包橋橋,李夢(mèng)茹,黃 榕,陳金嬌,劉洪章,劉樹(shù)英

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要特征之一,是導(dǎo)致高血壓、冠心病的重要原因[1]。其癥狀主要表現(xiàn)為由胰島素調(diào)控的促進(jìn)脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞的糖代謝能力下降,機(jī)體代償性地分泌過(guò)高濃度胰島素來(lái)維持機(jī)體血液中葡萄糖含量穩(wěn)態(tài)的現(xiàn)象[1-2]。作為胰島素信號(hào)通路的重要組成部分,AKT-FOXO1信號(hào)通路對(duì)胰島素抵抗起關(guān)鍵性作用[3]。通過(guò)調(diào)節(jié)AKT的磷酸化和FOXO1的核轉(zhuǎn)移促進(jìn)肝糖原合成,抑制肝糖原分解,從而改善胰島素抵抗[4-5]。

異鼠李素是沙棘黃酮中的主要活性成分之一,也存在于多種植物當(dāng)中[6-9]。已有研究表明,異鼠李素能夠改善糖尿病及其并發(fā)癥,具有降血糖[10-11]、調(diào)血脂[12]、改善胰島素抵抗[13],是一種潛在的治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物。但在對(duì)于異鼠李素在改善胰島素抵抗作用機(jī)制方面的研究尚存在不足。Jiang等[14]通過(guò)研究證明異鼠李素可調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路,然而目前能否通過(guò)AKT-FOXO1信號(hào)通路改善胰島素抵抗并未證實(shí)。

本研究通過(guò)異鼠李素作用于高濃度胰島素誘導(dǎo)制備人肝癌HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型[15-16],檢測(cè)細(xì)胞糖代謝水平變化,且從蛋白表達(dá)水平衡量異鼠李素調(diào)控AKT-FOXO1信號(hào)通路的作用效果,揭示異鼠李素改善胰島素抵抗機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異鼠李素(98%) 上海源葉生物科技有限公司;Hepg2細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);PBS緩沖液、DMEM培養(yǎng)基 海克隆生物化學(xué)制品有限公司;DMEM無(wú)酚紅培養(yǎng)基 吉林省吉諾生物工程有限公司;牛血清白蛋白、胰島素、胰蛋白酶-EDTA溶液、MTT(噻唑藍(lán))、二甲基亞砜、青霉素-鏈霉素混合液 北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所;蛋白預(yù)制膠、BCA蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒、二甲雙胍、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板、6孔板 康寧生命科學(xué)有限公司;抗體 p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)、AKT、FOXO1、G6pase、PEPCK、β-actin 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;彩虹Marker、10×TBS封閉洗滌緩沖溶液 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Tween-20、SDS電泳上樣緩沖液 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Western轉(zhuǎn)膜緩沖液 白鯊生物科技有限公司。

BPN-40RHP二氧化碳培養(yǎng)箱 上海一恒;D1Mi倒置顯微鏡 德國(guó)徠卡公司;CGF-300臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī) 北宏科技;1703940半干轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)伯樂(lè);WD-9423B化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、DYCZ-24DN垂直電泳槽 北京六一;EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海天能;BIOBASE-EL10A酶標(biāo)儀 上海博科;752N紫外分光光度計(jì) 上海精科。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Hepg2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含100 mL/L胎牛血清,100 U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至95%傳代繼續(xù)培養(yǎng)[17]。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(MTT)法試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,于96孔板中以1×105個(gè)/孔鋪板,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞單層長(zhǎng)滿(mǎn)孔底,血清剝奪12 h后,設(shè)置空白對(duì)照組及藥物處理組(處理濃度分別為:60、30、15、7.5、3.8、2、1、0.5 μg/mL),處理濃度每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將1 mg異鼠李素溶于10 μL 75%乙醇中,培養(yǎng)基稀釋至終濃度為60 μg/mL,以二倍稀釋法給藥處理,設(shè)置最低濃度為0.5 μg/mL。12 h后每孔加入20 μL濃度為0.5%的MTT溶液孵育4 h,棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS清洗后每孔加入100 μL二甲基亞砜,搖床振蕩10 min,設(shè)置轉(zhuǎn)速為40 r/min,490 nm處測(cè)每孔吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率[17],公式如下:

將未添加異鼠李素處理的組別設(shè)為正常組,設(shè)定細(xì)胞存活率為“100%”,繪圖并分析結(jié)果。

1.2.3 胰島素抵抗(IR)模型建立 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以懸液密度為2×105個(gè)/mL接種于六孔板中,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后血清剝奪12 h,以胰島素濃度為1×10-6mol/L藥用培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)處理36 h即為胰島素抵抗模型。

