金鑫，李鴻洋，李敬雙，郭曉麗，于洋

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

大蒜為百合科蔥屬，二年生草本植物。大蒜營養(yǎng)豐富，嫩苗、花莖和鱗莖均可食用，用途廣泛，加工產(chǎn)品種類多樣，在國際貿(mào)易市場上占有重要地位，也是我國重要的出口創(chuàng)匯蔬菜。大蒜素是大蒜中含硫有機(jī)化合物的主要活性成分，對心血管疾病[1]和腫瘤疾病[2]有較好的治療作用，還有抗氧化[3]、抗菌[4]、抗炎[5]作用。建立小鼠炎性痛模型，大蒜素能降低腫脹，增強(qiáng)組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性, 降低丙二醛(MDA)含量，減弱白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)蛋白表達(dá)。表明大蒜素具有緩解疼痛作用，作用機(jī)制是抑制NF-κB信號通路和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。建立大鼠腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)大蒜素可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、釋放IL-1β來發(fā)揮抗炎作用[7]。然而，大蒜素對巨噬細(xì)胞抗炎作用的研究鮮有報(bào)道。

本研究體外建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥模型，檢測大蒜素對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、白細(xì)胞介素6(IL-6)分泌、炎癥介質(zhì)一氧化氮(NO)和環(huán)氧合酶2(COX-2)產(chǎn)生的影響，闡明大蒜素對巨噬細(xì)胞的抗炎活性。為大蒜素抗炎機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)，為大蒜素的開發(fā)，以及大蒜素在醫(yī)藥和飼料領(lǐng)域中的利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Balb/c小鼠(SPF級)，雄性，體重(20±2)g，8周齡，錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。

1.2 藥品及主要試劑

大蒜素(純度≥98%)為上海源葉生物科技生產(chǎn)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為天津浩連科技生產(chǎn)；胎牛血清(FBS)為鄭州九龍生物生產(chǎn)；RPMI-1640培養(yǎng)液、氯化銨(NH4Cl)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)為南京安培化工科技生產(chǎn)；臺盼藍(lán)(Trypan Blue)和二甲基亞砜(DMSO)為上海展云化工生產(chǎn)；地塞米松為山西諾成制藥生產(chǎn)；COX-2、IL-6、NO試劑盒均為上海嵐派生物生產(chǎn)；LPS和四甲基偶氮唑鹽(MTT)為北京索萊寶科技生產(chǎn)。

1.3 制備巨噬細(xì)胞懸液

將小鼠頸部斷髓致死，用75%酒精浸泡消毒3 min。在超凈工作臺內(nèi)無菌操作，腹腔注射PBS 4 mL，輕輕按摩腹部3 min。用注射器將腹腔液抽出放入離心管中，以1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入Tris-NH4Cl 1 mL，靜置5 min，1 500 r/min離心5 min，棄上液，重復(fù)操作直至紅細(xì)胞全部裂解。沉淀細(xì)胞用RPMI-1640完全培基液懸起，并染色，計(jì)數(shù)，使活細(xì)胞活力達(dá)到95%以上，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，棄上清和未貼壁細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至5×106個(gè)/mL。

1.4 中性紅吞噬試驗(yàn)法檢測大蒜素對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

參考甄慶潔等[8]方法進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)空白組、LPS組、地塞米松組(陽性對照組)、大蒜素單藥組、地塞米松和LPS復(fù)合藥組、大蒜素和LPS復(fù)合藥組，細(xì)胞培養(yǎng)用96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)?？瞻捉M每孔加入100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，LPS組每孔加入100 μL含LPS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(LPS的終濃度為1 μg/mL)，地塞米松組每孔加入100 μL含地塞米松的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(地塞米松終的濃度為80 μg/mL)，大蒜素單藥組每孔分別加入100 μL含不同濃度大蒜素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(大蒜素的終濃度為40、80、160和240 mg/mL)。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。地塞米松和LPS復(fù)合藥組每孔加入100 μL含地塞米松的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(地塞米松的終濃度為80 μg/mL)。大蒜素和LPS復(fù)合藥組每孔分別加入100 μL含不同濃度大蒜素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(大蒜素終濃度為40、80、160和240 mg/mL)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)2 h，再分別加入LPS(LPS終濃度為1 μg/mL)，培養(yǎng)22 h。每孔細(xì)胞用PBS洗滌后，加入1 g/L的中性紅生理鹽水100 μL，培養(yǎng)30 min，吸棄上清并用PBS洗滌3次，每孔加入細(xì)胞裂解液(醋酸和乙醇為1∶1)100 μL，4 ℃裂解12 h，酶標(biāo)儀檢測570 nm處OD值。

1.5 ELISA法檢測大蒜素對巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的影響

參考安妮[9]方法進(jìn)行試驗(yàn)。用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入l mL巨噬細(xì)胞懸液。設(shè)空白組、LPS組、地塞米松組(陽性對照組)、大蒜素單藥組、地塞米松和LPS復(fù)合藥組、大蒜素和LPS復(fù)合藥組，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，與上述同樣方法給藥。培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min取細(xì)胞上清液，采用ELISA 試劑盒檢測COX-2、NO的產(chǎn)生和IL-6的分泌量，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同字母表示組間差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用相同字母表示(P>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

