孟繁星，樊懿萱，鐘部帥，王鋒

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物科學(xué)類國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 江蘇 南京 210095)

我國山羊普遍存在著生長(zhǎng)速度慢、出欄體重輕、屠宰率低、肉品質(zhì)差等問題，是規(guī)?；犸曫B(yǎng)羊提質(zhì)增效面臨的重要瓶頸。因此，提高產(chǎn)肉性能及肉品質(zhì)是當(dāng)前山羊生產(chǎn)中要解決的重大問題之一。傳統(tǒng)的選育方法遺傳進(jìn)展緩慢，通過雜交導(dǎo)入外來品種的優(yōu)良等位基因，或者通過基因編輯技術(shù)模擬其他物種主效基因的突變能加速肉用新品種的培育。Fat-1基因編碼的不飽和脂肪酸脫氧酶能夠識(shí)別一系列16～20碳的n-6PUFAs底物，進(jìn)而能夠催化不同的n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的n-3PUFAs[1-2]。而n-3PUFAs是一類對(duì)人類有益的多不飽和脂肪酸，可降低血脂，預(yù)防多種疾病甚至癌癥等[3-6]。因此，生產(chǎn)轉(zhuǎn)Fat-1家畜，可為提高家畜的肉品質(zhì)及產(chǎn)肉能力提供思路[7-8]?；蚓庉嫾夹g(shù)使生產(chǎn)過表達(dá)Fat-1基因的肉羊新品種成為可能。

在基因工程中，要獲得大量純化的目的蛋白質(zhì)，需要構(gòu)建一種能夠高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)影響很大，是表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動(dòng)子嚴(yán)格調(diào)控著基因表達(dá)的時(shí)間和空間位置。啟動(dòng)子與受體細(xì)胞之間良好的兼容性對(duì)外源基因的表達(dá)有重要作用。同時(shí)，出于高水平表達(dá)的要求，這種啟動(dòng)子最好有較強(qiáng)的啟動(dòng)活性，并具有良好的調(diào)控系統(tǒng)。因此，構(gòu)建包含合適啟動(dòng)子的載體，可以提高外源基因表達(dá)效率。基因治療對(duì)目的基因在病人體內(nèi)的表達(dá)，要求嚴(yán)格的時(shí)間和空間位置，組織器官特異性啟動(dòng)子的研究使基因治療方法有了很大進(jìn)步。根據(jù)需要來構(gòu)建合適的組織特異性啟動(dòng)子載體，不僅便于研究新基因的功能，還可闡明生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及繁殖的過程與機(jī)理，在特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)定時(shí)、定點(diǎn)、定量的精確調(diào)控。

利用肌肉特異性啟動(dòng)子，通過構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體，能夠開啟基因固定于肌肉中表達(dá)。通過外源基因的蛋白或RNAs在山羊的骨骼肌中的表達(dá)，可很好地研究肌肉的分化或功能，改善肌肉的風(fēng)味、質(zhì)量。例如可利用肌肉特異性的啟動(dòng)子攜帶目的micRNA，特異性的靜默其靶基因在肌肉中的表達(dá)而不影響其他組織中此基因的正常表達(dá)，有效獲得目的基因?qū)τ诩∪饨M織的作用；同時(shí)，利用肌肉組織特異性啟動(dòng)子，研究那些通過QTL圖譜定位及表達(dá)分析獲得的可用于提高肌肉量的候選基因。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞

pEGFP-C1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD19-T質(zhì)粒購自TaKaRa公司，TOP10菌株購自北京天根公司，293FT細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器

5417R型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf)、PCR擴(kuò)增儀(TaKaRa)、電泳儀 DYⅢ 3A 型(北京六一儀器廠)、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清公司)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、熒光倒置顯微鏡(Nikon)、7300 型熒光定量PCR 儀(ABI)。

1.3 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒(D6943-01和D6950-01)購自O(shè)mega公司，所有的工具酶均購自TaKaRa公司，DNA片段的凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物公司，PCR引物的合成及載體測(cè)序均由Life Technologies公司完成；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶消化液、DPBS緩沖液、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自Life Technologies公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒(RP1202)購自北京百泰克生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)購自TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司。