1.2.4 葡萄糖代謝水平測(cè)試 將已建立好的胰島素抵抗模型,以10 μmol/L二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照,使用無(wú)酚紅培養(yǎng)基配制不同劑量分組給藥;根據(jù)MTT試驗(yàn)結(jié)果,共設(shè)置六組別,分別為:空白組(C)、模型組(B)、陽(yáng)性對(duì)照(Met,1 mmol/L二甲雙胍)、低劑量組(1 μg/mL)、中劑量組(2 μg/mL)、高劑量組(3.8 μg/mL),處理12 h后取培養(yǎng)基離心取上清,參照葡萄糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞葡萄糖消耗量。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)AKT-FOXO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 使用Western Blot方法檢測(cè)AKT、FOXO1、p-AKT、p-FOXO1、G6pcse、PEPCK、β-actin共七種蛋白的表達(dá)情況。將胰島素抵抗模型建立完成后的細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗三遍后,分別加入含有不同濃度(低劑量組:1 μg/mL;中劑量組:2 μg/mL;高劑量組:3.8 μg/mL)的異鼠李素的藥用培養(yǎng)基,處理12 h。藥物處理后細(xì)胞棄去上清,分別以預(yù)冷的PBS清洗三次,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度備用。變性后取20 μg上樣,10% SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜后,以相應(yīng)二抗常溫孵育。ECL 法顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶濃度[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行組間單因素方差分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT試驗(yàn)檢測(cè)異鼠李素對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)影響

設(shè)置最高濃度為60 μg/mL,最低濃度為0.5 μg/mL,以2倍稀釋法分組給藥,以無(wú)血清培養(yǎng)基作為對(duì)照組,結(jié)果如圖1所示。與正常組比較,當(dāng)異鼠李素濃度在大于7.5 μg/mL 時(shí),細(xì)胞存活率為小于80.7%，顯著抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05),當(dāng)濃度在3.8～1 μg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)危害,細(xì)胞存活率在0.943與1.093之間,當(dāng)異鼠李素濃度為1 μg/mL時(shí),可有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng);當(dāng)濃度繼續(xù)減小時(shí),HepG2細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。當(dāng)異鼠李素濃度減小至0.5 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率為:79%。因此選定異鼠李素濃度在3.8～1 μg/mL時(shí)為安全用藥劑量。故選取3.8、2、1 μg/mL分別為高、中、低劑量組。

圖1 異鼠李素對(duì)Hepg2細(xì)胞活力的影響

2.2 異鼠李素對(duì)IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

如圖2所示,表明空白組葡萄糖消耗量為4.473 mg/mL,與之比較模型組葡萄糖消耗量明顯減少,其數(shù)值為1.7 mg/mL,存在極顯著性差異(P<0.001),因此胰島素模型造模成功;與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及試驗(yàn)組葡萄糖消耗量均顯著增加(P<0.05),陽(yáng)性對(duì)照組葡萄糖消耗量為4 mg/mL。試驗(yàn)組的細(xì)胞葡萄糖消耗量隨劑量升高而降低,其中高劑量組葡萄糖消耗量為2.6 mg/mL;低劑量組葡萄糖消耗量達(dá)4.3 mg/mL,與空白組和陽(yáng)性對(duì)照組葡萄糖消耗量相當(dāng)。

圖2 異鼠李素對(duì) IR HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗影響

2.3 異鼠李素對(duì)IR HepG2細(xì)胞Akt和FOXO1蛋白磷酸化影響

如圖3A、3B所示,各劑量組AKT蛋白的表達(dá)水平與FOXO1蛋白表達(dá)水平趨于一致,表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠性,并且該組試驗(yàn)分別以AKT蛋白表達(dá)和FOXO1蛋白表達(dá)作為內(nèi)參。如圖3C、3D所示,分別將AKT蛋白與FOXO1蛋白作為內(nèi)參蛋白,衡量?jī)傻鞍琢姿峄阶兓?即p-AKT蛋白與p-FOXO1蛋白相對(duì)于AKT蛋白與FOXO1蛋白表達(dá)量的變化:與空白組比較,模型組p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)明顯降低且存在極顯著性差異(P<0.001),因此胰島素抵抗模型造模成功;相較于模型組,實(shí)驗(yàn)組p-AKT(Ser473)和p-FOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)均明顯增加,且隨劑量升高而下降。p-AKT的蛋白表達(dá),低劑量組與模型組存在極顯著性差異(P<0.001)高劑量組的蛋白水平與模型組并無(wú)顯著性差異(P>0.05);P-FOXO1三個(gè)劑量組均與模型組皆有顯著差異(P<0.05),且低劑量組p-FOXO1的蛋白表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。

