鐘 宇，曹敬東，鄭元仙，王繼明，許銀蓮，童文杰，藺忠龍，楊 敏，魏 薇，黃飛燕，劉佳妮，閆 鼎，蔡憲杰，陳小龍，余 磊*，何元勝*

(1. 昆明學院農(nóng)學與生命科學學院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；2.云南省煙草公司臨滄市公司，云南 臨滄 677000；3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 昆明 650201；4.中國煙草總公司云南省公司，云南 昆明 650011；5.上海煙草集團有限責任公司，上海 200082；6.河南中煙工業(yè)有限責任公司原料采購中心，河南 鄭州 450000)

【研究意義】土壤是農(nóng)作物生長的重要介質(zhì)，維持土壤良好的微生態(tài)環(huán)境是保障作物群體生產(chǎn)力的重要前提?？緹熯B作障礙是烤煙生產(chǎn)中的一大難題[1]，有必要開發(fā)植煙土壤調(diào)理及修復的有效方法，提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量?！厩叭搜芯窟M展】連作會導致土壤自毒物質(zhì)積累[2]、營養(yǎng)物質(zhì)失衡[3]、微生物數(shù)量減少[4-5]等問題。土壤微生物能夠促進土壤有機質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，是維持土壤生態(tài)平衡的重要組成部分。研究表明，土壤中的酚酸類物質(zhì)與土壤微生物活性有著密切的關(guān)系[6]，能夠顯著影響土壤微生物數(shù)量和多樣性，從而影響土壤養(yǎng)分和植物的生長發(fā)育。酚酸對土壤微環(huán)境的調(diào)控體現(xiàn)在：一方面，酚酸在不影響植株正常生長的低濃度情況下就可以通過直接的自毒作用或間接的抑制或促進作用影響微生物活性[7]，另一方面，不同微生物對酚酸的響應(yīng)不同，作物持續(xù)分泌某些促進病原菌生長的酚酸會改變土壤微生物結(jié)構(gòu)，如黃瓜根系分泌的香豆素對土傳病原菌生長有顯著促進作用[8]，香草醛能夠影響黃瓜根際鐮刀菌群落結(jié)構(gòu)[9]，這也是連作作物土傳病害逐年嚴重的主要原因之一。 微生物菌劑是現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)制備而成的活菌制劑，具有增加土壤肥力、改善土壤微生物結(jié)構(gòu)的作用[10]。Yang等報道微生物菌劑能夠改變煙草根際土壤微生物功能多樣性，從而改善植煙土壤微環(huán)境，減輕土傳病害[11]。譚兆贊等施用復合微生物菌劑提高了土壤微生物多樣性指數(shù)，有效緩解了番茄青枯病[12]。施用微生物菌劑能增加根際土壤有益細菌和真菌，減少土傳病原菌，從而有效減輕蘆蒿、黃瓜等作物土傳病害[13-14]。王佳佳等研究微生物菌劑對土壤化感物質(zhì)的響應(yīng)，結(jié)果表明，微生物菌劑能夠顯著降低土壤酚酸積累量，改善土壤理化性質(zhì)[15]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來對微生物菌劑的研究多集中于改善土壤理化性質(zhì)或改善土壤微生物多樣性方面，微生物菌劑對植煙土壤的修復作用，以及在微生物菌劑處理下土壤酚酸類物質(zhì)與微生物數(shù)量的變化及二者的相關(guān)性鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對植煙土壤微生態(tài)失衡、土傳病害嚴重問題，研究不同微生物菌劑對土壤酚酸含量和微生物數(shù)量的調(diào)節(jié)作用，為利用微生物菌劑修復連作障礙植煙土壤提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為“云煙87”。供試微生物菌劑為雙藻菌露200微生物菌劑，由青島海大生物集團有限公司提供，其功能菌為地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis) 和巨大芽孢桿菌 (B.megateriu)，有效活菌數(shù)≥200.0億/g。農(nóng)用微生物菌劑，由山東領(lǐng)拓農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，其功能菌為解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)≥30.0億/mL?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌 (B.licheniformis) 復合粉劑，由云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心提供，有效活菌數(shù)≥5.0億/g。

