唐天才，石團員，袁東波，侯 巍，莫 茜， 尹 杰，陽愛國，郭 莉*，郝力力*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；3. 四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041)

【研究意義】血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，全球血吸蟲病人在2億以上，受威脅的流行區(qū)人口7億多[1-2]，而日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)是導(dǎo)致血吸蟲病的三種病原體之一。四川省氣候溫暖潮濕，年平均氣溫16 ℃，年平均降雨量1000 mm左右，每年無霜期一般大于300 d，非常適宜日本血吸蟲中間宿主釘螺孳生繁殖。血吸蟲病流行于全省11個市、63個縣、622個鄉(xiāng)、4599個村，流行村總?cè)丝?058.31萬人，有螺面積26 800 hm2。四川省經(jīng)過多年綜合防治，2008年全省達(dá)到血吸蟲病傳播控制標(biāo)準(zhǔn)[3]，2015年底全省實現(xiàn)了血吸蟲病傳播阻斷的目標(biāo)[4]，但仍然存在諸多問題和挑戰(zhàn)，例如：依靠治標(biāo)措施達(dá)標(biāo)，綜合治理覆蓋不夠，存在疫情反彈風(fēng)險，部分綜合治理環(huán)境疫情回升[5-6]，人群和家畜流動性大，傳染源管理困難。由于S.japonicum易感宿主廣泛(涉及40多種哺乳動物)，傳染源和中間宿主尚不能有效根除，日本血吸蟲病仍面臨著隨環(huán)境氣候變化而死灰復(fù)燃的可能性，其診斷和防治工作仍然不能松懈，因此，快速有效診斷是血吸蟲病及時防治的前提。【前人研究進展】目前，日本血吸蟲病診斷方法可概括為病原形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)三大類。其中，病原形態(tài)學(xué)診斷是最為經(jīng)典，但費時、費力，漏檢率較高，不適合家畜血吸蟲病的普查，而分子生物學(xué)方法因操作復(fù)雜且需要昂貴設(shè)備僅限于實驗室使用[7-8]；免疫學(xué)診斷方法是目前家畜血吸蟲病普查最常用的方法，其診斷抗原通常為S.japonicum可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen, SEA)，這與蟲卵能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平Th2型免疫應(yīng)答和特異性抗體密切相關(guān)[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c】由于SEA組分復(fù)雜，在實際應(yīng)用時易與其他寄生蟲抗原發(fā)生交叉反應(yīng)而降低其特異性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，深入分析并鑒定S.japonicumSEA組分的免疫特異性，是獲取特異性診斷抗原并對其基因進行克隆、表達(dá)的前提工作。

1 材料與方法

1.1 蟲卵和血清

已經(jīng)純化、脫脂和烘干處理后的S.japonicum蟲卵(購自安徽醫(yī)科大學(xué))，感染S.japonicum第45天的陽性病牛血清(上海市國家動物醫(yī)學(xué)研究所贈)，健康牛血清(采自馬邊縣)。

1.2 主要試劑耗材

兔抗牛IgG-hrp,Western-blot工作濃度1∶1000～1∶5000，ELISA工作濃度1∶20 000～40 000北京博奧生物技術(shù)有限公司；寬范圍蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)：200、105、79、51、31、15和2 KDa，鼎國生物技術(shù)有限公司；增強型ECL發(fā)光試劑盒, 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；WHATMAN硝酸纖維素(NC)膜，上海索萊寶生物技術(shù)有限公司；Pharmac葡聚糖凝膠G-200，上海索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)印成套設(shè)備(BIO-RAD，美國)；蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)(GE Healthcare,美國)。

1.4 日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備

1.4.1 用于SDS-PAGE和Western-blot的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備 稱取S.japonicum蟲卵0.1 g(含蟲卵2.8×106個)至小離心管，于液氮中冷卻5 min，然后將蟲卵倒入液氮預(yù)冷過的研缽中，向研缽中緩慢加入液氮，邊加邊研磨，至蟲卵鏡檢完全破裂，將蟲卵粉末轉(zhuǎn)移至新的離心管，向離心管中加入400 μl SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水中反復(fù)煮3次，每次10 min，期間冰浴2 min，最后，12000 r/min離心2 min，取上清備用。

1.4.2 用于葡聚糖凝膠層析的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備 稱取S.japonicum蟲卵1 g，玻璃勻漿器研磨30 min，用滅菌生理鹽水配成5 %懸液，置4 ℃浸泡3 d，期間于-20 ℃和室溫間反復(fù)凍融10次，然后超聲裂解30 min(400W)，12 000 r/min離心1 h，取上清備用。