圖3 異鼠李素對(duì)IR Hepg2細(xì)胞AKT和FOXO1蛋白磷酸化水平影響

2.4 異鼠李素對(duì)IR HepG2細(xì)胞G6pase和PEPCK蛋白表達(dá)水平影響

如圖4A所示,選取β-actin作為內(nèi)參蛋白,且在該組試驗(yàn)中,內(nèi)參表達(dá)水平趨于一致,說(shuō)明試驗(yàn)具有可靠性。故以PEPCK蛋白和G6pase蛋白相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量作為衡量蛋白表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn),如圖4B和4C所示。如圖所示,與空白組比較,模型組PEPCK、G6pase、蛋白表達(dá)明顯升高且存在極顯著性差異(P<0.001)。G6pase與PEPCK的蛋白表達(dá)量均隨劑量升高而升高,陽(yáng)性對(duì)照與低劑量組較模型組相比均具有顯著差異(P<0.01)且G6pase低劑量組蛋白表達(dá)量與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。

圖4 異鼠李素對(duì)IR Hepg2細(xì)胞G6pcse和PEPCK蛋白表達(dá)的影響

3 結(jié)論

胰島素抵抗是指由各種原因,如高血壓、肥胖等引起的胰島素敏感性下降,是治療Ⅱ型糖尿病的關(guān)鍵途徑之一。肝臟在糖代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,胰島素通過(guò)下調(diào)肝臟肝糖原合成與分解、糖異生等過(guò)程調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝過(guò)程,因此胰島素抵抗嚴(yán)重影響肝糖代謝[19]。

科研人員在對(duì)胰島素抵抗治療研究當(dāng)中,將大量目光集中于天然產(chǎn)物的應(yīng)用上,其中黃酮類(lèi)化合物在胰島素抵抗治療方面具有顯著療效。異鼠李素是廣泛存在于自然界中的一種黃酮類(lèi)化合物,具有調(diào)節(jié)糖代謝,治療糖尿病等作用[20]。

AKT/FOXO1信號(hào)通路處于胰島素信號(hào)通路下游,是調(diào)節(jié)糖原合成并維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要途徑。FOXO1蛋白是細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子,主要調(diào)控G6pase和PEPCK蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)細(xì)胞的糖原分解。通過(guò)AKT蛋白在Ser473位點(diǎn)磷酸化,激活A(yù)KT蛋白。磷酸化的AKT蛋白促進(jìn)FOXO1蛋白磷酸化并向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移,抑制G6pase和PEPCK蛋白的轉(zhuǎn)錄,從而抑制糖原分解。當(dāng)細(xì)胞受高濃度胰島素作用產(chǎn)生胰島素抵抗后,細(xì)胞糖代謝紊亂,糖原合成機(jī)能受損。因此,通過(guò)激活A(yù)KT/FOXO1信號(hào)通路可改善細(xì)胞胰島素抵抗現(xiàn)象,維持細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

本試驗(yàn)通過(guò)將異鼠李素作用于高濃度胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗的Hepg2細(xì)胞模型[21-23],以二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照,評(píng)估異鼠李素改善Hepg2細(xì)胞胰島素抵抗作用,并通過(guò)檢測(cè)AKT/FOXO1信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo),研究其作用機(jī)制[24-25]。由試驗(yàn)結(jié)果表明,異鼠李素具有改善胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗量的作用。且給予異鼠李素刺激后,胰島素抵抗細(xì)胞的p-AKT(Ser473)、p-FOXO1(Ser256)蛋白表達(dá)顯著增加,PEPCK、G6pase的蛋白表達(dá)量顯著減小,明顯改善細(xì)胞胰島素抵抗,推測(cè)其可能是通過(guò)促進(jìn)ATK蛋白磷酸化從而增加FOXO1蛋白磷酸化,減少PEPCK和G6pase的蛋白表達(dá)水平以發(fā)揮降低血糖,改善胰島素抵抗作用從而緩解2型糖尿病癥狀。Jiang等[14]通過(guò)試驗(yàn)研究證明,異鼠李素可通過(guò)激活I(lǐng)RS/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)L6肌管的葡萄糖攝取,維持細(xì)胞糖代謝穩(wěn)態(tài);Jia等[15]發(fā)現(xiàn)異鼠李素可調(diào)節(jié)胰島素敏感性抑制胰高血糖作用,與本研究成果相符。值得關(guān)注的是,本試驗(yàn)結(jié)果中在安全用藥范圍內(nèi),雖然各劑量組皆可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝,但異鼠李素的藥理活性呈劑量依賴(lài)性降低,即低劑量組葡萄糖代謝水平及蛋白水平優(yōu)于高劑量組。對(duì)照MTT試驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)藥物的量效關(guān)系可得[26]：因異鼠李素藥理活性強(qiáng),微量差異即可對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生較大影響。在選用的三組劑量中,給藥劑量為1 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力最強(qiáng),其葡萄糖代謝水平與二甲雙胍相當(dāng),而高劑量組雖對(duì)細(xì)胞沒(méi)有顯著性傷害,但細(xì)胞活力卻較低,影響了細(xì)胞的代謝水平,因此低劑量組細(xì)胞的葡萄糖代謝水平高于高劑量組葡萄糖代謝水平。

綜上所述,異鼠李素可通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/FOXO1信號(hào)通路改善高濃度胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗。