陳 堅(jiān) 陳 彬 鄭斯平 鄭益平 朱炳耀 鄭偉文

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 福州 350003)

水生蕨類植物滿江紅(Azolla)廣泛分布于溫帶和熱帶淡水生態(tài)系統(tǒng)。滿江紅俗稱紅萍、綠萍, 因富含氮素和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分, 在亞洲農(nóng)村被用作綠肥和飼料已有數(shù)百年歷史[1,2]。這種細(xì)小的植物繁殖快, 生物量高, 歸因于其葉腔中棲息著一種固氮藍(lán)藻。固氮藍(lán)藻是屬于革蘭氏陰性細(xì)菌的光自養(yǎng)原核生物, 故又稱藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterium)。與滿江紅共生的藍(lán)藻形態(tài)酷似念珠藻(Nostoc), 一般稱為滿江紅念珠藻(Nostoc azollae), 是由多個(gè)細(xì)胞串聯(lián)成的絲狀體, 含有營(yíng)光合作用的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和專司固氮的異形胞。異形胞含有編碼固氮酶的nif基因, 可將大氣氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的結(jié)合態(tài)氮, 以NH4的形態(tài)滿足宿主生長(zhǎng)對(duì)氮素的需求。宿主則以蔗糖為主的碳源作為回報(bào)[3,4]。研究表明, 添加結(jié)合態(tài)氮無助于滿江紅的生長(zhǎng), 甚至危及共生藍(lán)細(xì)菌的生存[1]。這是因?yàn)榻Y(jié)合態(tài)氮的存在不僅不利于藍(lán)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分化為固氮的異形胞, 而且會(huì)抑制異形胞的固氮功能[5—8]。

自20世紀(jì)70、80年代曾經(jīng)的“紅萍熱”以來, 本實(shí)驗(yàn)室和國(guó)內(nèi)外的研究機(jī)構(gòu)對(duì)滿江紅-藍(lán)細(xì)菌共生固氮的基礎(chǔ)生物學(xué)進(jìn)行了多年持續(xù)的研究, 發(fā)現(xiàn)并證實(shí)滿江紅在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了特殊構(gòu)造,專供藍(lán)藻棲息的葉腔和腺毛[9]。腺毛有兩種: 發(fā)生于滿江紅葉原基的初生分支腺毛(Primary branched hair, PBH; 由一個(gè)基細(xì)胞和多個(gè)端細(xì)胞組成)和形成于葉腔的次生單支腺毛(Secondary single hair, SSH;僅由一個(gè)基細(xì)胞和一個(gè)端細(xì)胞構(gòu)成)[10]。它們不僅是宿主與共生藻進(jìn)行氮、碳等物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞的特殊結(jié)構(gòu), 又是共生藻在滿江紅的無性繁殖階段從莖尖向葉腔, 從母體向幼體進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的紐帶; 也是共生藻在滿江紅的有性繁殖階段從莖尖向孢子果, 從親代向子代進(jìn)行垂直轉(zhuǎn)移的橋梁[4,11—13]。滿江紅的這些特殊構(gòu)造給共生藻以穩(wěn)定和封閉的生存空間, 讓蕨與藻終生相伴, 使兩者共生關(guān)系世代永續(xù)。這正是滿江紅有別于地球上現(xiàn)有的植物-微生物共生固氮體系的獨(dú)特之處[14]。隨著滿江紅及其共生藍(lán)藻全基因組測(cè)序的完成, 以滿江紅作為模式植物, 進(jìn)行植物-微生物相互作用和微生態(tài)研究已日益受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注[8,15,16]。

