王祺 蒲媛媛 趙玉紅 孫柏林 金姣姣 王萬鵬 牛早霞 劉麗君 馬驪 武軍艷 方彥 李學才 孫萬倉

摘要：甘藍型冬油菜（Brassica napus L.）的冬前抽薹對北方冬油菜生產是極為不利的。SVP（Short vegetative phase）和SOC1（Suppressor of overexpression of constans 1）是與甘藍型冬油菜抽薹及生長相關的同源基因，為揭示甘藍型冬油菜抽薹機制，以甘肅農業(yè)大學育成的強冬性甘藍型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10為試驗材料，對SVP和SOC1克隆和表達情況進行分析。核酸序列分析結果表明，強冬性甘藍型冬油菜SVP和SOC1基因的開放閱讀框（ORF）長度分別為726 bp和642 bp，分別編碼241個和213個氨基酸;2個基因在進化過程中高度保守，屬于MADS-box家族成員，編碼的蛋白質均為α-螺旋和卷曲環(huán)組成的親水蛋白質，通過對不同抗寒性材料SVP和SOC1氨基酸序列比較，分別發(fā)現(xiàn)了4個和9個氨基酸位點突變。熒光定量（qPCR）分析結果表明，SVP基因在未抽薹植株葉中高表達，在抽薹未現(xiàn)蕾及抽薹現(xiàn)蕾植株葉中低表達;SOC1基因相對表達量的變化趨勢與SVP基因相反，抽薹現(xiàn)蕾及成熟植株中的SOC1基因相對表達量較未抽薹植株高。由此推測SVP和SOC1基因可能參與甘藍型冬油菜抽薹及成花的調控，研究結果可為今后選育強冬性甘藍型冬油菜晚抽薹抗寒品種提供理論依據(jù)。

關鍵詞：甘藍型冬油菜;抽薹;SVP基因;SOC1基因;基因表達

中圖分類號：S332;Q786文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1088-10

Abstract：The pre-winter bolting of Brassica napus L. is extremely disadvantageous to the production of winter rape in North China.SVP （Short vegetative phase） and SOC1 （Suppressor of overexpression of constans 1） are the homologous genes related to bolting and growth in Brassica napus L.. In order to reveal the bolting mechanism of winter rape （Brassica napus L.）， strong winterness Brassica napus L. strains 16VHNTS158， 16VHNPZ269-1 and 16VHTS309-10 bred by Gansu Agricultural University were used as experimental materials to analyse the cloning and expression of SVP and SOC1. The results of nucleotide sequence analysis showed that the open reading frames （ORF） of SVP and SOC1 genes in winter type Brassica napus L. were 726 bp and 642 bp in length， encoding 241 and 213 amino acids respectively. The two genes belonging to MADS-box family are highly conserved in evolution， which encode hydrophilic proteins composed of α-helix and loop. By comparing the amino acid sequences of SVP and SOC1 in different cold-resistant materials， four and nine amino acid site mutations were found respectively. The results of quantitative real-time PCR （qRT-PCR） showed that SVP gene was highly expressed in the leaves of unbolting plants， but lowly expressed in the leaves of bolting plants and budding plants. The relative expression changes of SOC1 gene were opposite to SVP gene. The relative expression of SOC1 gene in budding plants and mature plants were higher than in unbolting plants. It is suggested that SVP and SOC1 gene may be involved in the regulation of bolting and flower formation in Brassica napus L.， the results of this study can provide theoretical basis for the breeding of cold-resistant and late bolting varieties of strong winterness Brassica napus L. in the future.

