霍鴻浩，楊占南，羅世瓊，張曲玲，韋小芳，趙 鋮，扶 蝶

(1. 貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001； 2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

【研究意義】種子作為種子植物的繁殖體，繼承了母體的遺傳物質(zhì)，體現(xiàn)母體適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化下的繁殖對(duì)策[1]，根據(jù)生活史對(duì)策理論，不同地源種群所處的生境不同，勢(shì)必導(dǎo)致種群間個(gè)體表現(xiàn)不同，即出現(xiàn)不同的表現(xiàn)型并通過種子影響后期植物的命運(yùn)[2]，這也是藥用植物形成道地性的原因之一[3]。其中種子大小是植物生活史策略的一個(gè)核心特征及植物分類及遺傳研究的重要指標(biāo)，在植物的諸多性狀的研究中，處于中心地位[4]。而研究草本植物種子大小的地源差異及幼苗的更新策略關(guān)系對(duì)中藥材生產(chǎn)有重要意義。種子種苗是藥材生產(chǎn)最基本、最重要的生產(chǎn)資料，優(yōu)良的種子及種苗是提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的先決條件[5]。黃花蒿 (ArtemisiaannuaL.) 俗稱中藥里的“青蒿”，為菊科蒿屬1年生草本植物，具有清熱解暑，除蒸截瘧，退黃等功效，為我國傳統(tǒng)的中草藥[6]。近代醫(yī)學(xué)研究表明，黃花蒿所含的多種生物活性成分，如倍半萜類 (包括青蒿素)、黃酮類、多糖類、香豆素類、揮發(fā)油類及酚類等，有抗瘧疾[7]、抗癌[8]、抗炎抗菌[9]、抗腫瘤[10]和抗氧化及較強(qiáng)的免疫活性[11]等作用。其青蒿素可治療瘧疾最引人注目，日前已成為我國唯一獲得國際承認(rèn)的擾瘧藥物，而黃花蒿是提取青蒿素的唯一天然原料來源[12]。我國雖然大部分地區(qū)均有黃花蒿分布，但不同產(chǎn)地黃花蒿的藥效組分與其植物產(chǎn)量差異顯著，加之黃花蒿植物的自交障礙導(dǎo)致性狀不穩(wěn)定，增加了黃花蒿資源利用難度[13]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前黃花蒿不同環(huán)境因子下的資源地理分布差異的研究較多[14-15]，但種子形態(tài)的地源差異及差異對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響研究報(bào)道很少，不同地源黃花蒿種群的不同繁殖對(duì)策導(dǎo)致種子形態(tài)和營(yíng)養(yǎng)成分顯著差異，這種差異對(duì)植物后期的生長(zhǎng)有重要影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】黃花蒿種子萌發(fā)及幼苗的形成階段受遺傳物質(zhì)和環(huán)境的影響，為了排除不同地源環(huán)境因素的影響，有必要對(duì)不同種源種子在相同環(huán)境條件下進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】試驗(yàn)以貴州為主的不同地源黃花蒿種子為研究對(duì)象，比較黃花蒿種子在不同地理空間格局下的形態(tài)學(xué)差異，并在溫室內(nèi)比較萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)狀況，建立地理因子與相關(guān)性分析，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行地理聚類及綜合評(píng)價(jià)，揭示不同地理格局的種子變異規(guī)律。為黃花蒿種子篩選與形態(tài)研究提供實(shí)踐參考，也為黃花蒿品種選育、品質(zhì)鑒定以及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2017年11月中旬種子成熟期間，按經(jīng)度、緯度和海拔梯度設(shè)置樣地，在貴州、甘肅、湖南3個(gè)省境內(nèi)實(shí)地采集11個(gè)種群野生黃花蒿種子，采樣地理信息見表1。采樣時(shí)建立20 m × 20 m的采樣地，收割健康果期黃花蒿地上部分，帶回實(shí)驗(yàn)室陰干干燥保存。隨機(jī)取樣，去除枝葉，過1 mm篩去除苞片小花等雜質(zhì)，再用0.18 mm細(xì)篩去其他細(xì)小雜質(zhì)，篩選后種子分別編號(hào)儲(chǔ)藏于通風(fēng)干燥處備用。

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài)測(cè)定 用鑷子小心從篩選樣品中分出凈種子，按不同地源編號(hào)，在顯微鏡下觀察種子形態(tài)，并使用OPTPro軟件隨機(jī)讀取10組成熟飽滿端正黃花蒿種子的長(zhǎng) (Ls)、寬值 (Ws)，計(jì)算出長(zhǎng)寬比 (Ls/Ws)[16]。千粒重使用萬分之一天平，每種源挑100粒健康飽滿的種子測(cè)量，重復(fù)3次取平均值。