1.4 主要溶液配制

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：每升含有酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min，室溫冷卻后放于4 ℃冰箱備用。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂粉，高壓蒸汽滅菌20 min，無菌條件下鋪平板。若加抗生素，鋪板之前，加入抗生素，卡那霉素(kanamycin)終濃度為50 μg/mL，氨芐青霉素(ampicillin)終濃度為100 μg/mL。

1.4.2 核酸電泳用試劑

6×Loading Buffer：4.4 g EDTA，250 mg 溴酚藍(lán)，250 mg Xylene Cyanol FF，180 mL 甘油，調(diào)節(jié)pH 至7.0，加去離子水定容至500 mL。

50×Tris-乙酸(TAE)：242 g Tris液，37.2 g Na2EDTA·2H2O，57.1 mL 冰乙酸，加去離子水定容至1 L。

1.5 試驗(yàn)方法

首先將Fat-1基因克隆入pEGFP-N1載體，然后將PCR擴(kuò)增得到的CMV增強(qiáng)子插入無啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的pEGFPN1-Fat-1載體，最后將骨骼肌特異性基因α肌動(dòng)蛋白(α-actin)啟動(dòng)子插入到上述載體中，構(gòu)建成α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體。骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖(見圖1)。

1.5.1 利用平末端連接構(gòu)建pEGFPN1-Fat-1載體

經(jīng)過EcoRⅠ酶切，從PCAGGS-Fat-1質(zhì)粒獲得Fat-1片段。將10×buffer 2 μL，質(zhì)粒DNA 10 μL，EcoRⅠ 1 μL，ddH2O添加至20 μL進(jìn)行酶切。電泳后，切膠回收Fat-1片段。

線性化pEGFP-N1載體。加10×buffer 2 μL，質(zhì)粒DNA 10 10 μL，BamHⅠ 1 μL，用ddH2O添加至20 μL，線性化處理pEGFP-N1載體。

將切膠回收后的Fat-1和線性化pEGFP-N1的cDNA末端，按照如下體系72 ℃ 45 min 補(bǔ)平。

反應(yīng)體系：Premix STAR 25 μL，F(xiàn)at-1的cDNA/pEGFP-N1的cDNA(已酶切) 20 μL，ddH2O添加至50 μL。

平末端連接：Solution I 5 μL，F(xiàn)at-1補(bǔ)平產(chǎn)物1 μL，pEGFP-N1補(bǔ)平產(chǎn)物 4 μL，16 ℃過夜。

圖1 骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1基因表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

1.5.2 pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體的構(gòu)建

根據(jù)PCAGGS載體的CMV-Enhancer序列，設(shè)計(jì)一對(duì)含有特異性酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR方法擴(kuò)增CMV-Enhancer基因。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將上述產(chǎn)物與pMD?19-T Vector連接。對(duì)CMV-Enhancer基因進(jìn)行測(cè)序后，與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列做Blast比對(duì)。擴(kuò)增山羊CMV-Enhancer基因的引物序列如下：

Enhancer-F：GCATTAATGGGGTCATTAGTTCATAGCCC(引入AseⅠ位點(diǎn))；

Enhancer-R：GCGTCGACTGGTAATAGCGATGACTAATACG(引入SalⅠ位點(diǎn))。

CMV-Enhance基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。分別利用SalⅠ和AseⅠ雙酶切pMD?19-T-CMV-enhancer和Fat1-pEGFP-N1載體并分別回收酶切產(chǎn)物CMV-Enhancer基因片段和線性化的Fat-1-pEGFP-N1載體。將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的pEGFPN1-Fat-1載體質(zhì)粒中，構(gòu)建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體。

1.5.3 α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體的構(gòu)建

SalⅠ單酶切骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子的DNA，插入到線性化的pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體上，構(gòu)建成α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體。采用分段PCR擴(kuò)增的方法，分別從羊肌肉組織DNA中擴(kuò)增1 824 bp和1 347 bp兩片段Part1和Part2，首尾相連插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒同一位置。各片段引物設(shè)計(jì)如下：

part1F: TCATCGCTATTACCAGTCGACAGCCCCC-CTCACTATTCTTTT；

part1R: CTGGGCAGCAGTTTTCCT；

part2F: GAAAACTGCTGCCCAGCCTACAGTGCA-ACGTCCTTGTCTT；

part2R: CGGGCCCGCGGTACCGTCGACAGGCT-TCTCTCGGCGCTGTCCGCT。

按照98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備兩段插入片段，膠回收備用。Part1不加任何添加劑，直接擴(kuò)增。Part2通過添加DMSO進(jìn)行擴(kuò)增優(yōu)化，在20 μL體系中，添加0.6 μL DMSO大量擴(kuò)增制備該片段。

