于少帥 趙文霞 姚艷霞 張學(xué)超 淮穩(wěn)霞

摘要：利用15對(duì)特異性SSR引物對(duì)290份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品進(jìn)行擴(kuò)增，并通過分子生物學(xué)方法分析其遺傳變異特征與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。15對(duì)SSR引物在290份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品中共獲得69個(gè)等位基因，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)獲得4.6個(gè)等位基因。新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關(guān)系較近，新疆野蘋果種群遺傳多樣性豐富，遺傳分化系數(shù)為0.25，基因流為0.76。新疆新源和鞏留2個(gè)地區(qū)的新疆野蘋果聚于一個(gè)進(jìn)化分枝，栽培蘋果與采自新疆的紅肉蘋果聚于一個(gè)進(jìn)化分枝。編碼轉(zhuǎn)錄因子RAX3的SSR位點(diǎn)在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端的SSR位點(diǎn)在新疆野蘋果中有特異性條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端、轉(zhuǎn)錄因子bHLH74的SSR位點(diǎn)在栽培蘋果中有特異性條帶。

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果;微衛(wèi)星標(biāo)記;遺傳多樣性;系統(tǒng)發(fā)育;抗逆性

中圖分類號(hào)：S661.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）05-1274-08

Abstract： 15 pairs of specific simple sequence repeats（SSR） primers were used to amplify 290 samples of Malus sieversii and cultivated apples， and their genetic variation and phylogenetic relationships were analyzed by molecular biology method. 69 alleles were obtained in 290 samples of M. sieversii and cultivated apples based on 15 pairs of SSR primers， with an average of 4.6 alleles per SSR locus. There was a close genetic relationship between M. sieversii and cultivated apples. The genetic diversity of M. sieversii groups was rich， with a genetic differentiation coefficient of 0.25 and a gene flow of 0.76. M. sieversii from Xinyuan and Gongliu of Xinjiang clustered in an evolutionary branch， cultivated apples and the red-flesh apple collected from Xinjiang clustered in an evolutionary branch. The SSR locus that coding transcription factor RAX3 showed a specific band in M. sieversii samples whose deadwood rate was above 90%. The SSR locus that coding the N end of the TMV-like resistant protein showed a specific band in M. sieversii samples. The SSR loci that coding the N end of the TMV-like resistant protein and the transcription factor bHLH74 showed specific bands in cultivated apples.

Key words：Malus sieversii;microsatellite marker;genetic diversity;phylogeny;stress resistance

新疆野蘋果（Malus sieversii）是薔薇科蘋果屬的瀕危二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，是研究世界蘋果遺傳多樣性和基因進(jìn)化的重要天然基因庫，主要分布于中國(guó)新疆西部、中亞的哈薩克斯坦和吉爾吉斯斯坦[1]。新疆野蘋果由于受自然選擇的長(zhǎng)期作用，形成了豐富的遺傳特征和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，具有抗病、抗蟲等優(yōu)良性狀[2]。近年來，分布于中國(guó)的新疆野蘋果枯死嚴(yán)重。影響新疆野蘋果生存狀態(tài)的原因較多，比如人類活動(dòng)、蘋小吉丁蟲害和蘋果樹腐爛病等因素[3-5]。但關(guān)于引起新疆野蘋果枯死的具體原因及枯死機(jī)制尚不清楚。因新疆野蘋果脅迫因子的多樣性和復(fù)雜性，在新疆野蘋果保育過程中采取單一的防治手段較難起到理想的保護(hù)效果。在尋找引起新疆野蘋果種群退化的關(guān)鍵因子和保護(hù)新疆野蘋果的同時(shí)，保護(hù)、選育和栽培具有抗性特征的遺傳資源應(yīng)該是控制其種群衰退最為經(jīng)濟(jì)有效和根本的措施。