1.2.2 盆栽土處理及種子萌發(fā)幼苗試驗(yàn) 試驗(yàn)地點(diǎn)在貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)采用盆栽培養(yǎng)，盆栽土來自貴陽阿栗山的天然有機(jī)土，黑褐色、輕質(zhì)。土壤拌勻晾曬3 d后均勻裝盆，并進(jìn)行土壤背景值測(cè)定，土壤pH 7.12，含有機(jī)質(zhì) 56.7 g /kg、全氮1.75 g/kg、全鉀11.6 g/kg，有效鉀348.8 mg/kg，有效磷59.56 mg /kg。育苗盆每盆100粒凈種子均勻平鋪，再均勻覆蓋3 cm細(xì)沙土，小心澆水濕潤(rùn)。于(25±1) ℃ 恒溫室、自然光照下培養(yǎng)，每天記錄發(fā)芽情況直至發(fā)芽結(jié)束，發(fā)芽數(shù)以子葉突破薄土層為準(zhǔn)。萌發(fā)結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)幼苗，觀察幼苗生長(zhǎng)與形態(tài)至第20天結(jié)束試驗(yàn)。

表1 黃花蒿種源采集地信息

1.2.3 幼苗形態(tài)測(cè)定 利用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量不同地源幼苗莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、第一對(duì)真葉長(zhǎng)、寬。記錄幼苗真葉數(shù)并使用萬分之一天平測(cè)量植株鮮重、子葉鮮種，重復(fù)5次計(jì)算平均值、方差、變異系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過 Excel 統(tǒng)計(jì)分析與作圖，SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。利用 Pearson相關(guān)分析法分析各指標(biāo)間的相關(guān)性；并綜合各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析對(duì)種子進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。R語言建立種子形態(tài)與幼苗特征與主要環(huán)境因子的冗余(RDA)分析。RDA分析法能有效對(duì)多個(gè)環(huán)境指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，可更好地反映群落特征與環(huán)境因子之間的關(guān)系。通過環(huán)境因子箭頭在橫坐標(biāo)上作垂線，投影線段最長(zhǎng)的為最主要的環(huán)境因子，通過參數(shù)箭頭之間的夾角來表示參數(shù)與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，夾角越小，表示相關(guān)性越高，夾角為銳角表示正相關(guān)，夾角為鈍角表示負(fù)相關(guān)，夾角接近直角表示相關(guān)性很小[17]。

萌發(fā)率=發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100 %

變異系數(shù) (c.v.) 表示表型性狀的離散性特征，變異系數(shù)越大，性狀值離散程度越大[18]。

c.v.=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100 %

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿種子形態(tài)觀察

黃花蒿為1年生草本植物，由于環(huán)境因子不同導(dǎo)致黃花蒿的生殖對(duì)策有所不同，不同地源黃花蒿的花期在8-10月，果期在10月至11月中旬。觀察發(fā)現(xiàn)，來自11個(gè)地方的黃花蒿花序、小花、種子在大小形態(tài)上各異，但是也有共同的特征。由圖1可見，果期的黃花蒿葉片分化成球形頭狀花序，黃色球形，下垂密集分布在全株中上部；每一頭狀花序有短花柄，并由2～3層線形苞片組成，在光學(xué)顯微鏡下觀察，苞片中央不透明，邊緣呈淡黃色并成膜質(zhì)狀而透明?？偘行』ㄈ舾桑鶠楣軤罨?，種子微小，在顯微鏡下可見不同地源黃花蒿種子均呈梨形或倒卵形瘦果，表面淡黃綠色，無毛，具有隆起的縱條紋及不規(guī)則的網(wǎng)狀條紋。

2.2 黃花蒿種子形狀特征的地源變異

從表2可知，各采集地源黃花蒿種子平均長(zhǎng)、寬均出現(xiàn)明顯的變異特征。其中 Ls 在606.7 ～860.4 μm，平均為751.5 μm。Ws 在280.3～417.7 μm，平均為363.6 μm。長(zhǎng)寬比以LD最小，為2.00；SS最大，為2.24，所有地源的平均為2.06，可見SS的種子較其他地源最為狹長(zhǎng)。千粒重最大的地源是LP，平均為0.0665 g；LD最小，為0.0538 g。根據(jù)計(jì)算性狀在11個(gè)地源間的變異系數(shù)，各性狀值離散程度由大到小依次為Ws (10.40 %)>Ls (9.94 %)>千粒重 (7.13 %)>Ls /Ws (3.31 %)，表明Ws在地源間變化最大，長(zhǎng)寬比最小。經(jīng)方差分析，黃花蒿種子的Ls/Ms在不同地源間差異顯著 (P= 0.027*)，Ls、Ms、千粒重在不同地源間差異極顯著 (P=0.000**)，可見種子大小存在明顯的地理變異。

