李 樾，袁 智，劉 麗

(1.湖北工程學院 新技術學院，湖北 孝感 432000；2.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

浮游病毒(Virioplankton)是指懸浮在水層中各類病毒的總稱，一般呈長短尾蝌蚪形、紡錘形、球形等形態(tài)[1-4]，噬菌體與噬藻體是其主要類群[5]。研究表明浮游病毒對引起水華現(xiàn)象的浮游藻類具有控制作用[6-7]，浮游病毒研究已經(jīng)成為科學家研究的熱點。傳統(tǒng)方法很難對浮游病毒多樣性、病毒動態(tài)變化及未知病毒進行全面的了解，而宏基因組技術的出現(xiàn)為病毒的檢測及微生物遺傳多樣性分析提供了新方法。病毒宏基因組學(Viral metagenomics)不需要已知核酸序列，而是直接以病毒樣品的總核酸為研究對象，可以快速鑒定樣品中病毒物種，既豐富了病毒庫數(shù)據(jù)，也對病毒檢測、病毒多樣性、實時監(jiān)測病毒動態(tài)數(shù)據(jù)等研究具有重要的價值[8]。病毒宏基因組技術在醫(yī)學等領域[8-9]和環(huán)境體系[10-11]顯示出巨大的優(yōu)越性，對病毒的物種組成、系統(tǒng)研究、疾病預防及通過基因水平轉移發(fā)現(xiàn)病毒與宿主的互相作用具有重要意義。

本文回顧并比較了浮游病毒多樣性研究的相關分子技術發(fā)展及優(yōu)缺點，綜述了近年來基于宏組技術在浮游病毒多樣性研究中的應用，為不同環(huán)境中未知病毒的識別提供數(shù)據(jù)支撐，為水生態(tài)系統(tǒng)的污染防治提供科學依據(jù)，從而豐富我國水生態(tài)病毒學的理論體系。

1 遺傳多樣性研究的分子技術

研究人員發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性越高的物種，對環(huán)境和氣候變化的適應能力就越強，分布的范圍也越廣[12]。遺傳多樣性的研究有助于完善物種分類、分析進化關系、探究與宿主互作機制等[13]。目前，應用于浮游病毒多樣性研究的分子技術主要包括克隆文庫分析法、核酸探針技術、基因芯片和宏基因組文庫等。

克隆文庫分析法是提取樣品總DNA，設計引物進行PCR 擴增、連接、克隆、測序后與已知的數(shù)據(jù)庫中序列比對，通過系統(tǒng)發(fā)育分析研究浮游病毒群落多樣性?？寺∥膸鞈迷谌郝涠鄻有匝芯恐行枰⒁庥袕V泛的通用分子標記基因，而高度差異性的病毒類群因缺乏通用的分子標記基因導致最終分析結果有誤。常用的靶基因主要有病毒衣殼組裝蛋白的g20基因[14-15]、DNA聚合酶基因[16]、編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應中心蛋白的光合基因psbA[17-21]等。由于病毒的種類較多而g20基因僅存在于肌尾病毒中、DNA聚合酶基因主要存在于短尾病毒中、psbA基因廣泛存在于短尾病毒和肌尾病毒中，因此g20基因、DNA聚合酶基因、psbA基因作為遺傳多樣性的標記基因在多樣性研究存在一定局限性[22]。

核酸探針檢測技術是一種通過特異性核酸探針檢測樣品中待測靶序列的方法。其中，核酸探針通常選用放射性同位素或熒光染料作為標記。該技術具備靈敏性和特異性高的特點，從而被廣泛應用于多樣性研究中。Wommack等[1]基于此技術對切薩皮克海灣的浮游病毒群落結構的動態(tài)性質分析，發(fā)現(xiàn)浮游病毒通過基因轉移方式影響其宿主的遺傳多樣性。應用此技術的局限性是特異性標記的探針須為病毒數(shù)據(jù)庫的已知序列，因此不能挖掘新的病毒基因且難以獲得全面的遺傳多樣性數(shù)據(jù)[5]。