Key words：Brassica napus L.;bolting;SVP gene;SOC1 gene;gene expression

甘藍型油菜（Brassica napus L.）是中國重要的油料作物，其播種面積占油菜播種面積的90%左右[1]，但抗寒性差，在35°N左右地區(qū)難以越冬[2]。甘藍型油菜的生長發(fā)育特性不同于白菜型油菜，先抽薹、后現(xiàn)蕾，這種生長特性對抵御北方地區(qū)的嚴酷自然環(huán)境極為不利，極易遭受凍害的影響[3]。甘藍型冬油菜抽薹早晚與其抗寒性密切相關，蒲媛媛等[4]的研究結果表明，抗寒性強的甘藍型冬油菜在春播條件下不抽薹，春化率低，絕大部分植株只進行營養(yǎng)生長;而抗寒性弱的材料，春化率較高，會出現(xiàn)抽薹、抽薹現(xiàn)蕾以及開花等處于不同生長發(fā)育階段的植株。因此，研究甘藍型冬油菜晚抽薹的分子調控機制，對甘藍型冬油菜的抗寒育種具有重要意義。SVP和SOC1都是MADS-box家族成員，SVP是重要的開花抑制基因，參與花分生組織的形成，并調節(jié)開花途徑中關鍵基因SOC1的表達，從而調控開花[5]。Hartmann等[6]研究發(fā)現(xiàn)，SVP 基因在擬南芥早花突變體的營養(yǎng)組織和花原基中表達，對抽薹開花具有抑制作用。Tang等[7]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達LoSVP基因的轉基因植株較對照延遲6 d開花，說明LoSVP基因對抑制擬南芥開花具有重要作用。王世祥等[8]發(fā)現(xiàn)，隨著蘋果花芽的不斷分化，SVP表達量逐漸下調，表明 SVP基因可能抑制蘋果成花誘導。大麥SVP基因異位表達引起成花阻遏[9];水稻中SVP基因在營養(yǎng)生長階段穩(wěn)定表達，而在生殖生長階段表達量有不同程度的減少[10]。SOC1基因不僅調控開花時間和參與花器官形態(tài)建成[11-12]，也是光周期、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑等開花路徑的主要調控信號整合因子[13]。Heuer等[14]在玉米中克隆到SOC1的同源基因ZmMADS1，并證明該基因與開花相關。Shitsukawa等[15]在小麥中克隆到WSOC1，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過表達WSOC1基因提前了轉基因植株的開花時間。Zhong等[16]在大豆中克隆到擬南芥SOC1同源基因GmGAL1，發(fā)現(xiàn)其主要作用是作為開花途徑的關鍵調節(jié)因子，與擬南芥中SOC1同源基因功能相似。SVP和SOC1對強冬性甘藍型冬油菜生長發(fā)育的影響尚未見報道。本研究以甘肅農業(yè)大學育成的強冬性甘藍型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10為試驗材料，研究SVP和SOC1對甘藍型冬油菜生長發(fā)育的影響，探究SVP和SOC1基因在甘藍型冬油菜抽薹、現(xiàn)蕾以及成花過程中的作用，為強冬性甘藍型冬油菜晚抽薹抗寒品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

以甘肅農業(yè)大學選育的16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10等3個不同抗寒性的強冬性甘藍型冬油菜品系為參試材料（表1）。試驗于2018年在甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)甘肅省油菜工程中心試驗基地進行，試驗點位于36°03′N、103°40′E，海拔2 150 m，最大凍土深度113 cm，最冷月平均氣溫-8.1 ℃，最冷月平均最低氣溫-14.6 ℃，極端最低氣溫-28.0 ℃[17]。2018年3月21日播種，行距20 cm，株距8～10 cm，小區(qū)面積4 m2，3次重復，于8月24日對3個冬油菜品系的植株生長發(fā)育狀態(tài)進行調查取樣分析。

取樣：3個冬油菜品系小區(qū)內的植株處于未抽薹、抽薹未現(xiàn)蕾、抽薹現(xiàn)蕾及結角成熟4種生長發(fā)育狀態(tài)。（1）對處于不同發(fā)育階段的植株葉片進行取樣，包含未抽薹植株葉片、抽薹未現(xiàn)蕾植株葉片、抽薹現(xiàn)蕾植株葉片以及結角成熟植株葉片。（2）對植株的不同組織器官進行取樣，對同一植株的葉、蕾、花3個組織部位分別進行取樣。取樣后用液氮速凍，用于RNA提取和基因克隆等試驗。