1.5 SDS-PAGE和Western-blot分離日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原

分別制備12 %的分離膠和5 %的濃縮膠，膠厚度為1.5 mm,上樣量為20 μl,分別用分離膠80 ν和濃縮膠100 ν恒壓分離樣品。

半干式轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)到NC膜上(該轉(zhuǎn)移緩沖液包含47.88 mmol/L的Tris、38.63 mmol/L的甘氨酸、1.28 mmol/L十二烷基硫酸鈉和20 %的甲醇)；NC膜在去離子水中漂洗后，將其放入5 %脫脂奶粉TBST中4 ℃過夜封閉，然后與用1∶100倍稀釋的S.japonicum陽性病牛血清于37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次后再與1∶2000稀釋的兔抗牛IgG-hrp于37 ℃作用60 min, TBST洗膜3次，最后用ECL化學(xué)發(fā)光顯影和定影。

1.6 葡聚糖凝膠G-200柱層析分離日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原

稱取3 g葡聚糖凝膠G-200至燒杯中，加入去離子水300 mL，室溫過夜溶脹，次日更換去離子水，沸水浴1 h，冷卻后裝柱，然后用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.9)平衡過夜，向已平衡的柱內(nèi)加入日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原，每次2 mL，約為柱體積的5 %，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.9)洗脫抗原，流速為0.25 mL/min，分別收集Ⅰ峰、峰間和Ⅱ峰抗原組分，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Dot-ELISA鑒定日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原組分

各層析抗原組分分別點膜，1 μg/點，室溫放置1 h，然后將膜置于1 % BSA-PBST中4 ℃過夜封閉，PBST洗膜3次，每次5 min，與1∶100倍稀釋的S.japonicum陽性病牛血清室溫振蕩作用1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，與1∶20 000倍稀釋的羊抗牛IgG-hrp室溫振蕩作用1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE與Western-blot結(jié)果

SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，SEA所包含主要蛋白條帶有10條，分子量大小依次約為100、80、60、55、45、28、27、17、15和13 KDa(圖1)；Western-blot對其鑒定結(jié)果顯示，SEA與日本血吸蟲陽性血清出現(xiàn)了3條特異性反應(yīng)條帶，其中，在28和17 KDa位置條帶較為明顯，在50 KDa位置的反應(yīng)條帶較弱(圖2)。

M：蛋白標(biāo)志物；SEA：日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原 M：Protein molecular weight；SEA：Soluble egg antigen圖1 日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原SDS-PAGE電泳圖 Fig.1 SDS-PAGE analysis of soluble egg antigens of S.japonium

+：陽性血清；-：陽性血清 +：Potive sera；-：Negative sera圖2 日本血吸蟲可溶性抗原免疫印跡鑒定Fig.2 Western blot analysis of soluble egg antigens of S.japonium

圖3 日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原葡聚糖凝膠G-200柱層析分離Fig.3 Chromatographic separation of soluble egg antigens of S.japonium with sephadex G-200

2.2 葡聚糖凝層析及Dot-ELISA鑒定結(jié)果

葡聚糖凝膠G-200柱層析對SEA分離結(jié)果顯示，SEA在分離過程中出現(xiàn)了2個非常明顯的蛋白質(zhì)高峰值，分別名Ⅰ峰(時間為4～10 min)和Ⅱ峰(時間為20～30 min，圖3)，根據(jù)Ⅰ峰和Ⅱ峰出現(xiàn)時間的早晚判斷，Ⅰ峰為SEA大分子量蛋白組分，Ⅱ峰為SEA小分子量蛋白組分，對所分離到的SEAⅠ峰、峰間和Ⅱ峰蛋白組分Dot-ELISA鑒定結(jié)果顯示，Ⅰ峰、峰間和Ⅱ峰蛋白與日本血吸蟲陽性血清均出現(xiàn)了較強的反應(yīng)，反應(yīng)斑點明顯，但Ⅰ峰和峰間蛋白與陰性對照血清間也存在不同程度的反應(yīng)，而Ⅱ峰蛋白未與陰性對照血清出現(xiàn)可見反應(yīng)(圖4)，表明，Ⅱ峰蛋白是能夠用于血吸蟲病診斷的特異性抗原。

圖中斑點1、2和3所用抗原分別為Ⅰ峰、峰間和Ⅱ峰抗原，Sj+1、Sj+2和Sj+3表示一抗反應(yīng)血清為日本血吸蟲陽性血清，Normal 1、Normal 2和Normal 3表示一抗反應(yīng)血清為陰性對照血清 Dot 1, 2 and 3: Antigens corresponding with I peak, between I and II peak and II peak;Sj+1,Sj+2 and Sj+3: Primary antibodies from positive sera; Normal 1,Normal 2 and Normal 3: Primary antibodies from negtive sera圖4 日本血吸蟲蟲卵可溶性葡聚糖凝膠G-200柱層析抗原Dot-ELISA鑒定Fig.4 Dot-ELISA identification of S.japonium soluble egg antigens separated by gel filtration on Sephadex G-200

