嚴(yán)安心,陳靜,劉洪迪,李永久,彭柱,趙禾苗,李亮,趙興春*

1.公安部物證鑒定中心， 北京 100038； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 北京 100081

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)是存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，由含2～6個堿基對的重復(fù)單位串聯(lián)構(gòu)成。DNA STR分型檢驗是當(dāng)前法庭科學(xué)進(jìn)行個體身份識別和親緣關(guān)系判斷的主要依據(jù)[1-4]。我國法醫(yī)DNA STR分型檢驗技術(shù)已經(jīng)處于世界先進(jìn)水平，并已建立了全世界最大的DNA STR分型數(shù)據(jù)庫，協(xié)助公安機(jī)關(guān)破獲了一系列重大疑難案件。然而，在STR分型技術(shù)快速發(fā)展的同時，如何從根本上保障DNA檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確度、可信度成為一個亟待解決的問題。目前已經(jīng)商品化和尚處于研發(fā)階段的DNA檢驗試劑盒種類眾多，要評價這些試劑盒的品質(zhì)、判斷這些試劑盒分型結(jié)果的準(zhǔn)確性都需要構(gòu)建DNA STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體系。

STR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是法醫(yī)DNA STR分型進(jìn)行量值溯源的物質(zhì)基礎(chǔ)，一直以來僅由美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST)生產(chǎn)、提供。美國NIST構(gòu)建的STR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由一系列的基因組DNA和細(xì)胞構(gòu)成，而我國研究人員趙興春等[5]首次提出應(yīng)用人工合成的DNA構(gòu)建STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。與基因組DNA或細(xì)胞不同，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以根據(jù)某個基因座上中國人群的等位基因分布頻率靈活篩選、合成目標(biāo)片段，且容易大量制備、生產(chǎn)成本低。

本研究以D6S1043基因座為例，介紹STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備過程。D6S1043基因座位于人類6號染色體長臂1區(qū)5帶，屬于人類6號染色體上入庫數(shù)據(jù)中第1043號序列[6]，為我國法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫常用的基因座之一[7]。D6S1043基因座的重復(fù)單元為ATCT，本研究中D6S1043-1為D6S1043基因座上的1個等位基因，含有13個重復(fù)單元(核心序列為[ATCT]13)，按照命名規(guī)則，在D6S1043基因座上的命名為13，分型的理論值為13。人D6S1043-1型STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要用于分型鑒定中對D6S1043基因座的分型值進(jìn)行溯源。依據(jù)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[8]，本研究通過構(gòu)建含D6S1043-1片段的重組質(zhì)粒，并評估質(zhì)粒溶液的均勻性和穩(wěn)定性、測定溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度、檢測D6S1043-1的分型值等過程，以期制備人D6S1043-1型STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

pUC57載體、限制性核酸內(nèi)切酶(SmaⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ)、T4 DNA連接酶、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、TaqPCR Mix預(yù)混液(2×, 不含染料)(生工生物工程(上海)股份有限公司)；國內(nèi)外的STR分型試劑盒：Typer19C試劑盒(公安部物證鑒定中心)、FastDirect 27A身份鑒定試劑盒[百特元生物科技(北京)有限公司]、VeriFiler Plus試劑盒(美國ThermoFisher公司)、PowerPlex21試劑盒(美國Promega公司)；其他生化試劑均為分析純。目標(biāo)序列、引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

微量核酸蛋白定量儀NanoDrop 2000、ProFlex 1x96-Well PCR儀、3500xL遺傳分析儀(美國ThermoFisher公司)；QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；新羿TD-1微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)(北京新羿生物科技有限公司)。

1.2 質(zhì)粒DNA的構(gòu)建

目標(biāo)序列D6S1043-1的長度為1 014 bp(核心重復(fù)序列 [ATCT]13長52 bp，向上延長482 bp，向下延長480 bp)，在頭、尾分別引入SmaⅠ和Hind Ⅲ 2個酶切位點(diǎn)，進(jìn)行雙酶切。將原始長度為2 710 bp的pUC57載體用SmaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切。用T4 DNA連接酶連接D6S1043-1與pUC57載體，形成重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，于37 ℃搖床培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。

采用3種方法對重組質(zhì)粒DNA序列的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗證：①雙酶切實驗：用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和Hind Ⅲ消化重組質(zhì)粒，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果；②Sanger測序；③STR分型檢測：使用國內(nèi)外商品化的STR分型試劑盒對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用3500xL遺傳分析儀進(jìn)行檢測、分析，獲得分型值。