基因芯片又稱生物芯片，是一種微量分析技術，是將標記的樣品與固定在支持物上的大量探針分子雜交，通過檢測雜交信號的強度分析樣品相關信息，可同時實現(xiàn)對樣品分子的大規(guī)模檢測分析。此方法的缺點是標記的探針須為病毒數(shù)據(jù)庫的已知序列，因此也不能發(fā)現(xiàn)新的病毒基因。

宏基因組(Metagenome)概念由威斯康辛大學的Handelsman等在1998年提出，指自然界特定環(huán)境中全部微生物遺傳物質總和[23]。宏基因組學(metagenomics)是研究環(huán)境樣品中所包含的全體微生物的遺傳物質組成、群落結構功能的研究手段。因其通過對微生物的核酸物質進行測序來分析微生物群落物種組成與功能多樣性，所以又稱微生物環(huán)境基因組學。值得注意的是隨著該方法的應用及生命科學的發(fā)展，不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物的認知與研究不再是困擾學者的難題。因為宏組技術不再需要依賴于微生物分離培養(yǎng)技術[24-32]。

2 病毒宏基因技術研究進展

2.1 病毒宏基因組技術

病毒宏基因組學是基于宏基因組學技術而發(fā)展的一個新的學科分支，又稱宏病毒組學。該技術有一套科學的流程，包括病毒樣品總核酸提取、測序文庫構建、高通量測序、生物信息學分析。必須注意的是宏病毒組建庫測序不同于一般的宏基因組技術，需要對病毒顆粒進行富集。筆者在應用宏組技術探究不同湖泊中浮游病毒多樣性差異的流程如圖1所示，基于此技術對病毒的物種組成和功能注釋分析不同環(huán)境中的病毒群落結構及功能，發(fā)現(xiàn)高原湖泊中浮游病毒遺傳多樣性十分豐富，且存在大量未知病毒。

圖1 病毒宏基因組學技術分析流程

病毒宏基因組學在探究未知病毒、追溯病原、疾病預防等方面具有重要實用價值。先前的病毒調查結果表明病毒具有豐富的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)約60%～99%的環(huán)境病毒序列與病毒數(shù)據(jù)庫無同源性[33-35]。2007年，Bench等[36]基于宏病毒方法對切薩皮克灣的浮游病毒分析發(fā)現(xiàn)該地區(qū)含有大量未知浮游病毒序列(僅與環(huán)境序列同源)和新序列(無顯著同源)，并表明dsDNA病毒可能是生物圈中未知的遺傳多樣性的最為豐富種群之一。Ng等[33]在2009年對佛羅里達綠海龜纖維乳頭瘤組織構建宏組文庫分發(fā)現(xiàn)了一株新型的單鏈DNA病毒，表明病毒宏基因組技術直接從樣品中發(fā)現(xiàn)新病毒方面的潛力，增加了我們對病毒進化和多樣性的理解。Willner等[37]應用此技術首次研究患有呼吸道疾病人群和健康人群的病毒群落，發(fā)現(xiàn)呼吸道患者中的病毒多樣性很低。2010 年，Coetzee 等[38]提取南非葡萄園中感染病毒葡萄藤的遺傳物質進行深度測序分析，發(fā)現(xiàn)新病毒的存在和4株已知的病毒病原體。Donaldson等[39]利用此技術對北美地區(qū)一個廢棄鐵路隧道中蝙蝠的糞便、口腔、尿液和組織樣本分析發(fā)現(xiàn)7-10個種屬蝙蝠群落，還發(fā)現(xiàn)許多昆蟲病毒、植物病毒和一株新型冠狀病毒，表明蝙蝠是病毒傳播途徑之一。Day等[40]對患病火雞腸道內RNA病毒測序后數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)許多病毒同源序列。

2.2 宏病毒組技術在浮游病毒多樣性研究中的應用

大量的研究表明浮游病毒不僅具有調節(jié)宿主群落結構的作用，還能夠通過基因水平轉移影響生物地球化學循環(huán)[41-43]。不同自然條件下不同浮游病毒群體之間具有一定的差異，海洋和淡水等水域中的浮游病毒已經(jīng)成為生態(tài)學研究的重點課題。

