張佳南，王艷殊，許世超，田 雨，李文霞，寧海龍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

【研究意義】大豆的生育期性狀是決定生產(chǎn)的重要性狀之一，對(duì)產(chǎn)量、品質(zhì)至關(guān)重要。育種實(shí)踐也表明，改變大豆生育期結(jié)構(gòu)，能夠增加產(chǎn)量。一般來(lái)說(shuō)，生育期較長(zhǎng)的大豆品種，產(chǎn)量較高，所以，研究大豆生育期的遺傳規(guī)律有助于更加清楚地了解產(chǎn)量形成的機(jī)制。大豆生育期也是確定大豆生態(tài)適應(yīng)性的重要性狀，了解其遺傳規(guī)律可以指導(dǎo)品種的合理選擇和不同積溫區(qū)的生態(tài)布局。為加快育種進(jìn)程，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于大豆生育期QTL定位育種研究中[1-2]，利用分子標(biāo)記構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜對(duì)大豆生育期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL分析，可以在分子水平上闡述控制大豆生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因系統(tǒng)的表達(dá)規(guī)律，大大促進(jìn)了數(shù)量性狀的遺傳研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大豆生育期QTL定位的報(bào)道已有很多。截至2015年，共定位482個(gè)生育期相關(guān)的QTL(http://soybase.org)。但是以往研究有3方面的不足。一是國(guó)內(nèi)外定位生育期相關(guān)的QTL數(shù)量雖多，但多是運(yùn)用單一環(huán)境進(jìn)行研究。由于大豆生育期性狀遺傳為數(shù)量遺傳，受多基因控制，很容易受到光照長(zhǎng)度和溫度等環(huán)境的影響，因此應(yīng)通過(guò)多環(huán)境聯(lián)合分析，可定位到多環(huán)境共表達(dá)的穩(wěn)定QTL和某一環(huán)境特意表達(dá)的QTL。二是大多數(shù)研究只將整個(gè)生育期分為前、中、后3個(gè)生育階段，很少將發(fā)育進(jìn)程細(xì)分小階段后進(jìn)行分析；三是大多數(shù)研究群體是由兩親本衍生的，兩個(gè)親本的雜交后代在進(jìn)行連鎖分析時(shí)，一個(gè)位點(diǎn)涉及只兩個(gè)等位基因，檢測(cè)效率低。而四向重組自交系群體是由4個(gè)親本衍生的群體，多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量以及遺傳圖譜標(biāo)記密度都會(huì)增加，分子標(biāo)記多態(tài)性也更豐富，最主要的是基于一個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)分析4個(gè)復(fù)等位基因效應(yīng)，從而提高QTL檢測(cè)效率。為滿足自花授粉作物的需要，四向重組自交系群體被提出并應(yīng)用于遺傳分析[3-4]。【本研究的切入點(diǎn)】本研究應(yīng)用前期構(gòu)建的四向重組自交系群體(FW-RIL)，利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，應(yīng)用3個(gè)年份6個(gè)不同播期下的生育期結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位分析，檢測(cè)不同年份、不同播期下穩(wěn)定表達(dá)的全生育期QTL，并應(yīng)用四向重組自交系群體多等位基因的優(yōu)勢(shì)，探尋有利于生育期性狀改良的優(yōu)異等位基因，進(jìn)一步了解大豆生育期性狀的遺傳控制和環(huán)境調(diào)控規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為大豆育種中生育期性狀的定量設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 四向重組自交系群體的構(gòu)建

應(yīng)用生育期性狀存在差異的4個(gè)大豆親本，墾豐14(生育期120 d)、墾豐15(生育期116 d)、黑農(nóng)48(生育期118 d)和墾豐19(生育期112 d)于2008年配制雙交組合(墾豐14×墾豐15)×(黑農(nóng)48×墾豐19)，獲得FW-F1世代，將FW-F1在哈爾濱和海南省三亞市崖州區(qū)連續(xù)自交6代，采用單粒傳法獲得FW-F2∶8四向重組自交系群體，包含160個(gè)株系，連同其4個(gè)親本組成本試驗(yàn)材料。