圖中斑點1、2和3所用抗原分別為Ⅱ峰、Ⅱ峰上清和Ⅱ峰沉淀抗原，Sj+1和Sj+2Sj+3表示一抗反應(yīng)血清為日本血吸蟲陽性血清，Normal 1和Normal 2表示一抗反應(yīng)血清為陰性對照血清 Dot 1, 2 and 3: Antigen precipitation corresponding with II peak, II peak supernatant and II peak precipitation;Sj+1, Sj+2 and Sj+3: Primary antibodies from positive sera; Normal 1, Normal 2 and Normal 3: Primary antibodies from negtive sera圖5 日本血吸蟲蟲卵葡聚糖凝膠G-200柱層析Ⅱ峰沉淀抗原Dot-ELISA鑒定Fig.5 Dot-ELISA for determination of protein precipitation from II peak separated by gel filtration on Sephadex G-200

SEA特異性抗原組分為小分子量蛋白，主要成分為28、17和50 KDa蛋白，通過葡聚糖凝膠層析的方法能夠?qū)琒EA小分子量的Ⅱ峰蛋白分離出來；Dot-ELISA鑒定結(jié)果顯示，小分子量蛋白組分峰離心沉淀蛋白組分是非特異性蛋白組分，而Ⅱ峰蛋白中上清蛋白是能夠用于日本血吸蟲病診斷的特異性天然蛋白(圖5)。

3 討 論

目前，在日本血吸蟲病血清學(xué)診斷中所用到的抗原包括成蟲抗原、蟲卵抗原和重組抗原等[11-12]，其中，日本血吸蟲SEA抗原不僅特異性和敏感性相對較高，而且是日本血吸蟲蟲卵治病的主要因素，因此已成為日本血吸蟲病診斷中最為常用的抗原之一[11]。然而，SEA是日本血吸蟲蟲卵的蛋白粗提物，所含蛋白質(zhì)種類繁多[13-14]，且不同提取方法所制備的SEA成分存在差異，這些都會影響到SEA在血清學(xué)診斷中的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。因此，本研究通過SDS-PAGE、Western-blot、凝膠層析和Dot-ELISA方法對SEA蛋白組特異性組分進行了分離和分析，其中SDS-PAGE電泳顯示主要有10條蛋白帶，并且其蛋白組分均為100 KDa以下的小分子量蛋白，這與周曉紅等人(2000)[15]報道結(jié)果相一致，而不同于朱蔭昌等人(1996)[16]的報道。再經(jīng)Western-blot分析，顯示SEA與日本血吸蟲陽性血清只出現(xiàn)了3條特異性反應(yīng)條帶，值得注意的是一些SDS-PAGE蛋白帶陽性的帶用Western-blot分析后呈陰性(如分子質(zhì)量為100、80、60、45、27和15 KDa蛋白帶)，而這些抗原是否都是日本血吸蟲蟲卵的特異性抗原，還需進一步驗證。

葡聚糖凝膠層析是對具有不同大小蛋白進行快速大量分離的一種方法，且不影響所分離蛋白質(zhì)的活性。Dot-ELISA是以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體，是對傳統(tǒng)ELISA的改進，在傳統(tǒng)ELISA準(zhǔn)確、快速、特異的優(yōu)點基礎(chǔ)上，更有包被好的診斷膜片在常溫保存、攜帶和運輸方便較為便捷，適合基層使用等優(yōu)點，已被較為廣泛的應(yīng)用于日本血吸蟲的研究。蔡世飛[17]運用Dot-ELISA檢測慢性日本血吸蟲病患者血清IgG；王敏[18]將Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值的研究；沈定文[19]運用Dot-ELISA快速診斷日本血吸蟲病。

本研究利用葡聚糖凝膠G-200柱層析和Dot-ELISA對SEA進行了分析，結(jié)果表明小分子量的Ⅱ峰蛋白是能夠用于血吸蟲病診斷的特異性抗原，而李旭瓊等人(1984)早期報道[20]Ⅰ峰蛋白特異性較強，這可能與SEA制備時的方法、步驟不同，以及Ⅰ峰和Ⅱ峰蛋白分離時所采用的葡聚糖凝膠分子大小差異密切相關(guān)。另外，所分離到的小分子量蛋白存在一定的渾濁度，通過高速離心對其進行了分離，并對其離心后的蛋白組分進行了深入鑒定，Dot-ELISA鑒定結(jié)果顯示，小分子量蛋白組分峰離心沉淀蛋白組分是非特異性蛋白組分(圖5)，因此，在制備小分子量蛋白抗原時可通過離心的方法將非特異性蛋白組分去掉，從而獲得特異性蛋白組分。

4 結(jié) 論

本研究通過SDS-PAGE、Western-blot、凝膠層析和Dot-ELISA方法分析出SEA小分子量蛋白中的上清蛋白是能夠用于日本血吸蟲病診斷的特異性天然蛋白，這為牛日本血吸蟲病高特異性和敏感性檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。