關(guān)于新疆野蘋果種質(zhì)遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果表明，新疆鞏留縣、新源縣等地的新疆野蘋果種群存在豐富的遺傳多樣性[6-7]，種群內(nèi)部遺傳分化程度較高[8]。在新疆野蘋果遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中常用的分子標(biāo)記有SSR[9]、SRAP[7]、RAPD[10]、ITS[11]，其中應(yīng)用較多的分子標(biāo)記為SSR標(biāo)記[2]。作為一種分辨率高、遺傳信息量大、操作相對(duì)簡(jiǎn)單的標(biāo)記方法，SSR被廣泛應(yīng)用于瀕危植物遺傳變異研究中[12-14]。SSR標(biāo)記可以與植物的一些表型、抗性等性狀關(guān)聯(lián)在一起。Klabunde等[15]用11對(duì)SSR引物對(duì)152份具有不同蘋果葉斑病抗性的巴西栽培蘋果的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)：不同抗性栽培蘋果間存在豐富的遺傳多樣性，蘋果抗葉斑病品種與感葉斑病品種間遺傳結(jié)構(gòu)差異顯著，有120個(gè)等位位點(diǎn)是抗病品種獨(dú)有的。新疆野蘋果研究結(jié)果顯示，SSR標(biāo)記可以很好地揭示新疆野蘋果種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[6]，新疆野蘋果種內(nèi)不同個(gè)體的葉形等表型性狀的變異與SSR標(biāo)記的位點(diǎn)有一定的相關(guān)性[2，16]。目前關(guān)于新疆野蘋果抗病蟲等抗性差異在新疆野蘋果個(gè)體、種群間的遺傳變異尚未見報(bào)道。

新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關(guān)系較近，可能是現(xiàn)代栽培蘋果的祖先[1]。目前關(guān)于新疆野蘋果種質(zhì)遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育研究應(yīng)用較多的分子標(biāo)記是SSR標(biāo)記[6，9，16]，但現(xiàn)在大部分標(biāo)記均為非編碼區(qū)分子標(biāo)記，擴(kuò)增片段的功能未知，在NCBI上無明確比對(duì)結(jié)果?；谠耘嗵O果基因組，篩選了15對(duì)可以在栽培蘋果、新疆野蘋果中擴(kuò)增出目的條帶的的特異性SSR引物，通過這些特異性引物對(duì)不同種群新疆野蘋果和栽培蘋果進(jìn)行遺傳變異分析，旨在揭示新疆野蘋果的遺傳信息及變異規(guī)律。本研究用新開發(fā)的15對(duì)特異性SSR引物，對(duì)新疆野蘋果和栽培蘋果290份樣品進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示其遺傳變異規(guī)律和親緣關(guān)系，為新疆野蘋果的生態(tài)保育，蘋果優(yōu)質(zhì)新品種培育和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展等提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)樣品

2016年至2017年對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州鞏留縣和新源縣的新疆野蘋果健康狀況進(jìn)行調(diào)查并采樣。根據(jù)新疆野蘋果樹上的枯枝率將新疆野蘋果按級(jí)別進(jìn)行劃分[17]，共分6個(gè)級(jí)別，0級(jí)：?jiǎn)沃昕葜β蕿?;Ⅰ級(jí)：?jiǎn)沃昕葜β蕿?～10%;Ⅱ級(jí)：?jiǎn)沃昕葜β蕿?1%～40%;Ⅲ級(jí)：：?jiǎn)沃昕葜β蕿?1%～60%;Ⅳ級(jí)：?jiǎn)沃甑目葜β蕿?1%～90%;Ⅴ級(jí)：?jiǎn)沃昕葜β蕿?1%～100%。新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所基于前期調(diào)查研究篩選了一些疑似抗逆資源，本研究樣品于2017年9月采自新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所資源圃。栽培蘋果樣品于2017年7月至8月采自山東，樣品信息如表1所示。

1.2儀器和試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green I染料購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司，2×Taq Mix購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，Hi-Di去離子甲酰胺、POP-7 Polymer、GS-500LIZ相對(duì)分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，A200型基因擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司， DYY-6C型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠，超純水由 MILLI-Q 超純水純化系統(tǒng)制得，乙醇等其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3DNA提取

