施竹鳳，裴衛(wèi)華，王 會，張 慶，楊佩文，吳貴宏，李向東，彭榮珍，畢云青，楊明英*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.丘北縣溫瀏鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 丘北 663208；3.瑞麗海關(guān)綜合技術(shù)中心，云南 瑞麗 678600)

【研究意義】十字花科蔬菜根腫病是由根腫菌屬(Plasmodiophora)蕓薹根腫菌(P.brassicaeWoron)侵染引起的土傳病害[1]，俗稱“根癌”。該病寄主范圍很廣，可危害大白菜、小白菜、甘藍(lán)、蘿卜等100多種栽培的和野生的十字花科植物[2]。該病在國內(nèi)外各蔬菜產(chǎn)區(qū)均有分布[3-4]，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，十字花科蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大，根腫病的發(fā)生危害也有加重趨勢。根腫病菌為專性寄生菌，作物的苗期與成株期均可感病。根腫病菌通過侵染植物根系，使根部膨大，形成大小不一、形態(tài)各異的根瘤[5]，影響植株正常的生理生化功能，影響植株對水分及養(yǎng)分的吸收，從而引起植株地上部分發(fā)育不良，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整個(gè)植株枯萎死亡[6]，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。根腫病菌是一種低等微生物，在土壤中以休眠孢子的形式長期存活[7]，因此植株一旦被該菌侵染，會增加土壤中新的菌含量，且由于農(nóng)事操作不當(dāng)，會導(dǎo)致感病田塊中根腫病菌在全田擴(kuò)散，從而該病發(fā)生不斷加重。感染了根腫病菌后，一般用土壤塘施進(jìn)行常規(guī)處理，但該方法無法徹底消滅根腫病菌，只能減少菌量，且根腫病菌一旦發(fā)生，土壤就難以清除干凈，除非與其它科作物多年輪作，或者采用土壤消毒劑全田消毒處理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】藥劑防控是根腫病持續(xù)防控中的關(guān)鍵控病技術(shù)之一[8]，但大多數(shù)殺菌劑對根腫病的防控效果如何，必須進(jìn)行田間試驗(yàn)。由于田間病田土壤中根腫病菌含量不均勻，病害發(fā)生受多種因素影響，試驗(yàn)結(jié)果往往不穩(wěn)定；加之田間試驗(yàn)需投入較大人力物力財(cái)力，試驗(yàn)成本較高。加上根腫病菌尚未獲得離體培養(yǎng)，病原菌以休眠孢子存活于土壤或植物組織，且病原菌體積小、難分離檢測，從而給該病害的早期診斷帶來很大挑戰(zhàn)[9]。MacFarlane最早進(jìn)行了根腫病菌休眠孢子的分離[10]，其它人采用的分離方法都是在此基礎(chǔ)上優(yōu)化改進(jìn)的。Kenji Takahashi利用螢光染色技術(shù)對土壤中的休眠孢子進(jìn)行檢測與定量分析[11]；Arie則用螢光抗體技術(shù)對分離自土壤或植物根腫組織的休眠孢子進(jìn)行檢測[12]；Lange，Wakeham和White成功地對分離自土壤及根腫組織中的根腫病菌進(jìn)行了血清學(xué)及掃描電鏡檢測[13-14]。以上這幾種方法比較費(fèi)時(shí)，且需要一定的實(shí)驗(yàn)技能和專用設(shè)備，因而應(yīng)用上受到一定限制。作者團(tuán)隊(duì)通過多年試驗(yàn)研究及應(yīng)用，針對十字花科蔬菜根腫病的防控，堅(jiān)持在選用抗病品種條件下，以農(nóng)業(yè)措施、生物調(diào)控為主，化學(xué)防控為輔的綜合防控技術(shù)。以減少田間土壤菌源，改變根腫病菌適生環(huán)境，保護(hù)蔬菜生長前期的根系不受根腫病菌侵染等相應(yīng)措施，即輪作、無菌土育苗移栽、土壤酸堿度或微生態(tài)調(diào)控、關(guān)鍵化學(xué)防控為主線的模式，減輕病害發(fā)生危害，達(dá)到控病增產(chǎn)目的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究擬對采集的十字花科蔬菜根腫病菌，通過孢子懸浮液進(jìn)行藥劑抑制效果測定，可快速及低成本大量篩選不同藥劑致死效果。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過孢子染色比較試驗(yàn)，篩選出檢測孢子活性的染色劑及染色方法，測定不同殺菌劑控制根腫病菌的效果，為大田試驗(yàn)或示范提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

