皇甫瑞娟 姜雪(寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 能源化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

0 引言

糖在我們的日常生活中起著重要的作用，不管是作為能量來(lái)源之一還是作為食品甜味劑，都是我們生活所離不開(kāi)的。當(dāng)前可供人們食用的甜味劑很多，如甜度最高的蔗糖，適用于糖尿病人服用的木糖醇，另外還有果糖、乳糖、山梨醇等多種甜味劑。

甜菊糖是一種從甜味菊莖葉中提取的天然甜味劑[1]，是幾種甜菊苷混合物，其化學(xué)通式為(C5H8)4。我國(guó)早在1980年左右就獲得了甜菊糖苷，即“甜菊糖”。經(jīng)大量藥物實(shí)驗(yàn)證明，甜菊糖無(wú)毒副作用，無(wú)致癌物，食用安全，經(jīng)常食用可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥，是一種可替代蔗糖非常理想的甜味劑[2]。但美中不足的是甜菊糖有著嚴(yán)重的苦澀后味，與蔗糖優(yōu)良的口感不能相比，從而至今尚未被市場(chǎng)消費(fèi)者所接受。因此，努力改進(jìn)甜菊糖苷的苦澀后味是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

甜菊糖是白色至微黃色結(jié)晶性粉。熔點(diǎn)198℃。1g該品可溶于800ml水，微溶于乙醇。比旋光率[α]20/D 為-39.3°(C=5.7，H2O)。在空氣中迅速汲濕。耐高溫，在酸性及堿性溶液中比較穩(wěn)定[2]。近些年對(duì)甜菊糖研究報(bào)道較多，對(duì)其成分分析檢測(cè)方法各異，其中高效液相(HPLC)色譜法因分離效率高、檢測(cè)靈敏度高和分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。但由于檢測(cè)條件各不相同，其檢測(cè)效果也各有差異。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)，建立了高效液相色譜(HPLC)對(duì)甜菊糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 色譜儀的選擇

高效液相色譜儀因?yàn)榉治鏊俣瓤欤蛛x效率高，在較短分析時(shí)間內(nèi)可以獲得很高的柱效和較高的分離能力。對(duì)沸點(diǎn)高、分子量大、受熱易分解的有機(jī)物、生物活性物質(zhì)以及多種天然產(chǎn)物，分離較好，檢測(cè)靈敏度也較高，因此應(yīng)用范圍十分廣泛。通常，高效液相色譜儀是由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、色譜工作站等幾部分組成。在測(cè)定樣品對(duì)紫外或者可見(jiàn)光的吸收程度時(shí)，通常用到紫外可見(jiàn)光吸收檢測(cè)器以及光二極管陣列檢測(cè)器(PAD)兩種。用UV-VIS檢測(cè)器檢測(cè)的化合物應(yīng)有相應(yīng)的吸收基團(tuán)，并且要知道這個(gè)吸收基團(tuán)的最大吸收波長(zhǎng)是多少。因?yàn)橹挥性谖栈鶊F(tuán)的最大吸收波長(zhǎng)附近檢測(cè)才可以得到高靈敏度和寬線性范圍。PAD檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得樣品組分的光譜信息，可以定性判定或鑒定不同類型的化合物，同時(shí)對(duì)未分離組分可以判斷其中的純度情況；同時(shí)，該檢測(cè)器的波長(zhǎng)無(wú)需事先設(shè)定，根據(jù)各個(gè)組分的吸收峰的波長(zhǎng)選擇最佳值后進(jìn)行定量分析。PAD類檢測(cè)器盡管具有較高的靈敏度，但是與單波長(zhǎng)吸收檢測(cè)方法相比，其靈敏度和線性范圍均不如單色光高。主要是單波長(zhǎng)檢測(cè)器所用的光敏元件檢測(cè)效率高，如果采用光電倍增管放大效率更為顯著；同時(shí)，多波長(zhǎng)吸收與單波長(zhǎng)吸收所得到的結(jié)果也有差別。因此，目前的檢測(cè)器靈敏度可調(diào)波長(zhǎng)檢測(cè)器比二極管陣列高約一個(gè)數(shù)量級(jí)左右。在低濃度樣品分析時(shí)，采用單波長(zhǎng)檢測(cè)器獲得的定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)所用的HPLC為Waters 2695 系統(tǒng)，軟件為Empower。該儀器由Waters 2695分離單元、2996型二極管陣列檢測(cè)器、2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、色譜管理工作站和打印機(jī)等部分組成。