1.2 田間試驗(yàn)與性狀調(diào)查

田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3行區(qū)。小區(qū)行長(zhǎng)5 m，壟距65 cm，株距10 cm，3次重復(fù)，田間管理同一般大田栽培。2014年5月10日在哈爾濱香坊農(nóng)場(chǎng)播種第1播期(14S1)，同年5月20日進(jìn)行第2播期播種(14S2)；2015年5月10日在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)院試驗(yàn)田進(jìn)行第1播期種植(15S1)，第2播期于5月20日進(jìn)行播種(15S2)；2016年5月7日在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)院試驗(yàn)田進(jìn)行第1播期種植(16S1)，5月17日播種第2播期(16S2)。

田間記錄生育期按Fehr和Carviness的大豆生育時(shí)期劃分標(biāo)準(zhǔn)記載[4]，調(diào)查各株系及親本出苗后及時(shí)記錄子葉期時(shí)間，之后進(jìn)入始花期，始花期后每2～3 d到田間觀察大豆群體發(fā)育動(dòng)態(tài)，并及時(shí)記錄生育期表型數(shù)據(jù)直到群體達(dá)到完全成熟階段，數(shù)據(jù)記錄完成。根據(jù)數(shù)據(jù)及生育期圖譜進(jìn)行QTL定位。調(diào)查各株系及親本的出苗期(VE)、始花期(ER1)、盛花期(ER2)、始莢期(ER3)、盛莢期(ER4)、始粒期(ER5)、鼓粒期(ER6)、始熟期(ER7)和完熟期(ER8)，并計(jì)算出本實(shí)驗(yàn)用于QTL定位分析的生育期各階段的數(shù)值：盛花-始莢(R23)、始莢-盛莢(R34)、盛莢-始粒(R45)、始粒-鼓粒(R56)、鼓粒-始熟(R67)、始熟-完熟(R78)、始花-完熟(R18)的天數(shù)。

1.3 SSR標(biāo)記分析

參照Gregan[5]等發(fā)表的大豆公共遺傳圖譜挑選引物，本研究初步挑選了638對(duì)SSR引物在4個(gè)親本之間進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中有275對(duì)引物在4個(gè)親本之間表現(xiàn)出多態(tài)性。根據(jù)Soybase(http://soybase.org)網(wǎng)站提供的大豆SSR序列合成引物并對(duì)4個(gè)親本及FW-RIL群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系：3 μl總DNA(50 ng/μl)+3 μl引物(100 nmol/μl)(包括上游引物和下游引物)+0.3 μl dNTP(10 nmol/μl)+2 μl10×緩沖液+0.2 μlTap酶(5 U/μl)，用超純水定容至20 μl。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min，進(jìn)入循環(huán)：94 ℃變性30 s；50 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)38次后在72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。

電泳方法：每個(gè)PCR反應(yīng)體系加上8 μl Loading Buffer，置PCR儀中變性10 min，然后放入冰上冷卻。PCR產(chǎn)物在6 %的聚丙烯酰胺凝膠上分離，在1500W恒功率下電泳約1.5 h。

銀染方法：在20 mL酒精(95 %)+10 mL冰乙酸+3 mL AgNO3+1500 mL蒸餾水中染色10 min，清水漂洗30 s后放入30 g NaOH+6 mL甲醛中顯色+1500 mL蒸餾水顯色5～10 min。

1.4 連鎖圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教授寧海龍等[6]以4個(gè)親本雜交衍生的160個(gè)FW-RIL群體(F8代)為材料，構(gòu)建了一個(gè)基于四向群體的大豆遺傳圖譜。圖譜包含275個(gè)SSR遺傳標(biāo)記，20個(gè)連鎖群，在大豆基因組上總遺傳距離3636.26 cM，平均圖距15.47 cM。每個(gè)連鎖群包含遺傳標(biāo)記6～0個(gè)，圖距在49.36～319.02 cM。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

對(duì)不同環(huán)境條件下全生育期表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性分析，并使用SAS9.1軟件進(jìn)行方差分析對(duì)不同環(huán)境下的表型觀測(cè)值進(jìn)行聯(lián)合方差分析，估算相應(yīng)的方差分量，通過(guò)環(huán)境方差、基因型方差、基因與環(huán)境互作以及誤差方差和總體方差進(jìn)行遺傳率的估計(jì)，遺傳率估計(jì)的計(jì)算方法如下：

