王志偉，喬祥梅，王志龍，楊金華，程加省，程 耿，于亞雄

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/國(guó)家小麥改良中心云南分中心，云南 昆明 650200)

【研究意義】小麥?zhǔn)俏覈?guó)的三大主要口糧作物之一，其產(chǎn)量高低直接關(guān)系著國(guó)家的糧食安全。干旱是限制小麥生產(chǎn)的最主要非生物因素之一，對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)的形成有著嚴(yán)重影響[1-2]。穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting，PHS)是一種影響小麥生產(chǎn)的外界環(huán)境脅迫災(zāi)害，不僅造成小麥籽粒產(chǎn)量和利用價(jià)值降低，而且對(duì)品質(zhì)有嚴(yán)重劣化作用[3-4]，常對(duì)小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。選育和推廣抗逆小麥品種是保障國(guó)家糧食安全、促進(jìn)小麥生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的有效途徑之一。明確云南小麥抗旱和抗穗發(fā)芽等抗逆性狀相關(guān)功能基因的組成分布，對(duì)今后云南小麥抗逆育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】小麥的抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)性狀，是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果，由多基因共同決定[5-6,8,11-12]。DREB(Dehydration responsive element binding)是植物應(yīng)答干旱、高鹽、高溫和低溫等非生物逆境的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子[7]。Shen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaDREB1應(yīng)答低溫、干旱和ABA脅迫。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DREB轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性明顯增強(qiáng)，脯氨酸含量是對(duì)照品種的2倍。Wei等[10]克隆了小麥TaDREB1基因，并將其定位于3B染色體上，位于標(biāo)記Xmwg818和Xfbb117之間。果聚糖外切水解酶1-FEHw3基因在極端干旱條件下對(duì)小麥中水溶性碳水化合物的再活化起著關(guān)鍵作用，在1-FEHw3基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件中發(fā)現(xiàn)SNP，推測(cè)1-FEHw3基因的Westonia等位基因型可能影響基因表達(dá)和酶活性水平，開發(fā)了該基因的CAP標(biāo)記；在2年干旱條件下驗(yàn)證，Westonia等位基因型與較高的千粒重相關(guān)，為抗旱有利等位基因型[11]。細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(CWI)是3種轉(zhuǎn)化酶之一，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。小麥細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因TaCWI-4A位于染色體4A上，在TaCWI-4A的啟動(dòng)子區(qū)域中檢測(cè)到2個(gè)SNP，TaCWI-4A基因的Hap-4A-C單倍型為抗旱有利基因型，在雨養(yǎng)生產(chǎn)地區(qū)表現(xiàn)為多穗粒數(shù)，而TaCWI-4A基因的Hap-4A-T單倍型為非抗旱有利基因型，在灌溉條件良好地區(qū)表現(xiàn)為高千粒重[12]。小麥穗發(fā)芽屬于數(shù)量性狀，受多基因控制，其抗性能力主要受種子休眠性、α-淀粉酶活性、種皮顏色和穎殼抑制物等因素影響，其中休眠性與其抗性能力呈顯著相關(guān)[13]。Vp-1基因位于小麥第3同源群染色體的長(zhǎng)臂上[14]，是小麥種子成熟、干燥及休眠的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既能促進(jìn)胚成熟，又可加速休眠并抑制其萌發(fā)[15]。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Vp-1基因的Vp-1B等位變異與穗發(fā)芽抗性相關(guān)，在3BL上開發(fā)出Vp-1B等位變異的STS標(biāo)記Vp-1B3，可對(duì)不同穗發(fā)芽抗性的小麥品種基因型進(jìn)行有效區(qū)分。TaSDR-B1基因?qū)π←溗氚l(fā)芽抗性起到重要調(diào)控作用，定位于小麥2BS染色體著絲點(diǎn)附近，有1個(gè)SNP(A/G)存在于其起始密碼子上游位點(diǎn)，其A類型命名為TaSDR-B1a，G類型命名為TaSDR-B1B；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TaSDR-B1a基因型發(fā)芽指數(shù)(GI值)顯著低于TaSDR-B1B基因型[17]。TaPHS1基因是MFT-like基因，來(lái)源于白粒小麥Rio Blanco，位于小麥3AS 染色體上，發(fā)現(xiàn)在TaPHS1基因中存在2個(gè)SNP引起的突變，可通過(guò)調(diào)控小麥成熟期的籽粒休眠對(duì)小麥穗發(fā)芽抗性起正向調(diào)節(jié)作用[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】KASP(Kompetitive allele specific PCR)技術(shù)具有穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確性高和成本低的特點(diǎn)，目前已經(jīng)在高通量SNP分型以及InDels檢測(cè)上被廣泛應(yīng)用[19-22]。Rasheed等[20]基于已克隆基因的序列，利用KASP技術(shù)開發(fā)了小麥抗旱性和穗發(fā)芽抗性相關(guān)功能基因的KASP標(biāo)記，可用于TaDreb-B1、1-fehw3、TaCwi-4A、TaPHS1、TaSdr-B1和TaVp-1B等功能基因的快速準(zhǔn)確檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用 3個(gè)抗旱性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記TaDreb_SNP、fehw3_SNP、CWI4A_SNP和3個(gè)穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記PHS_646、SDR_SNP、Vp1b1-83_IND，對(duì)42份云南育成的小麥品種(系)進(jìn)行抗旱和抗穗發(fā)芽等抗逆性狀相關(guān)基因單倍型檢測(cè)鑒定，旨在了解云南小麥品種(系)中抗逆性狀相關(guān)基因的組成分布狀況，篩選出含有目標(biāo)基因的優(yōu)異小麥種質(zhì)，為云南小麥抗逆育種提供材料和方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究所用材料為云南省內(nèi)相關(guān)育種單位選育的42份云南育成小麥品種和育成高代品系，品種信息見(jiàn)表2。