1.2甘藍型冬油菜葉、蕾及花的總RNA提取與反轉錄

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒DP419[天根生化科技（北京）有限公司產品]提取步驟分別提取甘藍型冬油菜葉、花蕾及花的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性并用NanoPhotometer Pearl測定濃度。用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒（大連TaKaRa公司）進行反轉錄，得到cDNA，置于- 20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SVP和SOC1基因的克隆

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到與甘藍型油菜相似性為100%，位于A09染色體上的SVP和位于C04染色體上的SOC1的CDS（編碼序列），利用Primer Premier 5.0設計SVP和SOC1基因的克隆引物（表2）。以16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10未抽薹植株葉片的cDNA為模板，采用聚合酶鏈式反應（PCR）進行體外擴增，擴增程序為：98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s;SVP基因退火溫度為55 ℃，退火15 s;SOC1基因退火溫度為58 ℃，退火15 s;72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，用DNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit）對目的片段進行切膠回收，與pMDTM19-T克隆載體進行連接，轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)12 h，篩選藍白斑并進行菌液PCR驗證，最終挑選3個陽性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4基因的生物信息學分析

應用DANMAN軟件對克隆基因進行多重序列對比和氨基酸同源性分析，用NCBI的ORF finder分析氨基酸序列，利用Protparam在線軟件分析氨基酸理化性質，包括氨基酸數(shù)目、理論等電點、相對分子質量[18]，利用ProtScale在線軟件分析蛋白質的親水性和疏水性[19]，利用NCBI（Conserved Domain Search）分析蛋白質保守結構域，利用TMpred在線軟件分析蛋白質跨膜區(qū)特性，利用SignalP 4.0 Server預測蛋白質信號肽，利用SOPMA在線工具進行蛋白質二級結構預測，利用SWISS-MODEL預測蛋白質三級結構，利用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹[20]。

1.5基因的表達分析

試驗采用實時熒光定量法（qPCR），分析SVP和SOC1在不同發(fā)育階段下甘藍型冬油菜植株葉片、花蕾及花中的相對表達量，基因相對表達量參照Pfaffl法[21]進行計算。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（表2）。根據(jù)TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（TaKaRa，大連）進行qPCR試驗，以 Actin為內參基因[22]，反應條件為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。熔解程序：95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s。擴增效率計算：將cDNA稀釋為50.000 ng/μl、25.000 ng/μl、12.500 ng/μl、6.250 ng/μl和3.125 ng/μl的質量濃度后作為模板進行擴增，利用Excel 2016繪制標準曲線后，進一步計算得到擴增效率。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、Origin 2018和SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2結果與分析

2.1甘藍型冬油菜SVP基因和SOC1基因的克隆

以16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10葉片的cDNA為模板，設計特異性引物并通過PCR分別獲得大小約為720 bp的SVP和640 bp的SOC1（圖1）。切膠回收后連接至pMDTM19-T載體，轉化大腸桿菌后進行藍白斑篩選，菌液經PCR鑒定后挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2.2甘藍型冬油菜SVP蛋白和SOC1蛋白的生物信息學分析

2.2.1SVP蛋白和SOC1蛋白的理化特性

2.2.1.1SVP蛋白的理化特性通過NCBI查詢SVP的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)該基因序列中含有大小為726 bp的完整開放閱讀框，編碼241個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。分別對從16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質進行了理化性質分析，如表3所示，SVP蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質。對克隆到的3個SVP基因所編碼的蛋白質進行親水性、信號肽、保守結構域、跨膜區(qū)、蛋白質二級結構及三級結構預測，發(fā)現(xiàn)3個蛋白質的分析結果一致，因此，接下來主要以16VHNTS158中克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質進行分析。SVP蛋白具有13個親水區(qū)和7個疏水區(qū)，具有保守的MADS結構域和K-box結構域，該蛋白質氨基酸序列中不存在信號肽切割位點，但含有2個跨膜區(qū)域，蛋白質二級結構和三級結構預測結果顯示， SVP蛋白主要由α-螺旋和卷曲環(huán)組成。