用QTL(GAPL V1.2)軟件進(jìn)行QTL定位，采用完備區(qū)間作圖法、簡(jiǎn)單區(qū)間作圖法和排列法進(jìn)行加性效應(yīng)分析，對(duì)每個(gè)性狀分別進(jìn)行1000次排列測(cè)驗(yàn)(permutation test)，以確定每個(gè)性狀的LOD臨界值閾值(顯著水平0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

FW-RIL群體各生育期性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變幅、偏度及峰度列于(表1)。FW-RIL群體的各個(gè)生育期階段存在較大的變異，不同年份和播期下各階段差異同樣顯著、偏度及峰度均小于1，表明各階段生育期性狀的表型值基本符合正態(tài)分布，表示存在多數(shù)微效基因，因此，可用于多年多環(huán)境下生育期性狀QTL的定位。

2.2 FW-RIL生育期階段的方差分析和遺傳率估計(jì)

方差分析結(jié)果表明(表2)FW-RIL群體的生育期性狀在播期、家系以及播期與基因互作間存在極顯著差異，表明生育期性狀受播期影響、且與播期顯著互作。各階段生育期性狀在不同年份下遺傳率變現(xiàn)不同，表明可能存在年份與基因互作。

表1 不同年份下FW-RIL生育期各階段的描述性分析

2.3 同一年份不同播期下生育期QTL定位

在本研究中，同一年份不同播期下重復(fù)檢測(cè)到的生育期位點(diǎn)有18個(gè)(表3)，分布在A1、C2、D2、F、K、O、G、B1、D1b、I、M、N，連鎖群上。LOD值變化范圍2.51～46.30。PVE變化范圍0.43 %～11.33 %，多數(shù)為微效基因，來(lái)自親本KF14正向加性效應(yīng)等位基因型分別有3個(gè)，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有15個(gè)；來(lái)自親本KF15正向加性效應(yīng)等位基因型分別有6個(gè)，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有12個(gè)；來(lái)自親本HN48正向加性效應(yīng)等位基因型分別有6個(gè)，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有12個(gè)；來(lái)自親本KF19正向加性效應(yīng)等位基因型分別有7，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有11個(gè)。

2.4 不同年份下生育期QTL定位

在本研究中，不同年份下重復(fù)檢測(cè)的生育期位點(diǎn)有14個(gè)QTL(圖1)，分布在AJ、N、C1、D1b、D2、K、L、O、A2連鎖群上。LOD值變化范圍2.60～10.84。PVE變化范圍0.47 %～4.56 %，多數(shù)為微效基因，來(lái)自親本KF14正向加性效應(yīng)等位基因型分別有3個(gè)，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有11個(gè)；來(lái)自親本KF15正向加性效應(yīng)等位基因型分別有5個(gè)，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有9個(gè)；來(lái)自親本HN48正向加性效應(yīng)等位基因型分別有3個(gè)，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有11個(gè)；來(lái)自親本KF19正向加性效應(yīng)等位基因型分別有9，負(fù)向加性效應(yīng)等位基因型分別有4個(gè)。

表3 相同年份不同播期下FW-RIL生育期各階段QTL的重復(fù)定位

續(xù)表3 Continued table 3

3 討 論

3.1 光周期頓感QTLs

本研究有18個(gè)在相同年份不同播期下重復(fù)檢測(cè)位點(diǎn)(即光周期頓感QTLs)，比較公共圖譜發(fā)現(xiàn)有15個(gè)與前人發(fā)現(xiàn)QTL基因組相互重疊，其中4個(gè)QTL定位區(qū)間與已定位的光周期頓感QTLs區(qū)間相互重疊。qER1-C2-1在公共圖譜的基因組位置為106.478(BARCSOYSSR_06_1462)～112.189 cM(Satt557)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的6個(gè)成熟期、14個(gè)始花期、1個(gè)出苗期、1個(gè)營(yíng)養(yǎng)期和1個(gè)生殖期和2個(gè)光周期頓感QTL[10-11,13-14,17,21,27-28,30,32,37]相互重疊；qER1-F-2在公共圖譜的基因組位置為50.242(Satt595)～124.877 cM(AW756935)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期、1個(gè)出苗期、2個(gè)生殖期和1個(gè)光周期頓感QTL[13,29,36]相互重疊；qER1-K-1在公共圖譜的基因組位置為23.428(BARCSOYSSR_09_0183)～32.955 cM(Satt055)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的2個(gè)成熟期、1個(gè)始花期1個(gè)光周期頓感QTL[17,25,29]相互重疊；qR34-K-2在公共圖譜的基因組位置為4.853(Sat_087)～43.042 cM(Sct_196)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定3個(gè)成熟期、2個(gè)始花期和1個(gè)光周期頓感QTL[17,25,29,35]相互重疊。這些位點(diǎn)在相同年份不同播期下重復(fù)表達(dá)，且定位區(qū)間與已定位的光周期頓感QTL區(qū)間相互重合，說(shuō)明受播期環(huán)境影響較小,即為光周期頓感QTLs。