取樣品葉片0.1 g，采用CTAB法提取新疆野蘋果和栽培蘋果的基因組總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴(kuò)增

根據(jù)已報(bào)道的栽培蘋果品種金冠蘋果基因組[18]，獲得15對(duì)新疆野蘋果特異性SSR引物，如表2所示。DNA測(cè)序PCR反應(yīng)體系25.0 μl：1.0 μl DNA模板，0.5 μl 上游/下游引物 （10 μmol/L）， 12.5 μl 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μl Taq DNA polymerase， 4.0 mmol/L MgCl2， 0.4 mmol/L dNTPs），最后用ddH2O補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增條件是95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s， 52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用SYBR Green I熒光染料染色在1% （質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)。毛細(xì)管電泳PCR反應(yīng)體系是30 μl，包括1 μl DNA模板、1 μl上游/下游引物（10 μmol/L，加熒光），15 μl 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μl Taq DNA polymerase、4.0 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs），用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取0.3 μl PCR產(chǎn)物用ABI 3730×l DNA analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。

1.5數(shù)據(jù)處理

將上機(jī)結(jié)果原始文件導(dǎo)入Genemarker 2.2.0，按位點(diǎn)導(dǎo)出峰圖、Excel位點(diǎn)信息表。利用GeneMarker V2.2.0和POPGENE V1.32計(jì)算引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)性信息量;使用GenAlEx V6.501軟件計(jì)算各引物擴(kuò)增的等位基因的PIC值;利用NTSYSpc V2.10e和MEGA V7.0軟件計(jì)算品種間的遺傳距離，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀圖;根據(jù)遺傳多樣性系數(shù)（Na）、Neis基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（I）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2結(jié)果與分析

2.1遺傳多樣性參數(shù)和遺傳分化

用15對(duì)特異性SSR引物擴(kuò)增290份不同地區(qū)、不同枯枝癥狀級(jí)別的新疆野蘋果和栽培蘋果樣品，對(duì)其遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出69個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出4.6個(gè)等位基因，如表3所示。本研究結(jié)果表明，不同類群的等位基因數(shù)為1.40～3.67，有效等位基因數(shù)為0.98～2.28，Neis基因多樣性指數(shù)為0.20～0.46，香農(nóng)指數(shù)為0.28～0.83，觀察雜合度為0.33～0.73，期望雜合度為0.25～0.76。根據(jù)這些遺傳多樣性參數(shù)評(píng)估可知，檢測(cè)的新疆野蘋果和栽培蘋果樣品遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數(shù)（Fst）為0～0.05時(shí)，一般認(rèn)為遺傳分化低;Fst值為0.05～0.25時(shí)，一般認(rèn)為中等程度遺傳分化;Fst值>0.25時(shí)，一般認(rèn)為顯著遺傳分化[19]。新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群290份樣品的Fst為0.25，基因流（Nm）為0.76，由遺傳分化系數(shù)和基因流可知，不同類群間具有一定程度的分化，在總的遺傳變異中，種群間變異為24.86%。