2002年，Breitbart等[44]首次應用宏組技術對美國加州的2處沿海區(qū)域浮游病毒群落分析，結果表明海洋中病毒群落多樣性非常豐富，大約包含374至7114種病毒類型。Angly等[45]基于此技術對來自北冰洋、不列顛哥倫比亞的海岸、墨西哥灣和馬尾藻海的184個海洋病毒群落結構及分布特征進行研究，發(fā)現(xiàn)病毒物種組成存在地域性差異，病毒多樣性很高且在低緯度地區(qū)更豐富。2004年，Breitbart等[24]將宏組技術與數(shù)學模型相結合對近岸區(qū)域的海洋沉積物病毒群落分析，結果表明海洋沉積物病毒群落是遺傳多樣性最豐富的生物群體之一，且每1 kg沉積物中至少有104個病毒基因型。2009年，Sharon等[46]比較分析已知的海洋病毒生物群落和宏基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)構成藍藻光合系統(tǒng)I的基因序列存在于噬藻體的基因組中，揭示了其在病毒生命周期中的獨特功能。塔拉海洋探險隊[47]歷經(jīng)兩年半的時間，對采集的表層及中層海水的海洋病毒調查發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性豐富，經(jīng)過分析鑒定揭示了巨病毒科病毒和卵菌之間的橫向基因轉移聯(lián)系，表明宏基因組序列分析有望為海洋病毒的生物多樣性及其與潛在宿主的相互作用提供新的線索。2015年，汪儉[48]基于宏組技術探究我國的北黃海海洋病毒群落特征發(fā)現(xiàn)肌尾病毒科病毒豐度最高，經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)許多未知病毒序列。2016年，夏駿等[49]基于此技術分析我國渤海的海洋病毒群落特征，經(jīng)分析均發(fā)現(xiàn)海水中肌尾病毒科病毒豐度最高且渤海地區(qū)秋季浮游病毒多樣性高于冬季。2017年，Claire等[50]持續(xù)八年時間研究分析南極半島西部(WAP)沿海地區(qū)的浮游病毒豐度變化規(guī)律及其驅動因素，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域具有明顯的季節(jié)性周期變化且夏季豐度最高，推斷是浮游細菌的變化導致的浮游病毒的年際差異。

宏基因組學極大地擴展了已知的病毒圈，但淡水病毒的多樣性仍然知之甚少，主要集中在黃石溫泉、南極湖、撒哈拉沙漠淡水池塘、我國臺灣的水庫等。2008年，Schoenfeld等[51]首次基于此技術對黃石公園兩個堿性溫泉(74 ℃和93 ℃)的嗜熱病毒研究，發(fā)現(xiàn)其病毒多樣性與中溫環(huán)境相似性較高，與陸地分離的病毒也有一定的相似性。Dinsdale等[52]基于宏組方法分析海洋、淡水、鹽湖等9個病毒群落的遺傳信息和代謝過程，結果表明各群落的功能多樣性相似，但代謝特征有所不同。2009年，Alberto等[53]利用此技術對南極湖病毒群落的遺傳結構分析發(fā)現(xiàn)大量未知真核病毒，且春夏季病毒物種的轉化與宿主群落的季節(jié)性變化相關。Djikeng等[34]利用宏病毒組技術對美國馬里蘭州一個淡水湖泊中RNA病毒調查研究，將測序所得的數(shù)據(jù)與病毒數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)30多個RNA病毒家族并且存在大量的未知病毒序列。Rosario等[35]基于此技術分析廢水處理廠再生水中病毒群落特征并與飲用水中的病毒比較，發(fā)現(xiàn)大量與昆蟲、動植物病毒相關的新型病毒，推斷再生水可能在病毒傳播中發(fā)揮作用。2011年，Sime等[54]對非洲西部的雷特巴鹽湖中病毒顆粒構建宏基因組文庫進行多樣性研究，發(fā)現(xiàn)許多與已知數(shù)據(jù)庫不匹配的新序列。2012年，Roux等[55]基于宏組技術對兩個生境差異明顯的法國溫帶淡水湖泊病毒群落的組成和多樣性分析發(fā)現(xiàn)中營養(yǎng)湖泊的物種豐度高于貧營養(yǎng)湖泊，并且與先前發(fā)表的病毒信息對比首次發(fā)現(xiàn)淡水環(huán)境病毒群落與其他水生生態(tài)系統(tǒng)在遺傳上顯示出特異性。2013年，F(xiàn)ancello等[56]對撒哈拉沙漠中部四個池塘的浮游病毒群落進行宏組研究，結果顯示人類活動多的地區(qū)病毒生物多樣性較低且肌病毒科噬藻體最為豐富。2016年，Skvortsov等[57]對來自愛爾蘭內伊湖的浮游病毒群落進行宏組分析，發(fā)現(xiàn)浮游病毒多樣性比之前研究湖泊更為豐富，其中以短尾病毒科為主要部分。2019年，Okazaki等[58]對日本的深淡水湖(琵琶湖)浮游病毒進行基因組探索，并與自己已發(fā)表的病毒基因組比較揭示了病毒的地域性特點，分析發(fā)現(xiàn)放線菌病毒是淡水系統(tǒng)中最多樣化的、最普遍、最豐富的病毒群之一，在地表水中具有潛在的溶菌活性。

