基于基因編碼的高時(shí)空分辨率檢測(cè)去甲腎上腺素?zé)晒馓结?/h1>
2020-12-10 13:53:49FengJS,王佳昕
中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志 2020年9期
去甲腎上腺素 (norepinephrine, NE) 是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種生理過程。NE 的釋放或信號(hào)傳遞過程受損與多種精神疾病和神經(jīng)退行性病變相關(guān)。因此，以高時(shí)空分辨率的方式檢測(cè)神經(jīng)環(huán)路中內(nèi)源NE 的動(dòng)態(tài)分布，對(duì)解析NE 在生理及病理?xiàng)l件下的功能尤為重要。然而現(xiàn)有的技術(shù)無法精確檢測(cè)去甲腎上腺素的在體分布。北京大學(xué)李毓龍研究組開發(fā)并優(yōu)化了一類基于G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 激活的NE 熒光探針 (GRABNE)，通過在人源NE 受體特定位置嵌入對(duì)結(jié)構(gòu)變化敏感的熒光蛋白 (cpEGFP)，使化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，結(jié)合現(xiàn)有的成像技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NE 的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：①探針優(yōu)化：將膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)α2-腎上腺素能受體 (α2AR) 作為cpEGFP 支架，將cpEGFP 插入到α2AR 第三胞內(nèi)環(huán)域(ICL3)中，通過突變靠近c(diǎn)pEGFP 的C1 位置氨基酸設(shè)計(jì)出熒光性能較好的探針GRABNE1m（低親和力）；通過點(diǎn)突變?chǔ)?AR 中T6.34K 設(shè)計(jì)出對(duì)NE 靈敏度更高的探針GRABNE1h（高親和力）。②細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在HEK293T 細(xì)胞和神經(jīng)元中表達(dá)GRABNE1h，GRABNE 能夠在離體細(xì)胞中特異性地反應(yīng)NE 的動(dòng)態(tài)變化且不會(huì)誘導(dǎo)GPCR 下游信號(hào)的改變。③腦片電生理實(shí)驗(yàn)表明，通過在培養(yǎng)的海馬腦片中表達(dá)GRABNE1m和GRABNE1h探針，能夠監(jiān)測(cè)NE的動(dòng)態(tài)變化且對(duì)內(nèi)源性NE 受體功能無影響。電刺激海馬腦片可引起GRABNE1h熒光增強(qiáng)，且對(duì)神經(jīng)元的興奮性沒有明顯干擾。在藍(lán)斑 (LC) 中表達(dá)GRABNE1m后，電刺激引起NE 的釋放能夠快速誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度增加，表明GRABNE1m能夠敏感且特異性地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)內(nèi)源性NE 的釋放。④斑馬魚動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：在轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg (HuC:GRABNE1m) 全腦神經(jīng)元上廣泛表達(dá)GRABNE1M探針，能夠成功檢測(cè)到清醒斑馬魚中腦由視覺刺激引發(fā)的與時(shí)間鎖定的特異性NE 釋放，通過稀疏標(biāo)記GRABNE1M探針記錄到單細(xì)胞分辨率下重復(fù)視覺刺激引發(fā)的NE釋放信號(hào)，表明探針能夠直接監(jiān)測(cè)在體NE 的動(dòng)態(tài)變化。⑤Th-Cre 小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：在Th-Cre 小鼠的LC 中病毒表達(dá)GRABNE1m（非Cre 依賴）和光遺傳致動(dòng)器C1V1（Cre 依賴），通過光遺傳給予刺激，光纖光度記錄發(fā)現(xiàn)自由活動(dòng)小鼠中GRABNE1m熒光強(qiáng)度增加且能夠特異性反映NE 水平，表明GRABNE 探針能夠用于監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物大腦中的NE 動(dòng)態(tài)變化。⑥C57BL/6 小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：在小鼠外側(cè)下丘腦中表達(dá)hSyn-GRABNE1m。在強(qiáng)迫游泳和懸尾應(yīng)激性實(shí)驗(yàn)中，GRABNE1m熒光強(qiáng)度顯著增加。而在社交或飲食行為中，并未發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)的改變，表明外側(cè)下丘腦的NE 活動(dòng)主要發(fā)生在應(yīng)激條件下，表明該探針能夠檢測(cè)到應(yīng)激狀態(tài)下NE 的動(dòng)態(tài)變化。因此，李毓龍研究組開發(fā)的遺傳編碼的NE 探針(GRABNE1m和GRABNE1h)，可用來監(jiān)測(cè)體外和體內(nèi)NE 動(dòng)態(tài)變化，具有高時(shí)空分辨率，高配體特異性和細(xì)胞類型特異性，有助于理解NE 在復(fù)雜行為過程中的調(diào)節(jié)作用。
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