2.2新疆野蘋果和栽培蘋果SSR位點(diǎn)特異性分析

15對(duì)特異性SSR引物在290份樣品中共擴(kuò)出69個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出4.6個(gè)等位基因。每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度及等位基因數(shù)如表4所示。SSR引物XS71-1-4和XS72-1-1在290份樣品中擴(kuò)增的等位基因數(shù)最多，為10個(gè);引物XS62-1-4擴(kuò)增的等位基因數(shù)最少，為2個(gè)。特異性SSR位點(diǎn)分析結(jié)果表明，XS24-1-5-2（轉(zhuǎn)錄因子RAX3）位點(diǎn)獲得的等位基因是GL（V）、GL1、XY（V）特有的，由此可知編碼轉(zhuǎn)錄因子RAX3的SSR位點(diǎn)在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶。XS2-1-2（組氨酸激酶5）位點(diǎn)246等位基因是YN-red特有的。XS71-1-4（類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）位點(diǎn)440等位基因是GL（0）、GL1、GL2、XY-84特有的。XS71-1-5（類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）位點(diǎn)367等位基因是YN-red特有的。XS71-1-5（類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）位點(diǎn)422等位基因是GL1、GL2、GL3特有的，由此可知編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端的SSR位點(diǎn)在新疆野蘋果中有特異性條帶。XS63-1-10引物（擴(kuò)增的基因序列編碼的蛋白質(zhì)為類TMV抗性蛋白質(zhì)N端）獲得的等位基因是山東煙臺(tái)栽培蘋果特有的[18]，XS25-1-8引物（轉(zhuǎn)錄因子bHLH74亞型X1）獲得的等位基因是LS、LY特有的，由此可知編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端、轉(zhuǎn)錄因子bHLH74的SSR位點(diǎn)在栽培蘋果中有特異性條帶。

每個(gè)位點(diǎn)平均等位基因數(shù)，也稱為等位基因多樣性（通常用A表示）。GL（0）、GL（I）、GL（II）、GL（III）、GL（IV）、GL（V）、GL1、GL2、GL3、LS、LY、XY（I）、XY（II）、XY（III）、XY（IV）、XY（V）、XY-75、XY-76、XY-84、XY-89、XY-90、XY-91、YN-red見表1。

2.3新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

由Neis無偏差異遺傳特征和遺傳距離可知，新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關(guān)系較近，新疆野蘋果內(nèi)部具有較高相似性，栽培蘋果內(nèi)部也具有較高相似性。基于Neis無偏差異遺傳距離構(gòu)建的UPGMA進(jìn)化樹可以將新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群或不同個(gè)體清晰、準(zhǔn)確地分開，形成不同的進(jìn)化分枝。由新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群的UPGMA進(jìn)化樹可知，栽培蘋果LY和LS類群與采自新疆伊犁農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所資源圃的紅肉蘋果聚于一類，采自鞏留、新源不同樣點(diǎn)、不同枯枝癥狀級(jí)別的新疆野蘋果樣品聚于不同的分枝，但與采樣地點(diǎn)、癥狀級(jí)別等無明顯關(guān)系。鞏留、新源不同樣點(diǎn)、不同枯枝癥狀級(jí)別的新疆野蘋果樣品難以區(qū)分。由此可知，鞏留、新源兩地新疆野蘋果的親緣關(guān)系較近。基于新疆野蘋果和栽培蘋果不同個(gè)體的Neis無偏差異遺傳距離構(gòu)建的UPGMA進(jìn)化樹和遺傳距離結(jié)果表明，新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關(guān)系較近，但兩者可以準(zhǔn)確分開，新疆野蘋果聚于一個(gè)大的進(jìn)化分枝，栽培蘋果聚于另一個(gè)大的進(jìn)化分枝，如圖1所示。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關(guān)系較近，新疆野蘋果種群遺傳多樣性豐富，不同類群間存在較高程度的分化水平，遺傳分化系數(shù)為0.25，基因流為0.76。研究結(jié)果與已有研究結(jié)果[20-21]基本一致。而揭示種群間遺傳分化水平的遺傳分化系數(shù)與所采用的分子標(biāo)記和種群自身的遺傳變化有一定的關(guān)系[6，22]。新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群間基因流相對(duì)較低，分化水平較為顯著。新疆新源和鞏留2個(gè)地區(qū)的新疆野蘋果聚于一個(gè)進(jìn)化分枝，栽培蘋果與采自新疆的紅肉蘋果聚于一個(gè)進(jìn)化分枝。關(guān)于新疆野蘋果遺傳多樣性的研究相對(duì)較多，但SSR標(biāo)記大部分為非編碼區(qū)且功能未知，對(duì)于差異標(biāo)記的功能作用等認(rèn)知不足[6，21]。