近30年來, 人們先后從滿江紅的葉腔發(fā)現(xiàn)并分離培養(yǎng)出其第三個(gè)共生伙伴——細(xì)菌。它們與固氮藍(lán)藻一起構(gòu)成了滿江紅葉腔內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)。而早在20世紀(jì)90年代, 6個(gè)國(guó)家9個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究者均以自然界的滿江紅作為研究滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的材料, 采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法, 從4個(gè)生物種的滿江紅中分離鑒定出9個(gè)屬15個(gè)種的內(nèi)生細(xì)菌[17,25]。本實(shí)驗(yàn)室鄭偉文等[12]用電子顯微鏡證明自然界的滿江紅和人工培養(yǎng)的無藻滿江紅均有伴生細(xì)菌。Nierzwicki等[20,21]應(yīng)用電鏡技術(shù)將滿江紅葉腔內(nèi)生細(xì)菌分為6個(gè)超微結(jié)構(gòu)類型。這些研究均從形態(tài)結(jié)構(gòu)方面反映了內(nèi)生細(xì)菌的多態(tài)性。進(jìn)入21世紀(jì)后,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步, 美國(guó)Raensallae大學(xué)的Lechno等[26]用rDNA-PCR 等方法從卡洲滿江紅的葉腔中分離鑒定出根癌農(nóng)桿菌、根瘤菌等4種細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)室鄭斯平等[27]用PCR-DGGE和電鏡技術(shù)對(duì)滿江紅的葉腔和孢子果內(nèi)細(xì)菌的進(jìn)行了檢測(cè)和觀察, 揭示了小葉滿江紅葉腔以變形菌門為主的多種可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)菌, 把對(duì)滿江紅內(nèi)生菌的表型多樣性的研究推進(jìn)了一步。隨后, 鄭斯平等[28]將小葉滿江紅的內(nèi)生菌經(jīng)16S rDNA-PCR擴(kuò)增后用T-RFLP技術(shù)和PAT軟件分析, 通過比對(duì)確定這些內(nèi)生菌屬于10科42屬。

本文報(bào)道用高通量測(cè)序和電子顯微鏡技術(shù)研究結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿江紅體內(nèi)以共生藍(lán)細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌群落的遺傳組成和物理結(jié)構(gòu)的影響, 及其對(duì)滿江紅形態(tài)建成的間接效應(yīng), 試圖為通過內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)進(jìn)而改變宿主的生長(zhǎng)發(fā)育提供新的線索與思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源與制備

本研究的實(shí)驗(yàn)材料為小葉滿江紅(Azolla microphyllaKaulfus), 早先從國(guó)際水稻研究所(International Rice Research Institute)引進(jìn), 原編號(hào)為IRRI 4018。

表面滅菌的滿江紅制備為了排除外源細(xì)菌等微生物的干擾, 參照白克智等[29]的莖尖培養(yǎng)法,略有修改, 具體如下: 取100 g(鮮重)在自然條件下生長(zhǎng)的萍體, 用自來水清洗, 去掉黏附的土壤等雜物, 細(xì)心剪去根系。后選取健康的萍體再用無菌水清洗。撈取洗凈的健康萍體, 置于滅菌的燒杯中,加入適量的0.1%升汞溶液, 將萍體浸沒, 用滅菌的鑷子連續(xù)攪拌3min30s, 使?jié)M江紅的葉、莖和幼根充分與溶液接觸, 以確保滅菌效果。隨后傾盡升汞溶液, 迅速用無菌水清洗經(jīng)滅菌的萍體, 至少清洗4次, 每次3min, 盡量洗去殘留在萍體上的升汞。在立體解剖鏡下用無菌的細(xì)針挑取并棄去包被莖尖的葉片, 僅保留莖尖分生組織和1—2個(gè)葉原基, 后投入滅菌的IRRI無氮培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)。IRRI培養(yǎng)液的配方為(mg/L): NaH2PO4·H2O 89; K2SO489.1;CaCl2·2H2O 147; MgSO4·7H2O 405.3; MnCl2·4H2O 1.8; Na2Mo2·2H2O 0.38; H3BO31.14; ZnSO4·7H2O 0.04; CuSO4·5H2O 0.04; CoCl2·6H2O 0,04; EDTAFe (FeSO4·7H2O 0.249, EDTA 0.261, KOH 0.157)。培養(yǎng)液ppH6.5。

無藻滿江紅的制備取以上述經(jīng)表面滅菌并洗凈的萍體, 將按上法剝離的莖尖分生組織逐個(gè)分別接入裝有Nickell培養(yǎng)液的三角瓶中培養(yǎng)。Nickell培養(yǎng)液的配方是(mg/L): KNO3202; KCl 150;KH2PO4 136; Cu(NO3)2·4H2O 708; CaCl2167;MgSO4·7H2O 246; MgCl296; H3BO30.1; MnSO4·4H2O 0.1; ZnSO4·4H2O 0.3; CuSO4·5H2O 0.1; Na2MoO4·2H2O 0.1; EDTA-Na2370; FeSO4·7H2O 280。培養(yǎng)液pH 6.5。