qER1-O-1在公共圖譜的基因組位置為5.44(Satt358)～8.748 cM(Sat_132)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期階段QTL[35]相互重疊；qR34-B1-1在公共圖譜的基因組位置為49.731(Sat_247)～53.412cM(Sat_128)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期QTL[7]相互重疊；qER6-G-1、qR13-G-1、qER3-G-1標(biāo)記區(qū)間相同，在公共圖譜的基因組位置為76.77(Satt288)～94.403 cM(Sct_199)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的8個(gè)成熟期和1個(gè)生殖期QTL[7-9,15]相互重疊；qR34-I-1在公共圖譜的基因組位置為84.481(Sat_324)～112.7 cM(Satt440)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期和個(gè)1出苗期QTL[48]相互重疊。qR78-B1-1在公共圖譜的基因組位置為84.189(Satt583)～100.877 cM(Sat_123)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期和1個(gè)生殖器QTL[10,35]相互重疊；qR78-N-1在公共圖譜的基因組位置為92.558(Satt257)～102.055 cM(Satt022)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的2個(gè)成熟期QTL相互重疊[15]；qR78-M-1在公共圖譜的基因組位置為53.538(Satt245)～75.571 cM(Satt677)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的2個(gè)成熟期、1個(gè)始花期、1個(gè)營(yíng)養(yǎng)期和1個(gè)生殖期QTL[9-10,13,19]相互重疊。qER1-K-2在公共圖譜的基因組位置為43.955(Satt247)～46.796 cM(Satt727)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期和1個(gè)營(yíng)養(yǎng)期QTL相互重疊[10,24]；qR34-D1b-4在公共圖譜的基因組位置為73.346(Satt290)～75.939 cM(Satt579)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期QTL[11,25]相互重疊。這些QTL雖然沒(méi)有與已發(fā)現(xiàn)的光周期頓感QTL區(qū)間相互重疊，但與生育期QTL區(qū)間相互重疊，為光周期頓感QTL的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)與材料。