吞噬功能檢測結(jié)果見表1。空白組與地塞米松組、大蒜素單藥組比較，空白組巨噬細(xì)胞的OD值極顯著(P<0.01)低于地塞米松組、大蒜素單藥組，表明大蒜素能夠提高巨噬細(xì)胞吞噬功能。大蒜素為濃度240 μg/mL時(shí)效果優(yōu)于其他濃度組。

表1 大蒜素對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(n=5)

空白組與LPS組比較：空白組巨噬細(xì)胞的OD值極顯著(P<0.01)低于LPS組，表明LPS能夠引起巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)。

LPS組與地塞米松+LPS復(fù)合藥組、大蒜素+LPS復(fù)合藥組比較，LPS組巨噬細(xì)胞的OD值極顯著(P<0.01)低于地塞米松+LPS復(fù)合藥組、大蒜素+LPS復(fù)合藥組，表明大蒜素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用。大蒜素濃度為240 μg/mL時(shí)效果優(yōu)于其他濃度組。

2.2 大蒜素對巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌的影響

大蒜素對巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌的影響見表2和表3、表4。

表2 大蒜素對巨噬細(xì)胞COX-2生成的影響(n=3) IU/L

表3 大蒜素對巨噬細(xì)胞NO生成的影響(n=3) pg/mL

表4 大蒜素對巨噬細(xì)胞IL-6分泌的影響(n=3) pg/mL

空白組巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌與大蒜素40 μg/mL濃度組比較差異不顯著(P>0.05)；但空白組極顯著地高于地塞米松組、大蒜素80、160、240 μg/mL濃度組(P<0.01)，說明大蒜素能夠抑制巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌，大蒜素濃度為240 μg/mL時(shí)效果優(yōu)于其他濃度組。

空白組與LPS組比較，空白組巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌極顯著低于LPS組(P<0.01)，表明LPS能夠引起巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)。

LPS組與地塞米松+LPS復(fù)合藥組、大蒜素+LPS復(fù)合藥組比較，LPS組巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌極顯著高于地塞米松+LPS復(fù)合藥組、大蒜素+LPS復(fù)合藥組(P<0.01)，表明大蒜素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用。大蒜素濃度為240 μg/mL時(shí)優(yōu)于其他濃度組。

3 討論

巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬功能，它可以吞噬入侵機(jī)體的各種有害異物。未活化的巨噬細(xì)胞吞噬作用有限，受到刺激的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，成為活化巨噬細(xì)胞，吞噬功能增強(qiáng)。巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子、干擾素和炎性介質(zhì)。IL-6在急性炎癥反應(yīng)中對多種細(xì)胞具有促炎作用，同時(shí)誘導(dǎo)肝組織產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白[10]。NO的合成能力與抗炎作用密切相關(guān)，NO在巨噬細(xì)胞內(nèi)合成，為干擾素或第二信號單獨(dú)作用時(shí)合成少量NO，對細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用，當(dāng)干擾素和第二信號共同作用時(shí)合成大量NO，對細(xì)胞的毒性作用增強(qiáng)。炎癥反應(yīng)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，可激活NO的產(chǎn)生，NO又促進(jìn)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，引發(fā)瀑布式炎性反應(yīng)[11]。COX主要分為COX-1和COX-2，其中COX-2為誘導(dǎo)型酶。炎性因素可誘導(dǎo)COX-2迅速合成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[12]。陳秀春等[13]證實(shí)大蒜素能夠提高巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞數(shù)，提高巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)。楊慶輝等[14]探討大蒜素對于前列腺癌患者機(jī)體免疫功能的影響及其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)大蒜素治療后前列腺液的COX-2、p38MAPK及血漿TNF-α、IL-6明顯降低。

本研究結(jié)果顯示，大蒜素對LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)時(shí)能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，降低巨噬細(xì)胞COX-2、NO的生成和IL-6分泌，與上述研究結(jié)果相一致。大蒜素可能通過激活靜止的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬功能?；罨木奘杉?xì)胞分泌干擾素(IFN)，IFN和LPS共同作用巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)，iNOS催化精氨酸產(chǎn)生大量NO，NO與氧自由基(O2-)結(jié)合生成具有強(qiáng)氧化性的過氧化亞硝基(ONOO-)，增強(qiáng)對細(xì)胞的毒性作用，引發(fā)細(xì)胞炎性反應(yīng)。NO又促進(jìn)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，引發(fā)瀑布式炎性反應(yīng)?；罨木奘杉?xì)胞分泌IL-6等細(xì)胞因子和COX-2等炎性介質(zhì)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。通過iNOS與COX-2之間存在的“交叉感應(yīng)”，共同參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究LPS組COX-2、NO的生成和IL-6分泌均極顯著高于其他組，說明LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)是成功的。大蒜素各濃度組COX-2、NO的生成和IL-6分泌均極顯著低于LPS組，說明大蒜素對巨噬細(xì)胞的抗炎作用是有效的，但其抗炎作用機(jī)制還有待于深入研究。

4 結(jié)論

大蒜素可通過提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能、影響細(xì)胞因子分泌和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。大蒜素對其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的影響及抗炎機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。