SalⅠ單酶切pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體，膠回收備用。線性化pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體和α-actin的兩部分片段在ExnaseTM 催化下，37 ℃，30 min重組。置于冰水浴中5 min后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取轉(zhuǎn)換平板10個(gè)克隆，搖菌提取質(zhì)粒并鑒定。然后挑取3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.5.4 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體的功能驗(yàn)證

以海腎熒光素酶報(bào)告基因PRL-TK做內(nèi)參質(zhì)粒(用以校正轉(zhuǎn)染效率)，以LipofectamineTM2000做轉(zhuǎn)染試劑，將構(gòu)建的山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染山羊骨骼肌細(xì)胞，誘導(dǎo)分化的山羊骨骼肌細(xì)胞。用山羊心肌細(xì)胞和骨骼肌間充質(zhì)干細(xì)胞空轉(zhuǎn)做陰性對(duì)照，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，對(duì)山羊骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Fat-1表達(dá)載體的活性及組織特異性進(jìn)行分析，啟動(dòng)子活性大小用相對(duì)活性(螢火蟲熒光素酶的活性同內(nèi)參海腎熒光素酶的活性的比值)表示。

1.5.5 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡

按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，將α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊耳皮膚成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×106個(gè)/mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗1次，離心得到細(xì)胞團(tuán)，加入1 mL DNA染色液，漩渦混合5～10 s，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。采用Annexin V/PI染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)至少3次。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，差異顯著性分析使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，不同字母代表差異顯著，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 利用平末端連接構(gòu)建pEGFPN1-Fat-1載體

PCAGGS-Fat-1質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切后電泳可見1.3 kb的目的條帶及PCAGGS載體條帶(圖2)。pEGFP-N1質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切后電泳可見線性化的載體條帶(圖3)。

M. Marker；1. Fat-1

M. Marker；1. 線性化pEGFP-N1

將切膠回收后的Fat-1和線性化pEGFP-N1的cDNA末端補(bǔ)平，進(jìn)行平末端連接。pEGFPN1-Fat-1中Fat-1基因序列與EGFP連接處正確(圖4)。

圖4 pEGFPN1-Fat-1中Fat-1序列與EGFP連接處測(cè)序結(jié)果

2.1.2 pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體的構(gòu)建

對(duì)CMV-Enhancer基因進(jìn)行測(cè)序后，與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列做Blast比對(duì)，結(jié)果同源性為99.8%。CMV-Enhance基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見338 bp處明亮特異的目的條帶(圖5)。CMV-Enhancer基因測(cè)序結(jié)果與PCAGGS載體CMV-Enhancer序列一致(圖6)。利用pMD?19-T-CMV-enhancer載體上自帶的SalⅠ和AseⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將酶切產(chǎn)物定向克隆到無啟動(dòng)子pEGFPN1-Fat-1載體質(zhì)粒中，構(gòu)建成pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體(圖7和 圖8)。

M. Marker；1. 目的條帶

圖6 CMV-Enhancer基因測(cè)序結(jié)果

M.Marker；1～3. 目的條帶圖7 AseⅠ、SalⅠ雙酶切 M.Marker；1～3. 目的條帶圖8 AseⅠ、SalⅠ雙酶切

2.1.3 α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體的構(gòu)建

SalⅠ單酶切骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子的NDA，插入線性化的pEGFPN1-Fat-1-Ehancer載體，構(gòu)建成α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體。從羊肌肉組織DNA中，擴(kuò)增1 824 bp和1 347 bp兩片段Part1和Part2，首尾相連插入pEGFPN1-Fat-1-Ehancer質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增制備兩段插入片段(圖9)。