通過特異性SSR引物，不僅可以揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，而且對(duì)變異位點(diǎn)的抗逆特性也會(huì)有一定的了解。在不同SSR位點(diǎn)擴(kuò)增的等位基因數(shù)有所不同，同一SSR位點(diǎn)不同等位基因在不同新疆野蘋果或栽培蘋果類群中出現(xiàn)的頻率也有所不同，如編碼轉(zhuǎn)錄因子RAX3的SSR位點(diǎn)在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端的SSR位點(diǎn)在新疆野蘋果中有特異性條帶;編碼類TMV抗性蛋白質(zhì)N端、轉(zhuǎn)錄因子bHLH74的SSR位點(diǎn)在栽培蘋果中有特異性條帶。SSR引物XS71-1-4和XS72-1-1在290份樣品中擴(kuò)增的等位基因數(shù)最多，為10;SSR引物XS62-1-4擴(kuò)增的等位基因數(shù)最少，為2。不同新疆野蘋果或栽培蘋果種群具有不同的特異性SSR變異位點(diǎn)。這一現(xiàn)象可能與新疆野蘋果或栽培蘋果進(jìn)化過程中對(duì)生境的適應(yīng)性有一定的關(guān)系[1]。15對(duì)SSR特異性引物可以對(duì)新疆野蘋果和栽培蘋果進(jìn)行遺傳多樣性、多態(tài)性或系統(tǒng)發(fā)育分析，揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及獲得的遺傳變異對(duì)新疆野蘋果和栽培蘋果在生物學(xué)功能等方面的影響。通過這些新開發(fā)的SSR引物，可以很好地揭示新疆野蘋果和栽培蘋果之間的遺傳變異規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這些研究結(jié)果將為新疆野蘋果生態(tài)恢復(fù)、優(yōu)質(zhì)種源選育和優(yōu)良栽培品種的創(chuàng)制提供一定的參考。新疆野蘋果在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了許多抗寒、抗病蟲害等的優(yōu)良性狀[23-24]。新疆野蘋果種內(nèi)變異類型豐富，但缺乏系統(tǒng)遺傳多樣性的系統(tǒng)調(diào)查與評(píng)估，抗逆特性突出但基因資源深入挖掘與開發(fā)利用研究環(huán)節(jié)相對(duì)較為薄弱。目前新疆野蘋果無全基因組序列，對(duì)國(guó)內(nèi)外新疆野蘋果起源、分化、擴(kuò)散情況，以及新疆野蘋果抗病蟲害、抗寒和風(fēng)味形成的遺傳構(gòu)成、基因調(diào)控機(jī)制等研究有一定的影響，從而限制新疆野蘋果抗逆相關(guān)基因克隆和新型抗逆新疆野蘋果種質(zhì)資源的創(chuàng)制[2]。全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)用于新疆野蘋果抗病蟲害基因的篩選，在全基因組范圍內(nèi)找出存在的變異序列（SNP），以差異強(qiáng)表達(dá)候選基因?yàn)槟繕?biāo)來開發(fā)多態(tài)性SNPs。該技術(shù)一次可定位多個(gè)性狀，而且定位精度高，可直接獲得與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因。因此，后續(xù)研究中有待于通過全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)等對(duì)新疆野蘋果抗病蟲害（抗蘋果樹腐爛病和蘋小吉丁蟲）、抗寒以及風(fēng)味形成的相關(guān)遺傳基因進(jìn)行挖掘，分析其遺傳構(gòu)成和基因調(diào)控機(jī)制。通過全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)，充分挖掘和利用新疆野蘋果基因資源，通過雜交育種與配套撫育等方法，創(chuàng)制營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的“功能性”新型蘋果品種，通過“利用保存”這一方式更好地保存新疆野蘋果遺傳資源，并基于優(yōu)質(zhì)的新疆野蘋果種質(zhì)資源，解決中國(guó)栽培蘋果的遺傳背景狹窄、種質(zhì)退化等相關(guān)問題，促進(jìn)中國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）