十字花科蔬菜根腫病菌來自嵩明縣蔬菜基地的白菜根腫病病根。實(shí)驗(yàn)所用主要試劑：4 %臺盼藍(lán)母液、碘化丙啶(PI)、Hoechest33342 染液。供試藥劑：搜集市場上殺菌劑19種，進(jìn)行室內(nèi)抑制效果試驗(yàn)，藥劑種類及廠家詳見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根腫病菌孢子懸浮液的制備 將病樣組織洗凈，取10 g切碎，加入到50 mL滅菌水中，進(jìn)行研磨；研磨后用4層紗布過濾，濾液移至50 mL離心管3100 r/min離心15 min，然后棄上清液；沉淀重溶于50 mL滅菌水3100 r/min離心10 min，此步驟重復(fù)2～3次，然后棄上清液；沉淀中加入50 %蔗糖溶液5 mL，混勻后3100 r/min離心10 min；取上清液到干凈離心管內(nèi)，加入30 mL滅菌水，3100 r/min離心10 min后棄上清液；沉淀重溶于30 mL滅菌水，3100 r/min離心10 min，此步驟重復(fù)2次；沉淀重溶于5 mL滅菌水[2]，最后將其濃度調(diào)節(jié)到1.0×108個(gè)孢子/mL，放置陰暗處備用。

1.2.2 試驗(yàn)處理 將19種不同種類藥劑，采用說明書用量的最低劑量，計(jì)算出10 mL用藥量，然后分別加入上述備好的孢子懸浮液中，搖勻，放置室溫(13～24 ℃)條件下，每個(gè)藥劑處理3次重復(fù)。設(shè)置2組對照：加無菌水的孢子懸浮液、在90 ℃水浴煮沸5 h的孢子懸浮液。定期震蕩混勻。

1.2.3 觀察時(shí)間及方法 將1.2.2的孢子懸浮液，在分別處理7、10、14 d后取10 μl溶液，加入500 μl無菌水，采用3000 r/min離心10 min，再加100 μl無菌水或100 μl(0.05 %硫代硫酸鈉+10 %吐溫80)進(jìn)行重懸，鏡檢鑒定根腫病菌孢子活力，并統(tǒng)計(jì)死孢子與活孢子數(shù)。

1.3 根腫病菌孢子染色

1.3.1 染色液的配制 碘化丙啶(PI)：用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)將碘化丙啶配制成終濃度為100 μg/mL的PI儲存液，4 ℃避光保存。Hoechest33342 染液：用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)將Hochest33342配制成終濃度為100 μg/mL的Hoechest33342儲存液，4 ℃避光保存[1]。4 %臺盼藍(lán)母液：稱取4 g臺盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100 mL，用濾紙過濾，4 ℃保存。使用時(shí)，用PBS稀釋至0.4 %。