2.3 不同地源黃花蒿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)差異

黃花蒿種子無休眠期，在濕潤(rùn)溫暖環(huán)境下萌發(fā)較易。從表3可知，不同地源間種子萌發(fā)率及幼苗表現(xiàn)存在不同程度變異。萌發(fā)率依次為JH

A為黃花蒿種子，B為黃花蒿花苞苞片，C為黃花蒿花序，D為黃花蒿的兩性花A.A.annua seed; B.A.annua bud bracts; C.A.annua inflorescence; D.bisexual flower of A.annua圖1 黃花蒿種子及附屬物Fig.1 Seeds and appendages of A.annua

表2 黃花蒿種子大小與變異特征

2.4 不同地源黃花蒿種子表型性狀間的相關(guān)性

從表4可知，種子特征與苗期各指標(biāo)間存在不同程度的相關(guān)性。其中Ls與Ws、根長(zhǎng)、真葉數(shù)和子葉鮮重顯著相關(guān)，與莖長(zhǎng)極顯著相關(guān)。Ls/Ws與各指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。種子千粒重與Ls、Ws均成顯著正相關(guān)，說明黃花蒿種子越長(zhǎng)越寬其千粒重越大。種子千粒重與子葉鮮重、真葉數(shù)、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、干重呈極顯著正相關(guān)，說明種子千粒重為鑒定黃花蒿種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，其千粒重越大子葉鮮重越大，為幼苗的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存更多的營(yíng)養(yǎng)與能量。

表3 黃花蒿種子萌發(fā)率及幼苗形態(tài)指標(biāo)與變異特征

2.5 表型性狀與地理生態(tài)因子間的RDA分析

從圖2可知，不同地理因子對(duì)黃花蒿種子和萌發(fā)的影響大小存在差異。年降水量是最主要的影響因子，其次是經(jīng)度、緯度和海拔高度。其中，年降水量和經(jīng)度與各指標(biāo)呈不同程度的正相關(guān)，即隨著年降水量和經(jīng)度的增加，Ls、Ws、千粒重和幼苗的萌發(fā)率、莖長(zhǎng)、干重及葉片大小均越大。緯度與海拔和各指標(biāo)呈不同程度的負(fù)相關(guān)，海拔越高、緯度越高的地源，黃花蒿種子長(zhǎng)寬、千粒重及幼苗萌發(fā)率越低。Ls/Ws與各環(huán)境因子相關(guān)程度不大，可能與Ls/Ws大小在各地源相對(duì)穩(wěn)定有關(guān)。

2.6 地理聚類分析

從圖3可知，11群體劃分為3個(gè)類群。XBS、SY、LP聚為1類，綜合品質(zhì)表現(xiàn)最好； JH、HX、KY、WX、XW和SS聚為1類； QX、LD聚為第3類，綜合品質(zhì)表現(xiàn)最差。

圖2 黃花蒿種子及幼苗各特征參數(shù)與地理因子的RDA分析Fig.2 Redundancy analysis of characteristic parameters and geographical factors of seeds and seedlings of A.annua

3 討 論

種子形態(tài)研究不僅可以為植物科、屬和種分類提供依據(jù)，而且可以為該屬系統(tǒng)演化提供有價(jià)值的參考資料[19]。11個(gè)地源黃花蒿均呈梨形或倒卵形瘦果，表面淡黃綠色，具有隆起的縱條紋及不規(guī)則的網(wǎng)狀條紋，初步說明不同地源空間黃花蒿種子形態(tài)基本穩(wěn)定。但是不同地源黃花蒿L(fēng)s、Ws、千粒重差異極顯著，Ls/Ws差異顯著，變異程度Ws>Ls>千粒重>Ls/Ws，種子寬對(duì)變異貢獻(xiàn)最大。表明黃花蒿種子的大小及重量在不同生態(tài)條件下并不是穩(wěn)定的，且具有一定的遺傳性，與韋美麗[20]不同種源在云南氣候下種植下的種子形態(tài)差異的研究結(jié)果相似。說明不同地源黃花蒿種子變異程度較大，可能是因?yàn)辄S花蒿作為抗旱抗瘠的先鋒植物，在我國各地廣泛分布，能適應(yīng)各種環(huán)境。