1.2 DNA提取

每份試驗(yàn)材料取8～10粒種子置于培養(yǎng)皿室溫下培養(yǎng)，萌發(fā)7 d后取幼苗葉片，采用CTAB法[23]提取基因組DNA。

1.3 KASP標(biāo)記檢測(cè)

供試材料的KASP標(biāo)記檢測(cè)工作委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所何中虎研究員課題組進(jìn)行。試驗(yàn)所用抗旱性和穗發(fā)芽抗性相關(guān)功能基因的6組KASP標(biāo)記引物來(lái)源于Rasheed等[20]設(shè)計(jì)，引物序列詳見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為10 μl，包括4.78 μl DNA (5～50 ng/μl)，5 μl KASP MasterMix(LGC公司，英國(guó))，0.14 μl KASP Assay Mix，0.08 μl Mg+。KASP Assay Mix是由3條引物的稀釋獲得，按FAM-引物(100 μmol/L)∶HEX-引物(100 μmol/L)∶通用引物(100 μmol/L)∶ddH2O=12∶12∶30∶46混合而成[19]。采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃熱處理15 min；95 ℃變性20 s，65～55 ℃退火和延伸25 s，10個(gè)降落循環(huán)(每循環(huán)降低1.0 ℃)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火和延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；4 ℃避光保存[19]。PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 PCR儀上(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行。每次反應(yīng)設(shè)置4個(gè)空白對(duì)照組，其DNA模板用ddH2O代替。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熒光掃描，并做基因分型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥品種(系)抗旱性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)

TaDreb-B1基因分型結(jié)果(表2、圖1-a)發(fā)現(xiàn)，云麥42等有23份品種(系)為TaDreb-B1基因的TaDREB-B1a耐旱單倍型，頻率為54.76 %；云麥39等19份品種(系)為TaDreb-B1基因的TaDREB-B1B水分敏感單倍型，頻率為45.24 %。1-fehw3基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云麥39等24份品種(系)為1-fehw3基因的Westoniatype抗旱單倍型，頻率為57.14 %；云麥53等17份品種(系)為1-fehw3基因的Kauztype非抗旱單倍型，頻率為40.48 %。TaCwi-4A基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云麥39等35份品種(系)為TaCwi-4A基因的Hap-4A-C抗旱單倍型，頻率為83.33 %；云麥73等7份品種(系)為TaCwi-4A基因的Hap-4A-T非抗旱單倍型，頻率為16.67 %。