表1 不同藥劑種類及用量

1.3.2 不同染色方法 PI單染：取新鮮的根腫病菌孢子懸浮液和水浴處理致死的孢子沉淀，用 PI 溶液重懸，4 ℃避光處理15 min，后用移液槍取10 μl反應(yīng)液滴在載玻片上，制片，在顯微鏡下觀察死、活孢子特征[1]。Hoechest33342單染：分別取新鮮的根腫病菌孢子懸浮液和水浴處理致死的孢子懸浮液、Hochest33342染液950、50 μl，37 ℃處理10 min，置于冷凍離心機(jī)1000 g/min 離心，去上清，用滅菌水1 mL洗滌，離心，去上清，在沉淀中加入950 μl 的滅菌水重懸，取10 μl制片，在顯微鏡下觀察死、活孢子特征[1]。臺盼藍(lán)染色：孢子懸液與0.4 %臺盼藍(lán)溶液以9∶1體積比混合均勻，處理15 min，后取 10 μl制片，在熒光顯微鏡下觀察死、活孢子特征[1]。

1.3.3 染色測定方法 將藥劑處理過的根腫病菌孢子懸浮液稀釋重懸后，采用臺盼藍(lán)染色測定根腫病菌休眠孢子活力，統(tǒng)計(jì)死孢子與活孢子數(shù)。所有孢子懸浮液染色處理前先檢查新鮮休眠孢子自然死亡率。再用臺盼藍(lán)染料進(jìn)行不同處理孢子懸浮液染色，著色后為藍(lán)色即死亡，無色即存活，計(jì)算孢子死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)樣本均用血球計(jì)數(shù)板(25×16)觀察，然后采用下面公式計(jì)算死亡率。

孢子死亡率(%)=[視野中著深藍(lán)色的孢子數(shù)目/(視野中著深藍(lán)色的孢子數(shù)目+視野中呈透亮狀的孢子數(shù)目)]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同染色劑染色效果篩選

2.1.1 根腫病菌孢子的分離富集及水浴處理 分離富集：利用50 %蔗糖溶液制備得高純度的根腫病孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察，可見孢子大部分是單個(gè)存在的，且相互沒有富集或堆積現(xiàn)象(圖1-A)，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。孢子懸浮液熱處理：將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)為1.0×108個(gè)孢子/mL，90 ℃下水浴加熱5 h，保證孢子全部死亡。在顯微鏡下觀察，可見孢子呈團(tuán)狀集聚、重疊嚴(yán)重，且孢子顏色變深(圖1-B)。

A：新鮮根腫病菌休眠孢子；B：90 ℃水浴處死根腫病菌孢子A: Dormant spores of Plasmodiophora brassicae; B: Execution of Plasmodiophora brassicae spores by water bath at 90 ℃圖1 根腫病菌孢子Fig.1 Spores of Plasmodiophora brassicae

2.1.2 根腫病菌孢子自發(fā)熒光觀察 通過鏡檢觀察，新鮮孢子與90 ℃水浴處死孢子在不加任何熒光染料的情況下，有明顯自發(fā)熒光現(xiàn)象。新鮮孢子自發(fā)熒光為藍(lán)色(圖2-A)，而90 ℃水浴處死孢子自發(fā)熒光除了藍(lán)色，還有綠色和紅色(圖2-B～D)。

A：新鮮休眠孢子自發(fā)熒光；B～D：90 ℃水浴處死孢子自發(fā)熒光A: Spontaneous fluorescence of fresh dormant spores of Plasmodiophora brassicae; B-D: Spontaneous fluorescence of spores killed by water bath at 90 ℃.圖2 根腫病菌孢子自發(fā)熒光Fig.2 Spores spontaneous fluorescence of Plasmodiophora brassicae

2.1.3 根腫病菌孢PI染色效果 新鮮休眠孢子懸浮液經(jīng) PI 染色后，在熒光顯微鏡下觀察，視野中孢子僅有藍(lán)色熒光(圖3-A)；通過90 ℃水浴處理致死的孢子，可觀察到既有藍(lán)色也有紅色熒光，且孢子堆積成團(tuán)，無法統(tǒng)計(jì)視野中孢子數(shù)目(圖3-B～C)。