宏病毒技術發(fā)展至今，國內淡水環(huán)境浮游病毒多樣性的相關研究還比較少。2012年，Tseng等[59]對我國臺灣北部的翡翠淡水水庫的浮游病毒多樣性進行為期兩年的宏組分析，發(fā)現(xiàn)夏季病毒豐度及多樣性顯著超過冬季，變異病毒主要集中在長尾病毒科、肌病毒科、短尾病毒科和微病毒科。2013年，Ge等[60]對我國武漢東湖浮游病毒群落結構進行宏組分析發(fā)現(xiàn)，浮游病毒多樣性在秋季最高，其次是冬季，而春季最低。2016年，Cai等[61]對我國福建九龍江河口病毒群落特征初步調查發(fā)現(xiàn)短尾病毒科病毒豐度最高。筆者基于宏病毒技術對四大高原湖泊中的浮游病毒多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)長尾病毒科的豐度最高，通過構建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)存在大量未知病毒序列[62]。

3 總結與展望

長期以來，對于病毒的研究一直局限于從受感染宿主中分離，因其缺乏廣泛的通用分子標記基因，導致一般的生物技術很難獲得完整的病毒序列。而宏病毒組分析技術的建立開辟了一條新的道路，擺脫了物種界限，并揭示了復雜的生命規(guī)律，已成為環(huán)境和組織研究中病毒組成和功能的重要技術。雖然宏組技術已被證明是一種強大的工具，能夠對樣本中存在的所有核酸進行測序，從而不需要預先了解微生物基因組序列就可以對其身份識別，但是，宏組技術還存在明顯的局限性：1)需要對病毒顆粒進行富集以滿足建庫要求。宏病毒組分析的前提是要保證核酸物質的質量和構建文庫的覆蓋率要滿足后續(xù)實驗要求，所以環(huán)境病毒樣品處理與篩選尤為重要。2)需要其他工具的協(xié)助來增強其應用。已知的病毒注釋數(shù)據(jù)庫數(shù)量有限，基于宏組技術測序樣品產生的海量數(shù)據(jù)需要很長的計算時間，需要其他工具的輔助對單個病毒序列進行聚類、分類和識別。如結合系統(tǒng)發(fā)育分析方法識別元基因組中每個序列的同源性。

浮游病毒因在海洋、湖泊等水生態(tài)系統(tǒng)的重要地位已成為許多國內外學者的關注焦點。相對于國外來說，我國有關浮游病毒的研究起步較晚，僅限于個別海洋、淡水湖泊等，而對于其他地區(qū)浮游病毒多樣性的研究還有待深入。