以上操作均在本研究所組培實(shí)驗(yàn)室的無菌環(huán)境下(蘇凈SW-CJ-2F型)完成。培養(yǎng)條件為: 26℃/18℃(日/夜), 光強(qiáng)550 μmol/(m2·s)。10—15d更新培養(yǎng)液。待繁殖足量后分別稱取樣品用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2 掃描電鏡樣品制備與觀察

選取上述滿江紅植株的營(yíng)養(yǎng)體, 在解剖鏡下細(xì)心去除根系后, 將剝離的萍體用2.5%戊二醛溶液(0.1 mol/L磷酸緩沖液, pH7.4)在室溫下固定4h, 用同樣的磷酸緩沖液洗滌3次后, 用2%鋨酸在4℃下固定2h, 又經(jīng)磷酸緩沖液充分洗滌后, 用乙醇逐級(jí)脫水, 并經(jīng)環(huán)氧丙烷替換兩次。試樣用HCP-2型臨界點(diǎn)干燥器干燥, 將經(jīng)干燥的樣品黏附于銅臺(tái)上,在高倍解剖鏡下用細(xì)針解剖, 使?jié)M江紅葉腔內(nèi)的微生物群落充分暴露, 再用IB-5型離子濺射儀噴鍍鉑鈀, 用JEOL JSM-6380lv 型掃描電子顯微鏡觀察并拍片, 加速電壓15 KV。

1.3 滿江紅DNA提取與16S rRNA基因和nif基因的PCR擴(kuò)增

采用DNA提取試劑盒(上海生工) 和說明書的操作步驟提取樣本的DNA, 用0.7%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)檢測(cè)所提取DNA的完整性。

以提取的滿江紅基因組DNA為模板, 在ABI GeneAmp?9700型反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。細(xì)菌16S rDNA引物為: 338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′), 806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′), 反應(yīng)體系20 μL, 包含: 4 μL的5×FastPfu Buffer; 2 μL的2.5 mmol/L dNTPs; 各0.8 μL的正向擴(kuò)增引物 (5 μmol/L) 及反向擴(kuò)增引物(5 μmol/L); 0.4 mL TransStartFastPfu聚合酶; 0.2 μL BSA; 10 ng模板 DNA; 補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性3min, 27循環(huán)(95℃變性30s, 55℃退火45s, 72℃延伸1.5min); 72℃延伸 10min。

nif基因的擴(kuò)增引物為nifH-F(5′-AAAGGYGG WATCGGYAARTCCACCAC-3′),nifH-R(5′-TT GTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)。PCR反應(yīng)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性3min, 35循環(huán)(95℃變性20s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min), 72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 委托上海美吉生物科技有限公司用Illumina的MiSeq測(cè)序儀對(duì)rRNA基因的擴(kuò)增序列進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

用Flash軟件對(duì)Miseq測(cè)序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接, Trimmomatic軟件對(duì)拼接序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾, 獲得高質(zhì)量的Tags序列。在Usearch(vsesion 7.0)平臺(tái), 按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類單元(Operation taxonomic unit, OTU)聚類, 在聚類過程中去除嵌合體, 得到OTU的代表序列。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息, 基于silva數(shù)據(jù)庫(kù), 采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析, 并分別在從域(Domain)到種(Species)各個(gè)分類學(xué)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。分析在美吉生物科技有限公司的生物云平臺(tái)(i-sanger)上完成。