1.2 試驗地概況

試驗地位于云南省臨滄市耿馬縣勐撒鎮(zhèn) (99°23′22′′E, 23°33′ 40′′N)，海拔1120 m，土壤類型為紅壤，質(zhì)地為輕粘土。試驗地土壤pH值為4.69，有機質(zhì)含量為29.13 g/kg，水解性氮含量為155.28 mg/kg，有效磷含量為8.84 mg/kg，速效鉀含量為145.97 mg/kg。

1.3 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)3個處理，1個對照。處理T1，施用雙藻菌露200微生物菌劑6 kg/hm2；處理T2，施用農(nóng)用微生物菌劑75 L/hm2；處理T3，施用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌復合粉劑300 kg/hm2；處理4 (CK)，空白對照，同期等量清水灌根。微生物菌劑于作物全生育期內(nèi)施用1次，用量為400 mL/株，作物移栽當天邊灌根邊移栽，區(qū)組排列隨機，每小區(qū)種植30株，每個處理重復3次。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤樣品采集 于打頂7 d后，利用5點取樣法采取每個處理煙株根際土壤2 kg，立即置于4 ℃保存，用于酚酸含量和土壤微生物的測定。

1.4.2 根際土壤酚酸類物質(zhì)測定 土壤酚酸類物質(zhì)的測定采用高效液相色譜法進行。稱取20 g供試土樣加入100 mL NaOH (2 mol/L)震蕩提取3 h，于4 ℃靜置3 h，上清液用乙酸乙酯萃取后45 ℃蒸干，加入5 mL 色譜純甲醇，過0.22 μm濾膜。濾液用外標法測定酚酸類化合物，混和標準樣品為0.1 μg/mL對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸。

色譜儀為WATERS2695高效液相色譜儀 (美國WATERS公司)，色譜柱為Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm, 美國WATERS公司)，流動相A、B分別為0.3 %乙酸水溶液和甲醇，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μl。洗脫程序：0 min：95 %流動相A，5 %流動相B；1 min：80 %流動相A，20 %流動相B；5 min：70 %流動相A，30 %流動相B；7.5 min：20 %流動相A，80 %流動相B；10 min：95 %流動相A，5 %流動相B。

1.4.3 土壤微生物數(shù)量測定 根際土壤細菌、真菌和放線菌種群數(shù)量測定采用稀釋平板計數(shù)法，細菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、水 1000 mL、pH 7.0)，真菌培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基 (葡萄糖1 g、蛋白胨0.5 g、KH2PO4·3H2O 1 g、MgSO4·7H2O 0. 5 g、1 mg/mL孟加拉紅3.3 mL、瓊脂 15 g、水 1000 mL)，放線菌培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基 (可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 15 g、水 1000 mL、pH 7.4～7.6)。微生物數(shù)量以每克樣品的菌數(shù)表示，每克樣品中菌數(shù)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.4.4 煙株農(nóng)藝性狀和生物量測定 于打頂后7 d，測定各處理組代表性煙株農(nóng)藝性狀指標及煙株地上部 (莖、葉)、地下部 (根) 鮮重和干重，每個處理3株。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑對根際土壤酚酸類物質(zhì)含量的影響

圖1表明，微生物菌劑的施用能夠顯著降低對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸5種酚酸類物質(zhì)在根際土壤中的積累。處理T1較處理T4 (CK)分別降低了59.76 %、19.16 %、59.30 %、66.08 %和74.83 %；處理T2較處理T4 (CK)分別降低了57.00 %、65.00 %、51.00 %、53.00 %和65.00 %；處理T3較處理T4 (CK)分別降低了21.25 %、24.04 %、15.12 %、32.94 %、45.03 %。處理T1和處理T2對阿魏酸的降低效果最為顯著，降幅分別為74.83 %和65.00 %。從總體看，處理T2對各類酚酸含量的降低效果最好，降幅達51.00 %～65.00 %。

圖1 不同處理根際土壤酚酸類物質(zhì)含量Fig.1 Soil phenolic acid contents with different treatments

2.2 微生物菌劑對根際土壤微生物數(shù)量的影響

利用平板稀釋分離計數(shù)法測定根際土壤微生物群落組成和數(shù)量。從表1可見，微生物菌劑處理下細菌、真菌和放線菌的數(shù)量均比對照組多。其中，處理T1的根際土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量分別為處理T4 (CK)的175.59 %、208.70 %和258.06 %；處理T2的根際土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量分別為處理T4 (CK)的178.19 %、213.04 %和322.58 %；處理T3的根際土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量分別為處理T4 (CK)的144.02 %、228.26 %和256.45 %，不同菌劑之間各類群微生物數(shù)量差異不明顯。

