俎天嬌　喬瀟　張小芳　張鍇　 喬亞科　李桂蘭

摘要：為獲取干旱脅迫狀態(tài)下的bHLH家族相關(guān)基因，以30 d苗齡的野生大豆為試驗材料，澆灌20% PEG-6000模擬干旱脅迫，分別在干旱處理后0、6、12、24、48 h取樣提取葉片RNA并進行轉(zhuǎn)錄組測序。以基因本體論數(shù)據(jù)庫（GO）、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）、NCRI蛋白數(shù)據(jù)庫（NR）注釋的結(jié)果為基礎(chǔ)，以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞進行篩選，再綜合轉(zhuǎn)錄因子分析中提供的相關(guān)數(shù)據(jù)，共獲得177條相關(guān)序列，包括64個bHLH家族成員。通過蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析確定了4個干旱相關(guān)基因。為進一步研究野生大豆干旱脅迫下bHLH家族抗旱基因提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生大豆;轉(zhuǎn)錄組;干旱脅迫;bHLH;顯著差異表達基因;轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：S565.101 ??文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0024-06

收稿日期：2019-11-29

基金項目：河北省自然科學(xué)基金（編號：C2019407006）;國家轉(zhuǎn)基因重大專項（編號：2014ZX0800404B）。

作者簡介：俎天嬌（1997—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事植物遺傳資源及植物分子生物學(xué)研究。E-mail：947119850@qq.com。

通信作者：李桂蘭，博士，教授，主要研究方向為作物遺傳資源及作物基因工程。E-mail：lgl63@126.com。

干旱脅迫是植物普遍存在的非生物脅迫之一[1]，栽培大豆是豆類作物中對缺水最敏感的一種，缺水對栽培大豆產(chǎn)量和品質(zhì)會產(chǎn)生巨大影響[2]。野生大豆在抗逆性方面要優(yōu)于栽培大豆，較栽培大豆具有更多的抗逆基因[3-4]，為栽培大豆抗旱育種提供了重要的種質(zhì)資源。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，對真核生物的生長發(fā)育、新陳代謝和逆境脅迫等方面均有作用[5]。該家族基因成員較多，多數(shù)研究都是針對整個家族進行開展的[6]，目前除熟知的模式生物和作物[6-9]外，在黃芩[10]、沙冬青[11]、櫻桃[12]中也有研究，但在豆科植物中的研究[13]尤其是逆境脅迫下的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的報道較少。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)錄組測序來獲取差異表達基因已成為一種新的研究方法[14-17]，目前，已從不同研究角度對大豆或野生大豆基因進行了挖掘與分析[18-19]。本研究以30 d苗齡的野生大豆為材料，對全轉(zhuǎn)錄組進行測序，以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞進行篩選，并結(jié)合測序公司的轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果，從功能注釋、蛋白進化和互作等角度對序列進行分析，探討bHLH轉(zhuǎn)錄因子與干旱之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試野生大豆的種子采自河北省東部沿海地區(qū)昌黎縣，試驗所用材料為野生大豆永46的30 d苗齡幼苗;聚乙二醇（PEG6000）購自天津博美科生物技術(shù)有限公司。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

在野生大豆苗齡達30 d時，取未處理（0 h）及加入20% PEG-6000處理后6、12、24、48 h的同一個葉位復(fù)葉，并提取葉片總RNA。所得RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至深圳華大基因科技有限公司進行測序，具體步驟參考張小芳等的方法[20]。

1.3 功能注釋及ABC轉(zhuǎn)運蛋白關(guān)鍵詞搜索

將測序結(jié)果通過BLAST比對到公共數(shù)據(jù)庫，包括NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（NR）、基因本體論數(shù)據(jù)庫（GO）、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG），之后以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞進行篩選，綜合轉(zhuǎn)錄因子分析中提供的數(shù)據(jù)，最終獲得bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)序列信息。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

String（https：//string-db.org/）是研究蛋白-蛋白作用的在線生物網(wǎng)站。將表達差異基因?qū)朐摼W(wǎng)站，獲得蛋白互作數(shù)據(jù)，再通過Cytoscape對結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因簇注釋信息

以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞對獲得的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進行搜索，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析中提供的數(shù)據(jù)，共獲得了177條基因簇。這些基因簇的表達量FPKM值介于0～143.6之間，表達量在0～1 282.31之間。具體注釋情況見表1。這些被注釋的基因簇中，在GO中，被注釋到細胞組分、分子功能和生物學(xué)過程中的分別有10、38、11條;在與NR比對時，只有10條基因簇?zé)o注釋。

2.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子顯著差異表達基因統(tǒng)計分析

通過顯著差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的上調(diào)表達及下調(diào)表達情況可以了解樣本間的差異概況。對獲取的基因簇信息進行差異表達基因篩選，這些差異表達基因在不同處理時間點的兩兩對比情況見表2。以未處理材料作為參照，上/下調(diào)基因隨處理的時間延長而減少。

2.3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子顯著差異表達基因功能分析

2.3.1 GO功能分析

GO富集分析可將差異表達基因分為3類。由圖1可知，差異表達基因分屬于2個細胞組分、7個分子功能和16個生物學(xué)過程中，主要富集于胞內(nèi)帶膜細胞器（9個）、結(jié)合蛋白活性上（30個）。生物學(xué)過程的注釋項目最多，且各注釋項目分布較離散，富集因子在3個以上的僅有細胞形態(tài)建成、轉(zhuǎn)錄、激素響應(yīng)、紅光和遠紅光響應(yīng)以及分生組織分化。