2 結(jié)果

2.1 表面無菌的含藻滿江紅與無藻滿江紅的獲得與驗(yàn)證

得到植株表面無外源微生物污染, 但葉腔仍含有共生藍(lán)藻(下稱symbiont或cyanobiont)為優(yōu)勢(shì)種的內(nèi)生細(xì)菌群落的滿江紅樣本是進(jìn)行本研究的前提。參照白克智[29]的方法, 經(jīng)過近2個(gè)月的莖尖組織培養(yǎng), 取得了在IRRI無氮培養(yǎng)液正常生長(zhǎng)的小葉滿江紅群體, 成功率為10%。驗(yàn)證方法有三: (1)培養(yǎng)60d后, 培養(yǎng)液潔凈通透, 未見污染; (2)用掃描電鏡隨機(jī)檢查10株萍體及其根系, 萍體葉片, 尤其是根毛間隙未見到任何細(xì)菌(圖 1), 而葉腔中以共生藍(lán)細(xì)菌為主的內(nèi)生細(xì)菌群落與自然界的滿江紅葉腔菌落無異(圖 3)而在自然條件下生長(zhǎng)的滿江紅,可見細(xì)菌附著于植株, 尤其是根表皮細(xì)胞(圖 1)。通過莖尖組織培養(yǎng)也取得了在Nickell富氮培養(yǎng)液健康生長(zhǎng)的萍體。成功率為5%。驗(yàn)證方法同上。即培養(yǎng)60d后, 結(jié)合態(tài)氮豐富的Nickell培養(yǎng)液依然澄清潔凈, 葉片和根表未見微生物存在, 且葉腔內(nèi)未見Nostoc azollae存在的跡象(參見2.2); (3)用nifHPCR和測(cè)序檢測(cè)(詳見2.3和2.4)。電鏡觀察和nifHPCR檢測(cè)結(jié)果均表明本研究采用的方法是成功的。本文將表面無菌、葉腔中含有以Nostoc azollae為優(yōu)勢(shì)的微生物群落、nifH-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的滿江紅, 簡(jiǎn)稱為含藻滿江紅(Azollawith symbiont), 葉腔中未見共生藻且測(cè)序檢測(cè)無Nostoc azollae者即稱為無藻滿江紅(symbiont-freeAzolla)。

圖 1 滿江紅根部表面的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 1 Images of the root surface of Azolla by SEM

氮素對(duì)滿江紅表觀形態(tài)的建成有明顯的影響。如圖 2所示, 在無氮條件下生長(zhǎng)滿江紅樣品(AmA)的萍體大小和葉片間距分別比無藻滿江紅(AmB)大約20%和15%。而后者背葉裂片上的乳頭狀突起(papillae)明顯凸起, 前者卻略顯扁平。用掃描電鏡對(duì)葉腔的觀察表明: 添加結(jié)合態(tài)氮并不影響滿江紅葉腔和腺毛的發(fā)生, 但對(duì)其中存在的共生藍(lán)藻Nostoc azollae卻發(fā)生了可鑒別的變化, 即在自然及無氮生長(zhǎng)條件下明顯可見的共生藍(lán)藻全部消失。

2.2 含藻滿江紅與無藻滿江紅葉腔微生物群落的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

利用掃描電鏡對(duì)含藻滿江紅與無藻滿江紅葉腔中微生物群落的形態(tài)做進(jìn)一步觀察(圖 3—6), 可以看到兩者有如下差別: (1)含藻滿江紅葉腔中以Nostoc azollae為優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生菌占據(jù)了大部分的可用空間。由異形胞(小五星標(biāo)志)和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞組成的藍(lán)藻絲狀體纏繞于葉腔約15個(gè)單支腺毛細(xì)胞之間,并彼此連接成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu); 在其幼葉(葉齡為第2到第5葉),葉腔內(nèi)的細(xì)菌大多附著于藍(lán)藻細(xì)胞上, 或彼此聚集形成類似生物被膜(biofilm)的構(gòu)造, 厚度約1 μm。眾多的藍(lán)藻和細(xì)菌細(xì)胞包埋在由多種分泌物構(gòu)成的基質(zhì)中(大星形標(biāo)志, 圖 4)。在成熟的葉腔(葉齡一般在在第6—7葉以上, 此時(shí)葉腔開口完全封閉) 藍(lán)藻和細(xì)菌等微生物與葉腔內(nèi)的腺毛緊密結(jié)合, 形成一個(gè)大小與葉腔相適配的橢球形藻囊(Algal pocket), 外由一層約50 nm的薄膜包裹(圖 6)。打開藻囊, 可見腺毛和藻、菌等相互交織, 形成多層次、多種結(jié)構(gòu)的生物被膜, 厚度可達(dá)2—5 μm(另文報(bào)道); (2)無藻滿江紅的從幼葉到老葉, 除了環(huán)繞在葉腔周圍的腺毛外, 均未見Nostoc azollae。在低倍放大的電鏡視野中, 葉腔基本是中空的(圖 3)。在高倍放大的電鏡視野中, 可以看到形態(tài)各異的細(xì)菌附著于無藻滿江紅葉腔的腺毛細(xì)胞表面或分散在葉腔內(nèi)壁上, 但未見生物被膜存在, 更沒有形成藻囊結(jié)構(gòu)(圖 5)。