選取連接成功的重組質(zhì)粒D6S1043-1-pUC57，制備質(zhì)粒溶液，使用微量核酸蛋白定量儀檢測質(zhì)粒溶液的純度。

用BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒，使其線性化，以滿足微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)的實驗要求。獲得的線性重組質(zhì)粒溶液即為此次研究的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，置于-20 ℃保存。

1.3 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)條件的摸索

1.3.1ddPCR所需引物探針的設(shè)計 設(shè)計熒光探針D6S1043-1-P：5′-[FAM]-TCTTCTCCTGC-TCTTGAACA-[MGB-1]-3′。

以同一重組質(zhì)粒溶液做模板進(jìn)行ddPCR，比較表1中3對引物在ddPCR反應(yīng)中的擴(kuò)增效率，每對引物擴(kuò)增2次。

表1 研究所用引物序列Table 1 The primers used in this study

ddPCR反應(yīng)體系(20 μL)為：ddPCR supermix 10 μL，引物終濃度900 nmol·L-1，探針終濃度250 nmol·L-1，模板 2 μL，用水補(bǔ)齊至20 μL。ddPCR擴(kuò)增程序為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；98 ℃ 10 min；12 ℃ 60 min。升降溫速率2.5℃·s-1。

1.3.2ddPCR反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化 設(shè)計單因素實驗，考察ddPCR反應(yīng)中引物探針濃度、退火溫度及升降溫速率對產(chǎn)物濃度、數(shù)值穩(wěn)定性、微滴分散程度等的影響，優(yōu)化ddPCR反應(yīng)條件。各因素水平設(shè)置為：引物終濃度分別700、900、1 100 nmol·L-1，探針終濃度相應(yīng)分別為150、250、350 nmol·L-1；退火溫度分別為50、53、55、58 ℃；升降溫速率分別為1.5、2.5、3.5 ℃·s-1。其余同1.3.1。

1.4 均勻性評估

將質(zhì)粒溶液稀釋至一定濃度范圍制備成候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。均勻性評估實驗中，采用優(yōu)化后的ddPCR方法對候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核酸含量進(jìn)行檢測。制備300管候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品(100 μL·管-1)，按順序編碼，采用隨機(jī)數(shù)表決定取樣號碼，隨機(jī)抽取15管，每管重復(fù)檢測3次，評估樣品的均勻性。

1.5 穩(wěn)定性評估

本研究評估了候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。

短期穩(wěn)定性：300管候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品(100 μL·管-1)中隨機(jī)選取15管置于4 ℃，取樣時間分別為第0、2、5、9、14天，每次取其中3管，用優(yōu)化后的ddPCR方法對DNA濃度進(jìn)行檢測，每管重復(fù)檢測3次，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

長期穩(wěn)定性：300管候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品(100 μL·管-1)中隨機(jī)選取15管標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于-20 ℃，取樣時間分別為第0、1、2、4、6月，每次取其中3管，用優(yōu)化后的ddPCR方法對DNA濃度進(jìn)行檢測，每管重復(fù)檢測3次，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及不確定度的評定

核酸拷貝數(shù)的定值及不確定度的評定：選取8家實驗室使用優(yōu)化后的ddPCR方法對質(zhì)粒DNA溶液的核酸拷貝數(shù)進(jìn)行聯(lián)合定值。每個實驗室分發(fā)同批次的4管標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品，使用優(yōu)化后的ddPCR方法測定樣品濃度，每個樣品測定2次。匯總8家實驗室的定值數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)可疑值檢驗、組間數(shù)據(jù)等精度檢驗和整體數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗，以確保測量數(shù)據(jù)是等精度數(shù)據(jù)且組間平均值無顯著性差異。所有有效數(shù)據(jù)的總平均值即為核酸拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。將定值不確定度與均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以因子(即包含因子k)得到擴(kuò)展不確定度U[8]。

STR分型的定值：選取6家實驗室使用商品化的STR分型試劑盒對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分型值進(jìn)行測定并匯總分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒D6S1043-1-pUC57的構(gòu)建

