月，中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心先后兩次公布了非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果，最終34個(gè)核酸檢測(cè)產(chǎn)品通過了評(píng)價(jià)，包括28個(gè)熒光PCR類和6個(gè)等溫?cái)U(kuò)增類產(chǎn)品。其中，除了熒光PCR技術(shù)外，基于熒光探針法和PCR技術(shù)原理一些新的技術(shù)和工藝在這些產(chǎn)品中得到應(yīng)用，如免提取核酸技術(shù)、cPCR、微流控技術(shù)、LAMP、RPA、產(chǎn)物降解技術(shù)、凍干工藝等[6]。隨著國家推動(dòng)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)參與ASF的檢測(cè)并推動(dòng)屠宰和養(yǎng)殖企業(yè)建立檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自檢，核酸檢測(cè)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于ASF生物安全防控的各個(gè)環(huán)節(jié)。

當(dāng)前，ASFV核酸檢測(cè)試劑盒的廣泛應(yīng)用，一方面得益于核酸檢測(cè)試劑和工藝的研究成果，另一方面也得益于擴(kuò)增儀器的小型化和成本的降低；ASF疫情的暴發(fā)，使養(yǎng)殖企業(yè)和相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)核酸檢測(cè)平臺(tái)的建設(shè)高度重視，核酸檢測(cè)儀器、試劑盒的應(yīng)用空前普及，在ASF的診斷、監(jiān)控和復(fù)產(chǎn)過程中發(fā)揮了重要的作用，但檢測(cè)質(zhì)量還有很大的提升空間，樣品采集、樣品處理、核酸提取與純化、人員技術(shù)水平、操作環(huán)境的交叉污染等多種因素影響著核酸檢測(cè)技術(shù)的穩(wěn)定應(yīng)用。未來，在提升檢測(cè)的靈敏性和特異性的基礎(chǔ)上，提升產(chǎn)品操作的便捷性、可靠性將是ASFV核酸檢測(cè)產(chǎn)品研發(fā)的趨勢(shì)之一。

3 新技術(shù)在ASFV核酸檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用展望

當(dāng)前，qPCR技術(shù)是ASFV核酸檢測(cè)主流技術(shù)，但cPCR、LAMP、RPA等技術(shù)也顯示了強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)力，隨著生物技術(shù)和機(jī)電技術(shù)的發(fā)展，核酸診斷試劑的發(fā)展和相配套的儀器的發(fā)展相輔相成，眾多新的產(chǎn)品形式不斷涌現(xiàn)，但整體方向是向著更準(zhǔn)確和更便捷兩個(gè)方向發(fā)展。

dPCR是一種新型的核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，Wu Xulong等建立了ASFV核酸檢測(cè)的dPCR方法，檢測(cè)限可達(dá)10個(gè)拷貝/反應(yīng)，比實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度高10倍左右[17]，在ASFV傳播途徑分析和環(huán)境樣品的監(jiān)測(cè)均有重要的作用；雖然當(dāng)前dPCR技術(shù)所需的設(shè)備還比較昂貴，但隨著技術(shù)的發(fā)展，dPCR設(shè)備已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了國產(chǎn)化，未來的應(yīng)用成本將會(huì)進(jìn)一步降低。牛津納米孔測(cè)序技術(shù)也顯示出其在ASFV 核酸檢測(cè)方面的應(yīng)用潛力，O`Donnell等利用便攜式牛津納米孔測(cè)序儀結(jié)合ASF快速分析測(cè)序軟件（ASF-FAST），可在10 min內(nèi)快速從臨床樣本中進(jìn)行ASFV基因組測(cè)序分析，從而達(dá)到快速準(zhǔn)確診斷的目的[18]。

核酸提取和擴(kuò)增一體化技術(shù)是核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的另一個(gè)方向，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人醫(yī)檢測(cè)領(lǐng)域，如Cepheid公司的GeneXpert system、Atlas Genetics公司的io檢測(cè)平臺(tái)、BioFire公司的FilmArray、GenePOC公司的revogenne、北京博暉創(chuàng)新公司的GenPlex?等均可實(shí)現(xiàn)“樣品進(jìn)，結(jié)果出”。這些產(chǎn)品和技術(shù)平臺(tái)融合了微流控、凍干、恒溫?cái)U(kuò)增、電化學(xué)等在內(nèi)的多種技術(shù)和工藝，很好地解決了傳統(tǒng)核酸檢測(cè)方法試劑保存難和操作流程繁瑣的問題。

在獸醫(yī)領(lǐng)域，試劑和設(shè)備的成本是限制新技術(shù)推廣應(yīng)用的重要原因之一，如何降低試劑和設(shè)備的成本應(yīng)該是未來需要解決的問題。因獸醫(yī)診斷試劑市場(chǎng)容量較小，獸醫(yī)領(lǐng)域的核酸診斷試劑公司在新技術(shù)方面的投入較少，而擁有更多技術(shù)儲(chǔ)備的公司多集中在人醫(yī)領(lǐng)域。未來，二者的技術(shù)資源和市場(chǎng)資源整合或許能為獸醫(yī)領(lǐng)域核酸診斷試劑的發(fā)展提供機(jī)遇。此外，試劑工藝研發(fā)和POCT設(shè)備研發(fā)可加快核酸檢測(cè)產(chǎn)品在獸醫(yī)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，如核酸檢測(cè)試劑全預(yù)混凍干工藝[19]、便攜式核酸提取+擴(kuò)增一體機(jī)設(shè)備、生物傳感器技術(shù)[20]等可以大大降低基層獸醫(yī)人員進(jìn)行檢測(cè)操作的技術(shù)難度。

4 小結(jié)

ASF的暴發(fā)推動(dòng)了核酸檢測(cè)技術(shù)在畜牧業(yè)生物安全防控體系中的應(yīng)用。未來，提升行業(yè)技術(shù)人員操作水平的同時(shí)，構(gòu)建POCT化的核酸檢測(cè)平臺(tái)將是未來核酸檢測(cè)技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用的主要方向。