2.3.2 KEGG富集分析

KEGG可以把從已經(jīng)完整測序的基因組中得到的基因目錄與更高級別的細胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關(guān)聯(lián)起來。

基于KEGG富集分析，共建成了4條通路，分別為K10798（poly[ADP-核糖]聚合酶）、K10863（aprataxin，APTX）、K12126（光敏色素作用因子3）和K13422（轉(zhuǎn)錄因子MYC2），各通路包含的差異基因數(shù)量分別為1、22、45、73個。包含注釋基因最多的K13422同時參與了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖2）和絲分裂原活化蛋白激酶途徑（圖3），主要參與了單萜類生物合成、吲哚生物堿的生物合成、衰老、防御反應(yīng)、傷害刺激和根部生長等過程。

2.3.3 NR聚類分析

NR即非冗余蛋白庫，在該數(shù)據(jù)庫中有注釋差異表達基因可以獲得對應(yīng)的蛋白序列數(shù)據(jù)。通過對蛋白序列進行匯總，可以按該數(shù)據(jù)庫有注釋的差異表達基因?qū)⒌鞍追譃?4個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。用鄰接法對差異表達基因進行分析，可將具有蛋白序列注釋的基因分為64個分類（圖4）。在這些分類中，自成1類的包括BEE3、bHLH35、bHLH149、bHLH90、bHLH128，除此之外，還有15個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的注釋為1個，但未單獨分類;bHLH25和bHLH18的注釋超過10個，但由于蛋白存在不同的亞型，并非所有的同一家族成員都聚在一類中;bHLH36與MYC2聚在一類;bHLH47與bHLH66、bHLH82聚在一類;bHLH67和bHLH70聚在一類;bHLH84與bHLH71聚在一類;bHLH91與CBF3聚在一類;bHLH111與bHLH130聚在一類;bHLH120與bHLH131聚在一類;bHLH126與bHLH18聚在一類;bHLH143與bHLH086聚在一類;bHLH144與bHLH13聚在一類;bHLH147與bHLH140聚在一類;bHLH148與bHLH106聚在一類;其他參與注釋的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員還包括bHLH3、bHLH122、bHLH30、bHLH135、bHLH93、bHLH87、bHLH68等。

2.4 bHLH轉(zhuǎn)錄因子差異基因蛋白互作分析

為了進一步從蛋白水平對bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族差異表達基因的生物學(xué)功能和調(diào)控作用進行研究，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。在眾多差異表達基因中，有15個存在蛋白互作關(guān)系，根據(jù)互作網(wǎng)絡(luò)的作用關(guān)系，從中選出了GLYMA01G23230.1（FAMA）、GLYMA08G36590.1（bHLH71）、GLYMA09G33730.2（MYC2）、GLYMA17G10740.1（bHLH47）這4個蛋白，可將其對應(yīng)的基因作為干旱脅迫的候選基因。

3 討論與結(jié)論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物第二大類轉(zhuǎn)錄因子家族[21]，具有典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，不僅參與了植物體內(nèi)氣孔發(fā)育[22]和激素信號傳導(dǎo)[23]等過程，而且在植物響應(yīng)干旱[24]、高鹽[25]、脫落酸（ABA）[26]、缺鐵[27]和低溫[28]等非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用。如AtbHLH122顯著受干旱的誘導(dǎo)[29]，AtbHLH68參與擬南芥體內(nèi)ABA的合成[30];Ghb HLH130在逆境脅迫條件下，顯著受干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo)[31]，OsbHLH148[32]、PebHLH35[33]的過表達增加了植物的耐旱性。

FAMA是氣孔發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控氣孔母細胞的分裂。FAMA突變體會產(chǎn)生不成熟的氣孔，進而影響氣孔的閉合，對水分的控制能力減弱[33];在對干旱條件下的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族進行分析時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AMA可以同時與bHLH71、bHLH93互作，bHLH71和bHLH93之間也有互作;目前對bHLH71尚未見報道，推測bHLH93與甾醇合成有關(guān)[9]，具體功能機制還有待進一步研究。

MYC2是MYC類轉(zhuǎn)錄因子中研究最深的，在植物受到環(huán)境脅迫時，一方面，可以啟動JA基因的表達，另一方面，有研究表明，MYC2轉(zhuǎn)錄因子對于植物抗氧化能力發(fā)揮重要的正調(diào)控作用[34-35]。在本研究中，注釋到的MYC類轉(zhuǎn)錄因子在模擬干旱處理12 h時表達量變化倍數(shù)最多的可達7倍以上，最少的也可達2倍，且MYC類轉(zhuǎn)錄因子間存在相互作用。

另外1組存在蛋白互作的轉(zhuǎn)錄因子是bHLH47與bHLH104。在蛋白序列聚類分析時，bHLH47與bHLH66、bHLH82聚在一類，目前關(guān)于bHLH47的報道尚不多見，Bruex等對擬南芥根表皮細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析時，同時注釋到了bHLH66和bHLH82，發(fā)現(xiàn)它們對根毛伸長有重要作用[36]。對bHLH104的研究報道主要集中在金屬鎘脅迫[37]和調(diào)控鐵平衡[38]方面，關(guān)于其干旱脅迫響應(yīng)功能尚未見報道。

野生大豆永46在干旱脅迫下差異表達的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因豐富，本研究共獲得177條相關(guān)序列，包括64個bHLH家族成員。在處理 6 h 時，注釋的差異表達基因最多，且差異在5倍以上基因最多;在GO分析中，生物學(xué)過程注釋最為豐富;通過進一步的蛋白進化樹和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析最終得到4個候選基因。

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