2.1.1序列驗證 采用雙酶切法、Sanger測序法、多種STR分型試劑盒的分型鑒定等方法驗證重組質(zhì)粒D6S1043-1-pUC57的序列準(zhǔn)確性。重組質(zhì)粒經(jīng)SmaⅠ和HindⅢ雙酶切后釋放的片段大小如圖1所示，D6S1043-1、pUC57的片段大小均與預(yù)期范圍一致。D6S1043-1經(jīng)Sanger測序驗證，序列準(zhǔn)確。采用Typer19C、FastDirect 27A、VeriFiler Plus、PowerPlex21等STR分型試劑盒對該重組質(zhì)粒在各種商品化STR分型試劑盒上的適用性進(jìn)行驗證，在D6S1043基因座上的分型值均為13。以上結(jié)果表明，重組質(zhì)粒大小及序列與預(yù)期一致，且能適用于各種商品化STR分型試劑盒的分型檢測。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切Fig.1 Products of the double restriction-enzyme digestion of the recombinant plasmid

2.1.2純度驗證 參照GB/T 34796-2017《水溶液中核酸的濃度和純度檢測紫外分光光度法》[9]，對質(zhì)粒溶液的純度進(jìn)行考察。本批次制備的候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，來源于同一質(zhì)粒母液，用紫外分光光度法檢測3次，OD260/OD280的平均值為1.84，OD260/OD230的平均值為2.19。根據(jù)GB/T 34796-2017的判斷標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)粒DNA溶液無顯著的RNA、蛋白質(zhì)、酚鹽、硫氰酸鹽或其他有機(jī)化合物的污染，純度滿足DNA樣品制備要求。

2.2 ddPCR檢測方法的建立

2.2.1引物探針的篩選 合適的引物探針序列是進(jìn)行ddPCR反應(yīng)的前提條件。3對引物在相同ddPCR反應(yīng)條件下的擴(kuò)增效果如圖2所示，1號引物在相同模板下的擴(kuò)增效率最高，故選擇1號引物與探針搭配作為候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測引物和探針。

圖2 不同引物的擴(kuò)增效率比較Fig.2 Comparison of amplification efficiency of different primers

2.2.2引物探針濃度的優(yōu)化 引物探針的濃度過低會影響與模板的結(jié)合，濃度過高會抑制PCR的反應(yīng)進(jìn)程。圖3結(jié)果表明900 nmol·L-1引物與250 nmol·L-1探針的濃度組合，獲得的核酸拷貝值最高，數(shù)值最穩(wěn)定，故選用此濃度為最終反應(yīng)濃度。

圖3 引物探針的濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of primer and probe concentration

2.2.3退火溫度的選擇 退火溫度過低或過高都會影響引物探針與模板的結(jié)合效率。從圖4可以看出，退火溫度為55 ℃時測得的核酸拷貝數(shù)最高，因此，將退火溫度定為55 ℃。

圖4 退火溫度優(yōu)化Fig.4 Optimization of annealing temperature

2.2.4升降溫速率的選擇 升降溫速率是數(shù)字PCR實驗中很關(guān)鍵的影響因素，升降溫速率過快或過慢均會導(dǎo)致陽性微滴散亂，影響實驗效果。從圖5可以看出，升降溫速率為1.5 ℃·s-1和2.5 ℃·s-1時，陽性微滴的熒光信號均較高；3.5 ℃·s-1時，陽性微滴的熒光強(qiáng)度明顯降低，陰性微滴增多。為了保障檢測效果，同時節(jié)約檢測時間，最終選擇2.5 ℃·s-1的升降溫速率。

綜上所述，最終優(yōu)化結(jié)果為：①選擇D6S1043-1-F-1、D6S1043-1-R-1、D6S1043-1-P作為ddPCR反應(yīng)的引物對和探針；②ddPCR反應(yīng)體系為: ddPCR supermix 10 μL，引物終濃度900 nmol·L-1，探針終濃度250 nmol·L-1，模板2 μL，用水補(bǔ)齊至總體積20 μL；③ddPCR擴(kuò)增程序為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；98 ℃ 10 min；12 ℃ 60 min。升降溫速率為2.5 ℃·s-1。

注：藍(lán)色：陽性微滴，灰色：陰性微滴；A07、B07、C07分別表示不同反應(yīng)體系在96孔板上的位置。圖5 不同升降溫速率下微滴的檢測結(jié)果Fig.5 Droplet detection results at different heating and cooling rates

2.3 均勻性檢驗結(jié)果

采用優(yōu)化后的ddPCR法，以質(zhì)粒濃度為主要量值，以2 μL為最小取樣量，采用方差分析法對該質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗，算得統(tǒng)計量F為0.85

2.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

采用優(yōu)化后的ddPCR方法，以候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)粒濃度為主要量值，對4 ℃存貯條件下的短期穩(wěn)定性和-20 ℃存儲條件下的長期穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