圖 2 含藻滿江紅(a)與無藻滿江紅(b)的表觀形態(tài)(掃描電鏡照片, 標(biāo)尺=1 mm)Fig. 2 The morphological appearance of Azolla with the symbiont(a) and symbiont-free Azolla (b) by SEM (Scale bar=1 mm)

2.3 內(nèi)生微生物的16S rRNA和nifH基因的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用基因組試劑盒對(duì)含藻和無藻滿江紅提取總DNA, 分別以細(xì)菌的16S rRNA基因和nifH基因的區(qū)段設(shè)計(jì)引物, 以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果由圖 7可見: 泳道1—4均在500 bp附近擴(kuò)增出單一的DNA條帶, 表明在滿江紅的培養(yǎng)基中無論是否添加氮素, 其內(nèi)生的細(xì)菌群落均具有16S rRNA基因和nifH基因區(qū)域的特異性擴(kuò)增。

2.4 滿江紅內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因和nifH基因擴(kuò)增產(chǎn)物樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)

對(duì)分別在無氮和富氮兩種培養(yǎng)模式下的滿江紅樣本不同細(xì)菌群落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量的測(cè)序分析, 將得到的代表16S rRNA基因和nifH基因區(qū)段的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)總結(jié)在表 1中。

圖 3 掃描電鏡照片顯示結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿江紅莖尖區(qū)域共生藻的抑制效應(yīng)Fig. 3 The inhibitory effect of conbined nitrogen on the symbionts at the apical region of Azolla frond analyzed by SEM

圖 4 含藻滿江紅葉腔剖面的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 4 The profile of the fourth leaf cavity within the Azolla with symbiotic caynobacteria by SEM

由表 1可見: 通過對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的可變區(qū)和固氮菌nifH基因區(qū)段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序, 對(duì)讀取的序列PE reads進(jìn)行拼接, 質(zhì)控和過濾后, 獲得標(biāo)簽Tags序列。從生長(zhǎng)于無氮培養(yǎng)基的滿江紅樣品(AmA)以及生長(zhǎng)于富氮培養(yǎng)基的滿江紅樣品(AmB)所得到的標(biāo)簽序列的數(shù)量, 堿基數(shù), 序列的平均長(zhǎng)度及長(zhǎng)度范圍比較而言, 兩者間差異并不大, 即使有所差異也無實(shí)際意義。但在Usearch(vsesion 7.0)平臺(tái), 按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類單元(Operation taxonomic unit, OTU)聚類后, 可以看出, 在富含結(jié)合態(tài)氮的Nickell培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的滿江紅(AmB), 其基于≥97%的相似度水平, 通過聚類分析共獲得的有效OTUs的數(shù)目大幅度的減少, 其中以16S rRNA基因?yàn)闃?biāo)記的OTU減少了53%; 以nifH基因標(biāo)記的OTU減少了64%。由于IRRI培養(yǎng)基和Nickell培養(yǎng)基除氮素外, 其余培養(yǎng)成分基本相同。測(cè)序結(jié)果表明: 結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿江紅內(nèi)生細(xì)菌無論是總菌群和固氮菌群的多樣性的減少起到了關(guān)鍵的作用。

2.5 含藻滿江紅與無藻滿江紅的細(xì)菌群落組成

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的細(xì)菌物種的分類信息, 基于silva數(shù)據(jù)庫(kù), 采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,分別在各個(gè)分類學(xué)水平: Domain(域)、Kingdom(界)、Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)、Species(種)統(tǒng)計(jì)出各樣本的群落組成,在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析。

圖 5 無藻滿江紅第四葉葉腔橫剖面的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 5 The cross profile of the fourth leaf cavity of the cyanobiontfree Azolla by SEM

圖 6 含藻滿江紅第七葉葉腔剖面掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 6 The profile of the seventh leaf cavity within Azolla with the symbiont by SEM

圖 7 滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig. 7 PCR products amplified from endophytic bacteria of Azolla