A：新鮮休眠孢子染色后為藍(lán)光；B～C：90 ℃水浴處理孢子染色后為藍(lán)光、紅光A: Blue light after staining of fresh dormant spores ; B-C: After dyeing in water bath at 90 ℃, it is blue and red圖3 根腫病菌孢子PI染色效果Fig.3 Effect of PI staining on spores of Plasmodiophora brassicae

2.1.4 根腫病菌孢子Hoechest33342染色效果 新鮮孢子懸浮液經(jīng)Hoechest33342染色后，在熒光顯微鏡下絕大多數(shù)的孢子有藍(lán)色熒光(圖4-A)，而少數(shù)孢子有紅色熒光(圖4-B)；經(jīng) 90 ℃水浴處理致死的孢子，有藍(lán)色和紅色熒光，且聚集成團(tuán)，細(xì)胞界限不清晰，無法進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖4-C～D)。

A～B：新鮮孢子染色后多數(shù)藍(lán)光(A)和少數(shù)紅光(B)；C～D：90 ℃水浴處理孢子染色后孢子有藍(lán)光(C)和紅光(D)A-B: Most blue light (A) and a few red light (B) were stained with fresh spores; C-D: The dyed spores treated by water bath at 90 ℃ have blue and red light圖4 根腫病菌孢子Hoechest33342染色效果Fig.4 Spore dyeing effect by Hoechest33342 of Plasmodiophora brassicae

2.1.5 根腫病菌孢子臺盼藍(lán)染色效果 在0.4 %臺盼藍(lán)染色后，新鮮孢子懸浮液中死、活孢子呈現(xiàn)不同著色效果。活的孢子圓潤透亮、不著色或著色極淺，細(xì)胞界限清晰可見(圖5-A)；90 ℃水浴處死的孢子全部著深藍(lán)色，染料呈點(diǎn)狀或塊狀沉積在孢子上，且細(xì)胞界限清晰可辨(圖5-B)；新鮮休眠孢子與90 ℃水浴處死孢子混合后臺盼藍(lán)染色，能在同一視野中同時(shí)觀察到死、活孢子的不同著色效果(圖5-C)。

A：新鮮休眠孢子臺盼藍(lán)染色呈透亮圓潤；B：90 ℃水浴處理染色后深藍(lán)色；C：新鮮休眠孢子和90°水浴處理孢子混合后染色呈現(xiàn)無色+藍(lán)色A: Fresh dormant spores stained with trypan blue were bright and round; B: Dark blue after dyeing in water bath at 90 ℃;C: Fresh dormant spores and spores treated with 90 ℃ water bath were dyed colorless and blue圖5 根腫病菌孢子臺盼藍(lán)染色效果Fig.5 Effect of trypan blue staining on spores of Plasmodiophora brassicae

2.2 不同藥劑對根腫病菌休眠孢子的致死效果

2.2.1 藥劑不同處理時(shí)間對根腫病菌孢子致死效果 利用臺盼藍(lán)對藥劑處理后的孢子進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，不同藥劑對根腫病菌孢子處理時(shí)間長短其致死率有一定差異。藥劑處理7、10、14 d后，隨著處理時(shí)間延長，孢子死亡率會逐漸增加，致死率高低順序14 d>10 d>7 d。其中明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈處理7～10 d，致死率增加幅度比10～14 d大，其它藥劑處理7、10、14 d后，致死率差異不大。

藥劑處理7 d后，19種藥劑對根腫病菌孢子致死率在12.46～31.18 %，不同藥劑間差異不大；處理10 d后，明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈致死率明顯上升，致死率為41.69 %～56.37 %，其它藥劑致死率為13.07 %～33.21 %，與處理7 d的效果比較差異不明顯；處理14 d后，19種藥劑致死效果與處理10 d的致死率差異不大。通過藥劑對根腫病菌孢子不同處理時(shí)間效果比較，表明處理時(shí)間需在10 d以上才能檢測和體現(xiàn)藥劑對根腫病菌休眠孢子的致死效果(圖6)。