2.2.1.2SOC1蛋白的理化特性通過NCBI查詢SOC1的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)該基因序列中含有大小為642 bp的完整開放閱讀框，編碼213個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。分別對從16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10克隆到的SOC1基因編碼的蛋白質進行理化性質分析，如表4所示，SOC1蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質。對克隆到的3個SOC1基因所編碼的蛋白質進行親水性、保守結構域、信號肽、跨膜區(qū)、蛋白質二級結構及三級結構預測，發(fā)現(xiàn)3個蛋白質的分析結果一致，因此，接下來主要以16VHNTS158中克隆到的SOC1基因所編碼的蛋白質進行分析。SOC1蛋白有13個親水區(qū)和7個疏水區(qū)，具有保守的MADS結構域和K-box結構域，該蛋白質不存在信號肽切割位點，無跨膜區(qū)。蛋白質二級結構及三級結構預測結果表明，SOC1蛋白主要由α-螺旋和卷曲環(huán)組成。

2.2.2SVP蛋白和SOC1蛋白氨基酸序列比對

2.2.2.1SVP蛋白氨基酸序列比對通過DNAMAN軟件對克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，16VHNTS158和16VHNPZ269-1的蛋白質氨基酸序列相似性為100.00%，與16VHTS309-10的相似性為98.34%，比較16VHNTS158和16VHNPZ269-1與16VHTS309-10的SVP蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，存在4個氨基酸位點突變。將克隆到的SVP基因所編碼的蛋白質氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中甘藍型油菜和擬南芥的SVP蛋白氨基酸序列進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10與甘藍型油菜的相似性分別為99.59%、99.59%、97.93%，與擬南芥的相似性分別為92.12%、92.12%、91.29%（圖2）。

2.2.2.2SOC1蛋白氨基酸序列比對采用DNAMAN軟件對克隆到的SOC1基因所編碼的蛋白質氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，16VHNPZ269-1和16VHTS309-10的相似性為100.00%，與16VHNTS158的相似性為95.77%，比較16VHNPZ269-1和16VHTS309-10與16VHNTS158的SOC1蛋白質氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，存在9個氨基酸位點突變。將克隆到的SOC1基因所編碼的蛋白質氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中甘藍型油菜和擬南芥的SOC1蛋白氨基酸序列進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10與甘藍型油菜的相似性分別為96.24%、99.53%、99.53%，與擬南芥的相似性分別為91.12%、94.39%、94.39%（圖3）。

2.2.3SVP蛋白和SOC1蛋白系統(tǒng)進化樹分析

2.2.3.1SVP蛋白系統(tǒng)進化樹將SVP基因在16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10中所編碼的SVP蛋白氨基酸序列與甘藍型油菜、甘藍等8個物種的SVP蛋白同源氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹（圖4），DNAMAN軟件分析結果顯示，16VHNTS158、16VHNPZ269-1與甘藍型油菜SVP基因編碼的蛋白質氨基酸序列的相似性均為99.59%，與甘藍、蘿卜的相似性達到98.76%、97.93%，與煙草屬的相似性為54.36%。16VHTS309-10與甘藍型油菜、甘藍、蘿卜的SVP蛋白氨基酸序列的相似性分別達到97.93%、98.76%、96.27%，與煙草屬的相似性為54.36%。由此推測SVP基因在16VHNTS158、16VHNPZ269-1、16VHTS309-10、甘藍型油菜、甘藍等十字花科植物中的功能相似，與煙草屬植物的功能差異較大。