圖1 不同年份下生育期QTL定位圖Fig.1 QTL location of growth period in different years

3.2 不同年份重復(fù)定位QTLs分析

在不同(2年或2年以上)年份重復(fù)定位QTL(表)有14個(gè)，比較公共圖譜發(fā)現(xiàn)有11個(gè)與前人發(fā)現(xiàn)QTL基因組相互重疊，qR34-C1-1在公共圖譜的基因組位置為82.506(Sat_042)～84.809 cM(Satt195)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的2個(gè)成熟期QTL[33]相互重疊；qR34-D1b-1在公共圖譜的基因組位置為35.745(Sat_373)～40.041cM(Satt701)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期QTL[35]相互重疊；qR34-D1b-2在公共圖譜的基因組位置為73.346(Satt290)～87.204 cM(Satt546)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期和3個(gè)始花期QTL[11,22,25]相互重疊；qR34-D1b-3在公共圖譜的基因組位置為87.204(Satt546)～98.745cM(Satt703)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)始花期QTL[34]相互重疊；qER5-J-1和qER6-J-1在公共圖譜的基因組位置相同為73.346(Satt290)～87.204 cM(Satt546)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)生殖期、1個(gè)成熟期和3個(gè)始花期QTL[14,39]相互重疊；qR34-K-1在公共圖譜的基因組位置相同為42.392(Satt349)～45.053 cM(BARCSOYSSR_09_0849)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)始花期、1個(gè)成熟期和1個(gè)營(yíng)養(yǎng)期QTL[10,24,35]相互重疊；qR34-L-1在公共圖譜的基因組位置相同為30.891(Sat_187)～115.072 cM(Sat_245)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的9個(gè)始花期個(gè)、12個(gè)成熟期、7個(gè)生殖期和1個(gè)出苗期QTL[9,12-13,16-19,21-23,25-27,31,34,37]相互重疊；qR34-L-2在公共圖譜的基因組位置相同為61.349(Satt076)～102.055 cM(Sat_245)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的8個(gè)始花期個(gè)、9個(gè)成熟期、6個(gè)生殖期和1個(gè)出苗期QTL[12-13,18-19,26-27,31,37]相互重疊；qR56-N-1在公共圖譜的基因組位置相同為37.976(Satt584)～115.072 cM(Satt022)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的3個(gè)成熟期QTL[15,24]相互重疊；qR34-O-1在公共圖譜的基因組位置相同為5.396(BARCSOYSSR_10_0066)～9.526 cM(Satt487)，所在基因組區(qū)域與已經(jīng)定位的1個(gè)成熟期QTL[35]相互重疊。表明這些QTLs在不同的年份、地區(qū)均可穩(wěn)定表達(dá)，受環(huán)境的影響相對(duì)較小。

3.3 一因多效位點(diǎn)QTL分析

以往研究中一些研究者在定位開(kāi)花期和成熟期基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，很多群體中與開(kāi)花期相連鎖的標(biāo)記位點(diǎn)同時(shí)與成熟期基因連鎖說(shuō)明控制開(kāi)花期和成熟期的遺傳機(jī)制相互聯(lián)系。本試驗(yàn)細(xì)致的對(duì)生育期每個(gè)進(jìn)程QTL進(jìn)行定位，討論不同生育階段遺傳機(jī)制關(guān)聯(lián)性。在于前人研究一致的位點(diǎn)中，qR78-B1-1所在基因組包含qR34-B1-1；qER3-G-1、qER6-G-1、qR13-G-1位于同一連鎖群，且標(biāo)記區(qū)間相同；qER5-J-1、qER6-J-1位于同一連鎖群，且標(biāo)記區(qū)間相同；qR34-K-2與qER1-K-1、qR34-K-1與qER1-K-2所在基因組區(qū)域相互重疊。qR56-N-1、qR78-N-1所在基因組區(qū)域相互重疊；qR34-O-1、qER1-O-1所在基因組區(qū)域相互重疊。這些QTLs位于同一連鎖群，且基因組區(qū)域緊密聯(lián)系，說(shuō)明這些QTLs可能為同一基因或基因緊密連鎖，其中R34與ER1生育期階段共有3對(duì)QTLs緊密聯(lián)系，進(jìn)一步佐證了前人關(guān)于大豆開(kāi)花期與成熟區(qū)的遺傳機(jī)制相互聯(lián)系的觀點(diǎn)，同時(shí)為揭示大豆各生育期階段的遺傳關(guān)系提供重要的參考。

本試驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)位點(diǎn)中qR45-A2-1、qR34-D2-1qER6-N-1、qR34-O-1，qER1-D2-2、qR34-I-1、qR78-B1-1，未與前人一致，這些位點(diǎn)在不同環(huán)境下被重復(fù)定位，在不同的生育期階段發(fā)揮作用，說(shuō)明這些位點(diǎn)的遺傳具有穩(wěn)定性，可以連續(xù)表達(dá)，它們的作用具有連續(xù)性，有些位點(diǎn)在全生育期階段沒(méi)有被檢測(cè)到，這可能是后期不同位點(diǎn)之間的相互作用或基因效應(yīng)的消減作用等掩蓋了該位點(diǎn)的表達(dá)效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究重復(fù)定位到32個(gè)與生育期各階段相關(guān)的QTL，其中18個(gè)同一年份不同播期下被重復(fù)定位，14個(gè)在不同年份下被重復(fù)定位。32個(gè)在多環(huán)境下被重復(fù)定位的位點(diǎn)中26個(gè)位點(diǎn)與前人研究一致，6個(gè)生育階段QTL位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)。