1.2 色譜柱的選擇

色譜是一種分離分析手段，因此，色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件。柱效高、選擇性好、分析速度快是對(duì)色譜柱的一般要求。目前市售的高效液相色譜分離柱的內(nèi)徑有4.6mm和3.9mm兩種規(guī)格，柱長(zhǎng)一般用100～300mm就能滿足復(fù)雜混合物的分析要求。本實(shí)驗(yàn)用HPLC來(lái)分析甜菊糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的情況，故屬于分離糖類物質(zhì)[3]，同時(shí)應(yīng)用反相液相色譜的分離方法，選用了一根Waters Sunfire C18(4.6×150mm 5μm)柱，該柱填料為球形硅膠鍵合C18并采用了新型的鍵合和端基封尾技術(shù)，能夠提供完美的色譜峰型。

2 色譜條件的確立

在進(jìn)行正式的實(shí)驗(yàn)之前，首先需要確立色譜檢測(cè)條件，主要是對(duì)流動(dòng)相流速、流動(dòng)相配比、色譜柱長(zhǎng)度、色譜柱溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化，以便得到最好的檢測(cè)效果。對(duì)于Waters2695來(lái)說(shuō)，開(kāi)機(jī)之前首先需要對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾(通常過(guò)0.22μm濾膜)，過(guò)濾完畢再超聲脫氣10min左右。更換四元泵流動(dòng)相，通常A為甲醇、B為乙腈、C為水、D為緩沖鹽。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程結(jié)束后，要沖洗系統(tǒng)、色譜柱。沖洗原則：C18柱先用水(90%左右，具體需根據(jù)色譜柱要求)沖洗水溶性物質(zhì)，逐漸增加有機(jī)相比例，最終色譜柱保存于100%乙腈(或其它有機(jī)相)。關(guān)閉軟件和電腦，設(shè)流速為“0”，關(guān)脫氣機(jī)，關(guān)閉主機(jī)和檢測(cè)器的電源。

2.1 第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)

第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇了以下參數(shù)，如表1所示。

在上述條件下檢測(cè)出的色譜圖，如圖1所示。

結(jié)果分析：由以上色譜圖可以看出，兩主要組分未分開(kāi)，預(yù)計(jì)是有機(jī)相比例較高，洗脫能力較強(qiáng)，出峰快所導(dǎo)致。下一步將降低有機(jī)相比例。

表1 第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)參數(shù)

圖1 第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)色譜圖

2.2 第二次預(yù)實(shí)驗(yàn)

第二次預(yù)實(shí)驗(yàn)，在其他條件不變的情況下將乙腈和水的比例降低，使乙腈:水＝30:70，這次檢測(cè)出的色譜圖，如圖2所示。

結(jié)果分析：從這次的結(jié)果中可以看出，改變有機(jī)相比例使得兩主要組分的分離效果有所改善，但還是沒(méi)有完全分開(kāi)，這是我們所不愿意看到的。但是繼續(xù)降低有機(jī)相比例將會(huì)導(dǎo)致出峰過(guò)慢、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，故下一步計(jì)劃增加柱長(zhǎng)，以增強(qiáng)分離效果。

2.3 第三次預(yù)實(shí)驗(yàn)

在第三次預(yù)實(shí)驗(yàn)中，使用了一根SunFire TM C18 5μm，4.6×250mm柱子，比原來(lái)的柱長(zhǎng)多了100mm，理論上結(jié)果會(huì)好一些，這次檢測(cè)的色譜圖，如圖3所示。

通過(guò)這次的結(jié)果可以看出，主要組分的峰基本分開(kāi)，結(jié)果比較理想。至此檢測(cè)條件初步確立。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，都將使用以下的條件做檢測(cè)，如表2所示。

3 結(jié)語(yǔ)

甜菊糖可廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業(yè)，并且較應(yīng)用蔗糖可節(jié)省成本70%。甜菊糖色澤純白，口感適宜，無(wú)異味，是發(fā)展前景廣闊的新糖源。甜菊糖是目前世界已發(fā)現(xiàn)并經(jīng)我國(guó)衛(wèi)生部、輕工業(yè)部批準(zhǔn)使用的最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑。是繼甘蔗甜菜糖之外第3種有開(kāi)發(fā)價(jià)值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國(guó)際上譽(yù)為“世界第三蔗糖”。本文采用實(shí)驗(yàn)方法確立了HPLC法測(cè)定甜菊糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析方法的最優(yōu)色譜條件。為后續(xù)酶法對(duì)甜菊糖改性實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖2 第二次預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)色譜圖

圖3 第三次預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)色譜圖

表2 甜菊糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物色譜條件