短期穩(wěn)定性考察中，4 ℃貯存條件下所有樣本的濃度平均值為7.65×103copies·μL-1，采用線性模型對穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，穩(wěn)定性斜率β1的絕對值

長期穩(wěn)定性考察中，-20 ℃貯存條件下所有樣本的濃度平均值為7.60×103copies·μL-1，采用線性模型對穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，穩(wěn)定性斜率β1的絕對值

2.5 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值和不確定度評估

2.5.1濃度定值結(jié)果 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度由8家實驗室合作定值，經(jīng)過數(shù)據(jù)檢驗和統(tǒng)計得知各組測量數(shù)據(jù)為等精度數(shù)據(jù)，并且組間平均值無顯著性差異，故此，標(biāo)準(zhǔn)值用算術(shù)平均值表示，為7.7×103copies·μL-1，各實驗室測量結(jié)果如表3所示。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 Statistical results of the stability test

表3 8家實驗室的濃度測定結(jié)果Table 3 The concentration results of the reference material in eight labs

2.5.2濃度不確定度的評估 經(jīng)統(tǒng)計，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的不確定度來源由3個部分組成。第一部分為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗引入的不確定度urel(bb)=1.4%；第二部分為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度，其中短期穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度urel(短s)=4.6%，長期穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度urel(長s)=3.3%；第三部分為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度urel(c)=4.7%，其中包括數(shù)據(jù)統(tǒng)計引入的不確定度和通過對定值過程中影響因素進(jìn)行分析評定得到的不確定度。將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k=2(置信區(qū)間95%)，得到擴(kuò)展不確定度為1.2×103copies·μL-1。

2.5.3STR分型檢測結(jié)果 該質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在D6S1043基因座上的分型值由6家實驗室采用PCR-毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行協(xié)同定值，經(jīng)檢測，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在D6S1043基因座上的分型值均為13，其他基因座上沒有分型。

3 討論

法庭科學(xué)DNA STR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是驗證DNA檢驗結(jié)果是否準(zhǔn)確的標(biāo)尺，是保障國家DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)、DNA實驗室認(rèn)可等過程中DNA檢測數(shù)據(jù)的一致性和可比性的重要基礎(chǔ)性物質(zhì)[11]，在DNA檢驗標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化建設(shè)過程中必不可少，我國在這一領(lǐng)域的研究空白亟待填補(bǔ)。本研究研制的人D6S1043-1型STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均勻性、穩(wěn)定性良好，量值準(zhǔn)確、可靠，滿足JJF 1006-1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》要求[10]。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制為DNA STR分型檢測中D6S1043基因座的分型檢測提供了量值溯源的依據(jù)，為DNA STR分型檢測的實驗室質(zhì)量控制提供了有力保障。

STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與基因組型或細(xì)胞型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，具有等位基因可根據(jù)需要任意組合、易于大規(guī)模量產(chǎn)、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但也有自身的缺陷，如一個質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只能檢測1個基因座的分型值，當(dāng)對分型試劑盒多個基因座的分型質(zhì)量進(jìn)行同時檢測時，需要混合應(yīng)用多個質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而一個基因組型或細(xì)胞型STR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可同時檢測分型試劑盒在多個基因座上的分型質(zhì)量。因此在進(jìn)行STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的同時可兼顧基因組型或細(xì)胞型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的開發(fā)。

美國在法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方面保持國際領(lǐng)先，其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究工作隨著DNA檢測技術(shù)的發(fā)展而不斷深入[12-14]，目前美國NIST提供的法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于常染色體STR、Y-STR、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)、插入/缺失突變(insertion-deletion，InDel)、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)等多種DNA分析技術(shù)的質(zhì)量控制[14]。我國研究人員在充分借鑒國外研究經(jīng)驗的同時, 也在不斷探索研制適合中國人群使用的DNA分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[15]。2020年4月26日，經(jīng)國家市場監(jiān)督管理總局鑒定、批準(zhǔn)，包括“人D6S1043-1型STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)” [編號：GBW(E)091072] 在內(nèi)的5個法醫(yī)DNA STR質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書。該成果是我國法庭科學(xué)DNA檢驗領(lǐng)域首次獲得有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為我國法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體系的進(jìn)一步拓展奠定了基礎(chǔ)，對我國法醫(yī)DNA事業(yè)的發(fā)展具有重大的現(xiàn)實意義和戰(zhàn)略意義。