對(duì)16S rRNA基因標(biāo)記的全細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)分析表明(圖 8): 生長(zhǎng)在無氮和富氮兩種培養(yǎng)條件下的滿江紅葉腔中細(xì)菌群落的組成差異很大。在無氮條件下生長(zhǎng)的滿江紅(AmA)中檢出17個(gè)OTU, 分屬于4門: 藍(lán)藻門Cyanobacteria(52.5%)、變形菌門Proteobacteria(47.4%)、硬壁菌門Firmicutes(0.059%)和擬桿菌門Bacteroidetes(0.0016%)。有2個(gè)OTU分別屬于藍(lán)細(xì)菌菌門Cyanobacteria的藍(lán)細(xì)菌目(10.44%)和未命名的Subsection IV目; 有11個(gè)分別屬于變形菌門中的草螺菌屬Herbspirillum(28.54%)、Niveispirillum菌屬(6.78%)和根瘤菌屬Rhizobium(4.42%);以及乳酸桿菌屬Lacibacterium、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、大腸桿菌志賀菌屬Escherichia-Shigella、嗜甲烷菌屬M(fèi)ethylophilus、紅螺菌屬Rhodospirillales和假單胞菌屬Pseudomonas; 有3個(gè)屬于厚壁菌門Firmicutes的小桿菌屬Dialister(嗜血桿菌族)、鏈球菌屬Streptococcus和糞便桿菌Faecalibacterium。還有1個(gè)屬于擬桿菌Bacteroidetes中Bacteroides屬。而添加氮營(yíng)養(yǎng)明顯降低了滿江紅內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。其內(nèi)生細(xì)菌種類明顯減少, 為8個(gè)OUTs, 分屬于4門。即藍(lán)藻門Cyanobacteria(86.79%), 均屬于藍(lán)藻目Cyanobacteria, 其余為變形菌門(13.12%)、放線菌門(0.061%)和厚壁菌門(0.038%)。與AmA相比, 屬于未命名Section Ⅳ目的藍(lán)細(xì)菌消失了。此外, 添加結(jié)合態(tài)氮也降低了變形菌門細(xì)菌的多樣性,其中具有固氮能力的草螺菌(Herbaspirillum)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等屬的細(xì)菌基本消失, 而假單胞菌(Pseudomonas)屬的成員成了優(yōu)勢(shì)菌(12.9%)。前三者菌在AmA中分別占有28.6%、6.7%和4.4%; 后者僅占3.67%。

表 1 不同滿江紅樣本的兩種細(xì)菌基因擴(kuò)增區(qū)段的測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab. 1 The summarized sequencing data of amplified fragments of two bacteria genes from different Azolla samples

圖 8 兩種滿江紅樣品16S rRNA基因的內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的群落豐度的百分比Fig. 8 Percent of community abundance of the endophytic bacteria in two Azolla samples based on 16S rRNA gene at genus level

2.6 nifH基因鑒別的內(nèi)生菌群落組成

16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明, 在富氮培養(yǎng)基生長(zhǎng)的無藻滿江紅樣品(AmB)中仍檢出了藍(lán)細(xì)菌, 且占優(yōu)勢(shì)。這些藍(lán)細(xì)菌是否固氮的Nostoc azollae? 本研究對(duì)固氮酶基因nifH的檢測(cè)給出了答案。

測(cè)序結(jié)果表明, 從含藻滿江紅樣品(AmA)中得到36959條序列, 而無藻滿江紅(AmB)也得到38869條序列。但兩者間的微生物的可操作分類單元(OTU)明顯不同, 前者nifH測(cè)序序列形成14個(gè)細(xì)菌的OTU, 滿江紅共生體的nifH基因主要來自藍(lán)藻門, 變形菌門和未知細(xì)菌的門類。其中藍(lán)藻門的nifH基因的細(xì)菌群落占了88.44%的優(yōu)勢(shì), 劃分到種屬水平均為滿江紅的共生藍(lán)藻Nostoc azollae, 變形菌門中含有nifH基因的細(xì)菌群落占了11.32%, 包括固氮的草螺菌(Herbaspirillum)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)。在門水平無法認(rèn)定的固氮菌為0.23%。后者僅有5個(gè)OTUs, 來自變形菌門(99.71%)和未知門類的細(xì)菌(0.29%),Pseudomonasstutzeri占99.54%, 還有0.16%含有nifH基因的細(xì)菌落無法認(rèn)定到綱的水平。值得注意的是藍(lán)藻門的nifH基因未檢出。這就是說從無藻滿江紅(AmB)16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢出的藍(lán)藻并不是固氮的Nostoc azollae(圖 9)。