2.2 供試小麥品種(系)穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的KASP標(biāo)記檢測(cè)

TaPHS_646基因分型結(jié)果(表2、圖1-b)發(fā)現(xiàn)，云麥39等35份品種(系)為TaPHS_646基因的RioBlanceotype抗穗發(fā)芽單倍型，頻率為83.33 %；云麥69等4份品種(系)為TaPHS_646基因的NW97S186type感穗發(fā)芽單倍型，頻率為9.52 %。TaSdr-B1基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云麥76等17份品種(系)為TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗發(fā)芽單倍型，頻率為40.48 %；云麥39等24份品種(系)為TaSdr-B1基因的TaSdr-B1B感穗發(fā)芽單倍型，頻率為57.14 %。TaVp-1B基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云麥39等29份品種(系)為TaVp-1B基因的Vp1B1c抗穗發(fā)芽單倍型，頻率為69.05 %；云麥73等7份品種(系)為TaVp-1B基因的Vp1B1a感穗發(fā)芽單倍型，頻率為16.67 %。

2.3 供試小麥品種(系)抗旱性和穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的分布

如表2所示，聚合3個(gè)抗旱性相關(guān)基因抗性單倍型(TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C)的小麥品種(系)有11份，分別是云麥42、云麥62、云麥68、云麥76、云15D4-15、云154-65、宜麥2號(hào)、保麥2號(hào)、靖麥12、靖麥14、楚麥16號(hào)，頻率為26.19 %；聚合3個(gè)穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因抗性單倍型(RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c)的小麥品種(系)有10份，分別是云麥52、云麥76、云麥77、云麥78、云16D4-13、云6-14、云124-6、彌12V4-15、易122-329、保麥2號(hào)，頻率為23.81 %；同時(shí)聚合抗旱性和穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因6個(gè)有利單倍型(TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C/RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c)的小麥品種(系)僅有云麥76和保麥2號(hào)2份品種，頻率為4.76 %。

表2 42份云南小麥抗旱性和穗發(fā)芽抗性的KASP標(biāo)記基因分型

續(xù)表2 Continued table 2

圖1 42份云南小麥中抗旱性和穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的分布頻率Fig.1 Frequency of genes associated with drought tolerance and PHS resistance in 42 wheat cultivars

3 討 論

與傳統(tǒng)SNP檢測(cè)平臺(tái)相比，高通量的KASP檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確性高和低成本的特點(diǎn)[19]。Rasheed等[20]利用這一簡(jiǎn)便高效的技術(shù)，開發(fā)了70余個(gè)高通量KASP功能標(biāo)記，可對(duì)小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和適應(yīng)性等相關(guān)基因進(jìn)行有效鑒定。鄒景偉等[24]、張維軍等[25]、楊子博等[26]、張宏軍等[27]分別利用KASP功能標(biāo)記對(duì)不同類型小麥品種的不同性狀相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)KASP標(biāo)記輔助選擇能顯著地提高小麥育種效率。本研究利用KASP標(biāo)記結(jié)合序列測(cè)定準(zhǔn)確、快速地鑒定出云南小麥品種(系)的抗旱和抗穗發(fā)芽等抗逆性相關(guān)基因型，為云南小麥抗逆育種提供了材料和方法。

抗旱性和穗發(fā)芽抗性改良是小麥抗逆育種的重要育種目標(biāo)，但小麥抗旱性、穗發(fā)芽抗性均屬于多基因控制的數(shù)量性狀，其抗性機(jī)理十分復(fù)雜[28]。云南小麥2/3以上種植于貧瘠山區(qū)旱地，受典型立體氣候影響，生長(zhǎng)階段頻發(fā)冬春季節(jié)性干旱，麥?zhǔn)占竟?jié)受雨季影響易受穗發(fā)芽損害，因此抗旱、抗穗發(fā)芽等抗逆性狀一直是云南小麥育種的關(guān)鍵選育目標(biāo)，而明確云南育成小麥品種(系)中抗旱、抗穗發(fā)芽相關(guān)基因的組成分布，有助于今后云南小麥抗逆育種工作的開展。利用TaDreb_SNP標(biāo)記、fehw3_SNP標(biāo)記、CWI4A_SNP標(biāo)記對(duì)42份供試品種(系)抗旱性相關(guān)基因型進(jìn)行檢測(cè)，篩選出含TaDreb-B1基因TaDREB-B1a耐旱單倍型的品種(系)23份、1-fehw3基因Westoniatype抗旱單倍型的品種(系)24份、TaCwi-4A基因Hap-4A-C抗旱單倍型的品種(系)35份，頻率分別為54.76 %、57.14 %、83.33 %，研究結(jié)果表明云南小麥的總體抗旱性水平較高。