種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和植株成熟結(jié)果被視為植物生活史的三大特征[21]，其有性繁殖體—種子，是其重要的連接點(diǎn)。種子萌發(fā)受到遺傳物質(zhì)和復(fù)雜生境的影響，而利用種子形態(tài)來研究物種的遺傳變異是直接可行的手段。為了排除復(fù)雜生境的干擾，對(duì)不同地源黃花蒿種子在相同適宜的環(huán)境下進(jìn)行萌發(fā)，結(jié)果表明不同地源黃花蒿種子萌發(fā)率、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、干重、子葉鮮重、真葉數(shù)、真葉長(zhǎng)、真葉寬等指標(biāo)在一定范圍內(nèi)變化，說明不同地源黃花蒿種子在環(huán)境異質(zhì)性下產(chǎn)生了變異，且會(huì)通過遺傳繼續(xù)影響后代幼苗的更新及生活史對(duì)策。通過種子大小與幼苗特征的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，黃花蒿種子千粒重對(duì)幼苗各個(gè)指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)(萌發(fā)率除外)，說明千粒重可以作為黃花蒿引種的重要指標(biāo)。故認(rèn)為前人發(fā)現(xiàn)黃花蒿資源目標(biāo)性狀的差異均可能直接來自種子的遺傳差異。朱衛(wèi)平[22]通過采集3個(gè)種源的黃花蒿種子進(jìn)行人工種植試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉的形態(tài)與青篙素的含量關(guān)系密切，其中以狹裂絲狀型的葉片青蒿素的含量最高。楊美權(quán)[23]通過采集67份黃花蒿種質(zhì)在昆明進(jìn)行種植，發(fā)現(xiàn)21個(gè)農(nóng)藝性狀的差異。韋樹根[24]采集主產(chǎn)區(qū)72份引種在廣西南寧和靖西，發(fā)現(xiàn)不同黃花蒿種質(zhì)之間的葉片產(chǎn)量和青蒿素質(zhì)量差異顯著。

圖3 黃花蒿種子及幼苗表型性狀聚類Fig.3 Clustering of phenotypic traits of seeds and seedlings of A.annua

通過R語言建立種子形態(tài)與幼苗特征與主要環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果顯示，年降雨量為主要影響種子表現(xiàn)的因子，表明原位環(huán)境更濕潤(rùn)的黃花蒿種子表現(xiàn)更優(yōu)，與黃花蒿喜向陽潮濕環(huán)境的結(jié)果一致[25]。也有研究解釋了種子大小差異是對(duì)適應(yīng)干旱擾動(dòng)的響應(yīng)，如在干旱條件下，Pastinacasativa小粒種子幼苗比其大粒種子幼苗蒸騰水分少[26]。研究發(fā)現(xiàn)，采集地由西向東，由北向南變化的同時(shí)，黃花蒿種子的大小、質(zhì)量越大，這與我國黃花蒿優(yōu)質(zhì)資源的分布相似[27]，可見種子的品質(zhì)與資源的優(yōu)質(zhì)有一定相關(guān)性。

種子品質(zhì)較好的地源為貴州省貴陽云巖區(qū)相寶山、黎平城關(guān)鎮(zhèn)與湖南省邵陽隆回縣開智村。RDA分析的結(jié)果有一定差異，說明影響種子品質(zhì)的因素復(fù)雜，除了氣候，還受到土壤、生物及人為等因素相互聯(lián)系制約的影響，不能單一環(huán)境因子對(duì)黃花蒿種子資源進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)，各環(huán)境生物因子及非生物因子對(duì)植物的單一影響共同組成了物種的地理變異規(guī)律，要結(jié)合種子形態(tài)觀察和萌發(fā)試驗(yàn)，對(duì)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)潛力做進(jìn)一步篩選。種源的優(yōu)質(zhì)對(duì)植株后期的生長(zhǎng)及后代種子的影響還有待下一步的實(shí)驗(yàn)觀察及田間試驗(yàn)驗(yàn)證，為地區(qū)用種及合理調(diào)撥提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

顯微鏡下不同地源黃花蒿種子形態(tài)均呈表面黃綠色梨形或倒卵形瘦果，不同地源黃花蒿種子的長(zhǎng)寬比差異顯著；Ls，Ws、千粒重差異極顯著，變異程度Ws>Ls>千粒重>Ls/Ws。不同地源黃花蒿種子萌發(fā)率、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、干重、子葉鮮重、真葉數(shù)、真葉長(zhǎng)、真葉寬均有不同程度的變異。年降水量為影響黃花蒿種子表型差異的主要相關(guān)因子，其次是經(jīng)度、緯度、海拔。綜合種子形態(tài)及幼苗生長(zhǎng)狀況將11個(gè)地源種子初步劃分為3個(gè)組群。黃花蒿種子大小形態(tài)受環(huán)境因子影響存在明顯的地理變異，這對(duì)于黃花蒿種源評(píng)價(jià)及種子調(diào)撥生產(chǎn)具有重要參考價(jià)值。