3 討論

3.1 結(jié)合態(tài)氮對(duì)Nostoc azollae的抑制效應(yīng)

自從白克智等[29]開發(fā)出莖尖培養(yǎng)技術(shù)以來, 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室略加改進(jìn)后一直用此法獲得無藻滿江紅。比較IRRI和Nickelle培養(yǎng)液的化學(xué)組成, 兩者的主要差別在后者含有較多的結(jié)合態(tài)氮[KNO3,Ca(NO3)2], 表現(xiàn)出對(duì)共生藍(lán)藻的顯著抑制作用。為此我們通過剝離包裹共生藍(lán)藻的幼葉, 讓Nostocazollae與和Cu2+充分接觸。據(jù)我們觀察, 附著于莖尖的藍(lán)藻藻殖段(Homogonia)并不含異形胞(圖 3), 且生命力強(qiáng)。如不將之充分暴露于它們可能存活下來。Li Fay-Wei等[8]報(bào)道, 在培養(yǎng)液中添加NH4NO3可使?jié)M江紅體內(nèi)的共生藍(lán)藻消失,以致無法用PCR檢出nifH。我們也曾做了同樣的嘗試, 但經(jīng)過連續(xù)的繼代培養(yǎng)后其共生藍(lán)藻又“復(fù)活”了。而在Nickelle培養(yǎng)液生長(zhǎng)的無藻滿江紅投入無氮的IRRI培養(yǎng)液則難以存活。這說明在結(jié)合態(tài)氮的“壓力”下, 滿江紅葉腔中絕大部分的藍(lán)藻消失了,但仍有極少數(shù)的藍(lán)藻細(xì)胞存活下來。

圖 9 兩種滿江紅樣品含nifH基因細(xì)菌在屬水平的群落豐度的百分比Fig. 9 Percent of community abundance of the endophytic bacteria in two Azolla samples based on nifH gene at genus level

值得指出的是, 在無藻滿江紅體內(nèi)盡管未檢出固氮的Nostoc azollae, 但仍有相當(dāng)數(shù)量其他不固氮的藍(lán)藻存在。這一結(jié)果顛覆了長(zhǎng)期以來的人們關(guān)于滿江紅的內(nèi)生藻就是Nostoc azollae的認(rèn)知。我們?cè)脽晒怙@微鏡和電鏡觀察到葉腔中無異形胞的藍(lán)藻(另文報(bào)道)。所以嚴(yán)格說來, 所謂含“藻”滿江紅和無“藻”滿江紅嚴(yán)格地說應(yīng)是含Nostoc azollae和不含Nostoc azollae的滿江紅。而以往文獻(xiàn)中常用的Azolla-Anabaenasymbiosis 或Azolla-Nostocsymbiosis的提法也值得推敲。

3.2 結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿江紅葉腔中微生物群落組成的影響

本研究用I11umina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌的rRNA基因的可變區(qū)進(jìn)行了序列測(cè)定。這在很大程度上提高了對(duì)細(xì)菌群落組成進(jìn)行定性與定量的精確度。通過序列的算法分析, 在聚類過程中去除嵌合體, 可以比較準(zhǔn)確地得到OTU的代表序列,從而比較精確地確定其對(duì)應(yīng)的物種信息, 還可以依據(jù)測(cè)序序列read的數(shù)量, 統(tǒng)計(jì)它們的相對(duì)豐度。

本研究結(jié)果再次證明, 在無氮條件下生長(zhǎng)的小葉滿江紅(A. microphylla)含有數(shù)量和種類眾多的以藍(lán)細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌。用高通量測(cè)序技術(shù)檢出了橫跨四個(gè)門類的細(xì)菌, 僅變形菌門就有11個(gè)屬,還有大量不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類, 目前為止從滿江紅中檢出細(xì)菌的門類最多。本實(shí)驗(yàn)室鄭斯平等[28]用T-RFLP技術(shù)和PAT軟件, 分析結(jié)果表明從小葉滿江紅中有41個(gè)屬的細(xì)菌, 但大部分屬于變形菌門。Laerua等[30]用宏基因組測(cè)序技術(shù)和相關(guān)軟件分析,從蕨狀滿江紅(A. filiculoides)也檢出以Nostoc azollae為優(yōu)勢(shì)(60%—75%), 包括變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的內(nèi)生細(xì)菌。這兩種滿江紅內(nèi)生菌的主要類群相似。