2.3 根際土壤微生物數(shù)量與酚酸類物質(zhì)含量的相關(guān)性

根際土壤微生物數(shù)量與酚酸類物質(zhì)含量顯示不同程度的負相關(guān)性 (表2)，其中，細菌數(shù)量與對羥基苯甲酸、4-香豆酸和阿魏酸呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，放線菌數(shù)量與香草酸呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)。

2.4 微生物菌劑對烤煙主要農(nóng)藝性狀和生物量的影響

由表3可見，微生物菌劑處理下煙株的株高、有效葉片數(shù)、葉長、葉寬、莖粗及生物量等均高于對照組，其中以生物量的影響最為顯著，處理T1、處理T2和處理T3單株干重分別為處理T4 (CK)的124.15 %、111.62 %和126.99 %，說明微生物菌劑對烤煙的生長有一定的促進作用。

3 討 論

酚酸類物質(zhì)可通過植物自身根系分秘、微生物腐解、淋溶等多種途徑進入土壤，并影響土壤微生物結(jié)構(gòu)與活性。研究表明，土壤中的酚酸物質(zhì)既能抑制有益微生物的生長，也能為病原菌生長提供營養(yǎng)，從而改變土壤微生態(tài)平衡，這是連作作物土傳病害逐年嚴重的原因之一[16-17]。微生物菌劑是利用有益微生物菌群經(jīng)特殊工藝制成的活菌制劑，施用微生物菌劑能調(diào)節(jié)土壤酚酸含量，促進作物生長[18-20]。研究結(jié)果表明，施用微生物菌劑能顯著降低對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸和阿魏酸等5種酚酸類物質(zhì)在土壤中的積累，并可促進煙株生長，施用雙藻菌露200微生物菌劑6 kg/hm2(處理T1)、施用農(nóng)用微生物菌劑75 L/hm2(處理T2)、施用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌復合粉劑300 kg/hm2(處理T3)的煙株干物質(zhì)積累量分別為清水對照的124.15 %、111.62 %和126.99 %，前人的研究也有類似結(jié)果。

表1 不同處理根際土壤微生物數(shù)量

表2 根際土壤微生物數(shù)量和酚酸含量的相關(guān)性分析

表3 不同處理對烤煙農(nóng)藝性狀和生物量

土壤中細菌、真菌和放線菌的結(jié)構(gòu)和數(shù)量影響土壤的微生態(tài)平衡。施用微生物菌劑能夠加快有益微生物在土壤中的繁殖，改善土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)[21-22]。土壤微生物數(shù)量測定結(jié)果表明，微生物菌劑處理后，煙株根際土壤中三類微生物的數(shù)量均顯著高于對照組，與高峰等[23]的研究有類似結(jié)果。

土壤中的酚酸類物質(zhì)與土壤微生物關(guān)系密切，酚酸類物質(zhì)能夠影響土壤微生物數(shù)量和多樣性，微生物群落和數(shù)量的改變也會影響土壤理化特征的變化[6]，白羽祥、張玥琦等報道酚酸類物質(zhì)含量與細菌豐度顯著相關(guān)[17, 24]，呈現(xiàn)出根系分泌的化感物質(zhì)能夠抑制某些病原微生物的生長[9]，土壤微生物能夠促進酚酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與分解[25-26]，根系微生物數(shù)量與種群的增加能加快這一進程，降低酚酸物質(zhì)的化感活性。通過對土壤根際微生物數(shù)量與酚酸物質(zhì)含量的相關(guān)性的研究，結(jié)果表明細菌數(shù)量與對羥基苯甲酸、4-香豆酸和阿魏酸呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，放線菌數(shù)量與香草酸呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，微生物菌劑的施用有效增加了土壤微生物的數(shù)量，從而降低土壤酚酸物質(zhì)含量，白羽祥[17]等的研究也有類似結(jié)果。

4 結(jié) 論

土壤微生物數(shù)量與酚酸物質(zhì)含量存在密切的相互影響關(guān)系，施用微生物菌劑能夠有效提高土壤微生物豐度，降低根際土壤酚酸類物質(zhì)含量，對根系土壤微生態(tài)環(huán)境起到了較好的調(diào)節(jié)作用，有效促進煙葉生長。