圖6 不同處理時(shí)間對根腫病菌孢子的致死效果差異Fig.6 The difference of lethal effect of different treatment time on spores of Plasmodiophora brassicae

2.2.2 不同藥劑處理根腫病菌致死效果 不同藥劑處理后，采用臺盼藍(lán)染色法染色，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)藥劑對病菌孢子的致死率。藥劑處理14 d測定結(jié)果顯示，不同藥劑種類之間對根腫病菌孢子致死效果有明顯差異，明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈的致死率為55.99 %～62.49 %，致死效果較好；咪鮮胺、明安、烯酰嗎啉、甲霜靈錳鋅的致死率為31.66 %～33.89 %，有一定抑制效果；多抗霉素、克菌康、明彩、明登、代森錳鋅、甲基硫菌靈、腐霉利的致死率為20.79 %～25.49 %；而春雷霉素、明潤豐和明農(nóng)心致死率較低，為17.89 %～19.49 %(圖7)。

圖7 不同藥劑處理對根腫病菌的致死效果Fig.7 Lethal effect of different agents on Plasmodiophora brassicae

3 討 論

3.1 根腫病菌孢子染色效果比較

采用熒光顯微鏡觀察根腫病菌孢子，由于孢子在熒光顯微鏡下自帶熒光，給實(shí)驗(yàn)帶來一定困難。通過根腫病菌孢子不同染色方法比較實(shí)驗(yàn)，顯示臺盼藍(lán)染色后可以在同一視野中，明顯區(qū)分根腫病菌休眠孢子是死的還是活的：有活力的休眠孢子透亮、不著色，死的休眠孢子著深藍(lán)色，二者顏色反差強(qiáng)烈，且死的休眠孢子無聚集現(xiàn)象。與其他染色方法相比，臺盼藍(lán)染色為根腫病菌休眠孢子活力檢測的最佳方法。因此該實(shí)驗(yàn)以下染色測定均用臺盼藍(lán)染色。臺盼藍(lán)染液染色為根腫病菌休眠孢子活力檢測的最佳方法。根據(jù)多次的實(shí)驗(yàn)確定染色的最佳比例為處理液∶臺盼藍(lán)(9∶1)，最佳染色時(shí)間為3～5 min。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對根腫病菌孢子的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

3.2 不同藥劑及處理時(shí)間對根腫病菌孢子致死效果

19種藥劑及不同處理時(shí)間對根腫菌孢子的抑制率測定，結(jié)果顯示，隨處理時(shí)間延長，致死效果逐漸增高，部分藥劑致死率在處理第7 ～10天，變化幅度較大，所有藥劑在處理10～14 d時(shí)，致死效果變化不大。其中明迪、福帥得、科佳、百菌清和多菌靈等對孢子致死效果較好，均高于55 %。多抗霉素、克菌康、春雷霉素、明潤豐、明登、明農(nóng)心、代森錳鋅和甲基硫菌靈等致死效果較差，藥劑致死效果與大田藥劑防控效果基本相吻合。

4 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)表明殺菌劑在防治根腫病菌時(shí)具有一定的時(shí)間性和滯后性，所以生產(chǎn)實(shí)際中防治十字花科根腫病要提前施藥或采取預(yù)防措施，才能達(dá)到最佳防控效果。在田間根腫病的藥效試驗(yàn)比室內(nèi)復(fù)雜，影響因素較多，在不同地理?xiàng)l件下，同樣的防控方法、防控藥劑產(chǎn)生的效果會差異。同時(shí)對根腫病的防控僅用單一藥劑防控措施遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到持續(xù)控制目標(biāo)，長期單一使用核心藥劑會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此必須采用綜合的防控措施，以利用抗病品種為基礎(chǔ)，加強(qiáng)栽培管理，清理病根降低菌源量，健康種苗及土壤處理、關(guān)鍵藥劑防治等持續(xù)控制，才能逐漸減輕根腫病的發(fā)生危害。