值得注意的是, 我們?cè)诤鍧M江紅葉腔中除了固氮的Nostoc azollae外, 也檢出了固氮草螺菌(Herbasprillium)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等固氮細(xì)菌。Laerua等[30]也報(bào)道了包括蕨狀滿江紅和小葉滿江紅在內(nèi)的地球上現(xiàn)存的7種滿江紅葉腔中均有根瘤菌(Rhizobium)存在, 但沒有說明是否有其他固氮細(xì)菌或藍(lán)細(xì)菌被檢出。至于在用Nickell培養(yǎng)液培養(yǎng)的萍體樣品中nifH基因來自Pseudomonasstutzeri, 其潛在作用有待進(jìn)一步研究。

如上所述, 無藻滿江紅均未檢出固氮的Nostoc azollae以及固氮草螺菌(Herbasprillium)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等固氮細(xì)菌。由于缺乏這些原先可以提供結(jié)合態(tài)氮的微生物, 勢(shì)必顛覆無藻滿江紅及內(nèi)生細(xì)菌的氮代謝通路, 從而從根本上改變內(nèi)生細(xì)菌的群落構(gòu)成。由于內(nèi)源氮素基本被切斷, 其內(nèi)生菌種類和數(shù)量的變化在所難免。

3.3 結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿江紅表型結(jié)構(gòu)的影響

從形態(tài)學(xué)的角度來看, 結(jié)合態(tài)氮導(dǎo)致共生藻Nostoc azollae從滿江紅葉腔內(nèi)消失, 進(jìn)而使與Nostoc azollae共存的內(nèi)生菌數(shù)量種類明顯減少, 未能形成生物被膜和藻囊。生物被膜(Biofilm)是多種微生物聚集并包埋在自身分泌的胞外高分子基質(zhì)(Extracellular polymeric substances, EPS)中的一種構(gòu)造, 其性質(zhì)完全不同于自由散在的微生物細(xì)胞群體[31]。本研究揭示的滿江紅葉腔中的生物被膜可能比一般所稱的生物被膜更為復(fù)雜。因?yàn)槌怂{(lán)藻、細(xì)菌等微生物外, 它還包含真核宿主的腺毛細(xì)胞及其分泌物。這種生物被膜的形成和發(fā)生不僅有利于微生物自身的生長(zhǎng)繁衍和物質(zhì)、信息交換,也勢(shì)必對(duì)宿主滿江紅的生長(zhǎng)發(fā)育乃至抗逆等方面都會(huì)有正面的促進(jìn)作用。藻囊是迄今為止植物共生固氮體系中最為特殊的共生結(jié)構(gòu)。它作為腺毛、藍(lán)藻、細(xì)菌等多種微生物相互交織、互利互惠、可實(shí)現(xiàn)囊內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的相對(duì)獨(dú)立的實(shí)體結(jié)構(gòu), 又通過腺毛與宿主進(jìn)行物質(zhì)和信息交換, 形成錯(cuò)綜復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò)。這是無藻滿江紅無可比擬的。所以含藻滿江紅個(gè)體比無藻滿江紅大且肥厚就不足為奇了。

總的來說, 結(jié)合態(tài)氮把Azolla-Nostoc azollae共生固氮體系還原為“純粹”的蕨體。原先互惠互利的碳氮代謝通路已不復(fù)存在。無藻滿江紅需要依賴外源結(jié)合態(tài)氮才能存活。從表觀上看, 無藻滿江紅個(gè)體變小了, 葉片因?yàn)槿鄙僭迥叶兊酶熬o湊”了, 甚至連葉表的乳頭狀突起也有某種程度的“修飾”。這啟示我們: 通過改變植物的共生伙伴和內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)有可能改變植物的表型和生存方式。深入探討和比較含藻滿江紅與無藻滿江紅的生長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及其影響因子的分子機(jī)制, 有望為作物增產(chǎn)和品質(zhì)改良提供新的線索和思路。