小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因多于種皮色澤、種子休眠、內(nèi)源激素調(diào)控、α-淀粉酶活性等特性有關(guān)，僅有少數(shù)相關(guān)基因位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)較大[24-25，29]。利用PHS_646標(biāo)記、SDR_SNP標(biāo)記、Vp1b1-83_IND標(biāo)記對(duì)42份供試品種(系)抗穗發(fā)芽相關(guān)基因型進(jìn)行檢測(cè)，篩選出含TaVp-1B基因的Vp1B1c抗穗發(fā)芽單倍型的品種(系)29份，頻率為69.05 %，接近于中國(guó)推廣小麥品種抗穗發(fā)芽的平均頻率71.7 %[29]，但低于四川小麥品種抗穗發(fā)芽的平均頻率83.8 %[30]；篩選出含TaPHS_646基因RioBlanceotype抗穗發(fā)芽單倍型的品種(系)35份，頻率為83.33 %，與鄒景偉等[24]研究結(jié)果一致；篩選出含TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗發(fā)芽單倍型的品種(系)17份，頻率為40.48 %。研究結(jié)果顯示云南小麥的總體穗發(fā)芽抗性水平較高。

從多基因聚合角度分析，11份品種(系)為3個(gè)抗旱基因TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C抗旱性單倍型組合，頻率為26.19 %；10份品種(系)為3個(gè)抗穗發(fā)芽基因RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c穗發(fā)芽抗性單倍型組合，頻率為23.81 %；僅有云麥76和保麥2號(hào)聚合抗旱性和穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因，為TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C/RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c抗性單倍型組合，頻率為4.76 %。上述品種可直接在今后抗旱性和抗穗發(fā)芽的聚合育種中作親本利用，是云南小麥抗逆育種和品質(zhì)改良的捷徑。對(duì)比品種的實(shí)際抗旱性、穗發(fā)芽抗性與基因檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)部分品種存在不吻合的情況，如云麥54、云麥69和云麥72是云南省審定的典型旱地小麥品種，但檢測(cè)為TaDREB-B1b/Kauztype非抗旱單倍型；檢測(cè)為NW97S186type感穗發(fā)芽單倍型的鳳麥32和鳳麥36屬于穗發(fā)芽抗性品種，檢測(cè)為RioBlanceotype/Vp1B1c抗穗發(fā)芽單倍型的鳳麥34屬于感穗發(fā)芽品種，且穗發(fā)芽率大于98 %[31]。上述結(jié)果充分說(shuō)明抗旱性和穗發(fā)芽抗性等抗逆性狀均是由多基因位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀，品種實(shí)際抗逆性水平是多個(gè)基因調(diào)控的綜合作用結(jié)果，品種抗逆性需兼顧表型和基因性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，同時(shí)需大力發(fā)掘更多相關(guān)基因位點(diǎn)的功能，才能實(shí)現(xiàn)更好地在抗逆分子標(biāo)記輔助育種中加以應(yīng)用。

4 結(jié) 論

42份供試云南小麥品種(系)在抗旱性和穗發(fā)芽抗性等抗逆性狀相關(guān)基因組成上具有豐富的多態(tài)性，在云南小麥抗逆育種中加大TaDreb-B1、1-feh-w3、TaCwi-4A、TaPHS1、TaSdr-B1、TaVp-1B等基因有利單倍型的聚合利用，可有效的綜合提高云南小麥抗逆性。