A. PCR擴(kuò)增Part1；B. 添加DMSO擴(kuò)增優(yōu)化Part2

PCR鑒定α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體(圖10)。而且，測(cè)序結(jié)果與GenBank 報(bào)道序列一致。說明α-actin promoter-pEGFPN1-Fat-1載體構(gòu)建成功。

2.2 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體的生物學(xué)功能

2.2.1 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體的功能驗(yàn)證

如圖11所示，試驗(yàn)構(gòu)建的載體僅在誘導(dǎo)分化的山羊肌肉細(xì)胞中表達(dá)，在未誘導(dǎo)分化的山羊骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中未檢測(cè)到熒光蛋白表達(dá)，無啟動(dòng)活性(圖11)。綜上所述，α-actin表達(dá)載體為骨骼肌特異性表達(dá)載體，能夠滿足下游基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。

M. Maker，0. 空載對(duì)照質(zhì)粒；1～10. 克隆

圖11 4種細(xì)胞中a-actin驅(qū)動(dòng)下的LUC的相對(duì)活性檢測(cè)

2.2.2 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體對(duì)耳成纖維細(xì)胞周期的影響

通過流式細(xì)胞儀測(cè)定了波爾羊耳成纖維細(xì)胞(BG)、轉(zhuǎn)Fat-1羊成纖維細(xì)胞(BG-Fat-1)、杜泊羊耳成纖維細(xì)胞(DS)及轉(zhuǎn)Fat-1基因杜泊羊耳成纖維細(xì)胞(DS-Fat-1)的細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Fat-1基因細(xì)胞比相對(duì)應(yīng)非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)，初步推測(cè)，F(xiàn)at-1基因促進(jìn)羊耳成纖維細(xì)胞增殖，為后續(xù)進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)(圖12)。

2.2.3 山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體對(duì)耳成纖維細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀測(cè)定了細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果見圖13A。BG-Fat-1組細(xì)胞凋亡率顯著低于BG組，DS和DS-Fat-1組差異不顯著，但凋亡率有下降趨勢(shì)(圖13B)。

圖13 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)Fat-1基因細(xì)胞的凋亡率低于相對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，初步推測(cè)Fat-1基因參與調(diào)節(jié)羊耳成纖維細(xì)胞凋亡。

3 討論

啟動(dòng)子嚴(yán)格調(diào)控著基因表達(dá)的時(shí)間和空間位置。啟動(dòng)子與受體細(xì)胞之間良好的兼容性對(duì)外源基因的表達(dá)有重要作用[9]。因此，選擇合適的特異性啟動(dòng)子可以顯著影響所構(gòu)建的表達(dá)載體對(duì)外源基因的表達(dá)效率。另外，根據(jù)需要來構(gòu)建合適的組織特異性啟動(dòng)子載體，不僅便于研究新基因的功能，還可闡明生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及繁殖過程與機(jī)理，在特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量精確調(diào)控。

近年來， 隨著基因組測(cè)序等生物技術(shù)的飛速發(fā)展, 除了α肌動(dòng)蛋白(α-actin)[10]、人們還分離了許多骨骼肌特異性啟動(dòng)子, 如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(FATP1)、骨骼肌肌球蛋白輕鏈2(Mylpf)、肌肉肌酸激酶(CKM)、肌原調(diào)節(jié)蛋白1(Myoz1)和快肌肌鈣蛋白C(Tnnc2)等骨骼肌特異性基因啟動(dòng)子，但是哪個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及其對(duì)山羊骨骼肌細(xì)胞增殖、分化作用最顯著，目前還不得而知。

本文利用骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子，構(gòu)建了一種山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Fat-1表達(dá)載體，不僅開啟了將基因局限于骨骼肌中表達(dá)的通路，而且滿足了下游基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。研究結(jié)果表明，選擇山羊骨骼肌特異性基因α-actin啟動(dòng)子構(gòu)建的載體僅在誘導(dǎo)分化的山羊肌肉細(xì)胞中表達(dá)，在未誘導(dǎo)分化山羊骨骼肌，心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中并未檢測(cè)到熒光蛋白，無啟動(dòng)活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)at-1基因促進(jìn)羊耳成纖維細(xì)胞增殖，抑制凋亡。初步預(yù)測(cè)得到的Fat-1轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞可作為后期體細(xì)胞核移植的優(yōu)良細(xì)胞核供體，為下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。