4結論

本研究從甘藍型冬油菜16VHNTS158、16VHNPZ269-1和16VHTS309-10中克隆到SVP和SOC1基因，基因相對表達量分析結果表明，在強冬性甘藍型冬油菜中，SVP基因在未抽薹植株中的表達量高于抽薹未現(xiàn)蕾及抽薹現(xiàn)蕾植株，SOC1基因在抽薹未現(xiàn)蕾及抽薹現(xiàn)蕾植株中的表達量高于未抽薹植株。由此推測SVP可能對未抽薹特性具有調控作用，SOC1在調控甘藍型冬油菜抽薹中的作用與SVP相反，具有負向調控作用。比較不同抗寒性材料SVP和SOC1核苷酸序列，分別發(fā)現(xiàn)了4個和9個氨基酸位點突變，而這些位點的突變是否改變了甘藍型冬油菜的抗寒性還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]周可金，童存泉，牛運生，等.2007年油菜籽發(fā)展的現(xiàn)狀、效益與前景分析[J]. 安徽農學通報，2007，13（19）：171-172.

[2]孫萬倉，武軍艷，方彥，等.北方旱寒區(qū)北移冬油菜生長發(fā)育特性[J]. 作物學報，2010，36（12）：2124-2134.

[3]孫萬倉，武軍艷，曾軍，等.8個白菜型冬油菜品種抗寒性的初步評價[J]. 湖南農業(yè)大學學報（自然科學版），2007，33（8）：151-155.

[4]蒲媛媛，趙玉紅，武軍艷，等.北方強冬性甘藍型冬油菜品種（系）抗寒性評價[J]. 中國農業(yè)科學，2019，52（19）：3291-3308.

[5]劉世男，林新春.植物SVP基因的研究進展[J]. 生物技術通報，2014，6（2）：9-13.

[6]HARTMANN U， HHMANN S， NETTESHEIM K， et al. Molecular cloning of SVP： a negative regulator of the floral transition in Arabidopsis[J]. Plant Journal， 2000， 21（4）：351-360.

[7]TANG X， LIANG M， HAN J， et al. Ectopic expression of LoSVP， a MADS-domain transcription factor from lily， leads to delayed flowering in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2020， 39（2）：289-298.

[8]王世祥，左希亞，邢利博，等.蘋果成花抑制蛋白SVP基因的克隆、表達及啟動子活性分析[J].園藝學報，2019，46（8）：1445-1457.

[9]TREVASKIS B， TADEGE M， HEMMING M N， et al. Short vegetative phase-like MADS-Box genes inhibit floral meristem identity in barley[J]. Plant Physiology， 2006， 143（1）：225-235.

[10]LEE S， CHOI S C， AN G . Rice SVP-group MADS-box proteins， OsMADS22 and OsMADS55， are negative regulators of brassinosteroid responses[J]. The Plant Journal， 2008， 54（1）：93-105.

[11]LEE JUNGEUN， LEE ILHA. Regulation and function of SOC1， a flowering pathway integrator[J]. Journal of Experimental Botany， 2010，61（9）：2247-2254.

[12]MELZER S， LENS F， GENNEN J， et al. Flowering-time genes modulate meristem determinacy and growth form in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Genetics， 2008， 40（12）：1489-1492.

[13]LIU C， XI W， SHEN L， et al. Regulation of floral patterning by flowering time genes[J]. Developmental Cell， 2009， 16（5）：720-722.

[14]HEUER S. The maize mads box gene ZmMADS3 affects node number and spikelet development and is co-expressed with ZmMADS1 during flower development， in egg cells， and early embryogenesis[J]. Plant Physiology， 2001，127（1）：33-45.

[15]SHITSUKAWA N， IKARI C， MITSUYA t， et al. Wheat SOC1 functions independently of WAP1/VRN1， an integrator of vernalization and photoperiod flowering promotion pathways[J]. Physiologia Plantarum， 2007， 130（4）：627-636.

[16]ZHONG X， DAI X， XV J， et al. Cloning and expression analysis of GmGAL1，SOC1 homolog gene in soybean[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（6）：6967-6974.

[17]武軍艷. 脫落酸（ABA）與北方白菜型冬油菜抗寒性的關系及NCED基因的克隆表達分析[D]. 蘭州：甘肅農業(yè)大學，2016.

[18]馬驪，袁金海，孫萬倉，等.白菜型冬油菜類甜蛋白的篩選、克隆及其在低溫脅迫下的表達[J].作物學報，2017，43（4）：620-628.

[19]THIELLEMENT H.Book review： proteomics protocols handbook[J].Proteomics， 2005， 5（13）：3546-3546.

[20]魯?shù)さ?，李保全，安素妨，?甘藍型油菜BnDMC1.A01基因的分離及序列分析[J]. 中國油料作物學報，2018，40（6）：745-754.

[21]PFAFFL M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research， 2001， 29（9）：e45.

[22]杜春芳.甘藍型油菜低溫誘導的轉錄組和蛋白組分析[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2016.

[23]MICHAELS S D， DITTA G， GUSTAFSON-BROWN C， et al. AGL24 acts as a promoter of flowering in Arabidopsis and is positively regulated by vernalization[J]. The Plant Journal， 2003， 33（5）：867-874.

[24]KANE N A， AGHARBAOUI Z， DIALLO A O， et al. TaVRT2 represses transcription of the wheat vernlization gene TaVRT1[J]. The Plant Journal， 2007， 51（4）：670-680.

[25]LEE J H， YOO S J， PARK S H， et al. Role of SVP in the control of flowering time by ambient temperature in Arabidopsis[J]. Genes & Development， 2007， 21（4）：397-402.

[26]JANG S， TORTI S， COUPLAND G . Genetic and spatial interactions between FT， TSF and SVP during the early stages of floral induction in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 2009， 60（4）：614-625.

[27]GREGIS V， SESSA A， DORCA-FORNELL C， et al. The arabidopsis floral meristem identity genes AP1， AGL24 and SVP directly repress class B and C floral homeotic genes[J]. The Plant Journal， 2009， 60（4）：626-637.

[28]LEE H. The AGAMOUS-LIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis[J]. Genes & Development， 2000， 14（18）：2366-2376.

[29]LEE S， KIM J， HAN J J， et al. Functional analyses of the flowering time gene OsMADS50， the putative suppressor of overexpression of co 1/AGAMOUS-like 20 （SOC1/AGL20） ortholog in rice[J]. The Plant Journal， 2004， 38（5）：754-764.

[30]陳吉寶. 普通菜豆P5CS基因的克隆、功能驗證及單核苷酸多態(tài)性[D]. 北京：中國農業(yè)科學院， 2008.

[31]陳滿霞，蔣玉蓉，於金生. 小麥春化作用研究進展[J]. 江蘇農業(yè)科學， 2019，47（24）：6-12.

[32]馮岳，褚蔚，隋新霞，等. 小麥冬春性人工低溫春化鑒定的研究[J].山東農業(yè)科學，2018，50（1）：9-15.

[33]栗延茹，于錫宏，蔣欣梅，等.春化有效積溫對結球甘藍春化相關物質的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學，2018，46（11）：122-124.

[34]WAALEN W M，STAVANG J A， OLSEN J E， et al. The relationship between vernalization saturation and the maintenance of freezing tolerance in winter rapeseed[J]. Environmental and Experimental Botany， 2014， 106（1）：164-173.

[35]孫萬倉，侯獻飛，楊剛，等. 一種利用高溫誘導鑒定白菜型冬油菜抗寒性的方法：CN104982173A[P]. 2015-10-21.

（責任編輯：陳海霞）