解美霞,王燕,趙新,高越,劉雙,陳銳,蘭青闊,徐曉輝,曹際娟,王永*

1.天津市農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 天津 300381； 2.河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 河北 保定 071001;3.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院, 河北 保定 071001;4.山東省農(nóng)業(yè)科學院， 濟南 250100；5.大連民族大學, 遼寧 大連 116600

基因編輯技術主要通過序列特異核酸酶特異切割DNA靶標位點造成雙鏈斷裂，誘導DNA損傷修復機制對基因組的定向編輯?；蚓庉嫾夹g從出現(xiàn)以后就為全球的生物學家提供了一個新的研究思路。目前應用廣泛的以Cas9蛋白以及向導 RNA (gRNA)為核心組成的 CRISPR/Cas9 技術，應用于編輯靶標位點過程中，該方法簡便且編輯效率高，目前已被廣泛應用于多種作物中[1-3]。應用基因編輯技術不僅可以使農(nóng)作物表現(xiàn)出抗病蟲害的優(yōu)良性狀，同時還能使農(nóng)作物的產(chǎn)量大幅度提升[4-7]。目前這一技術在水稻中已有許多重大進展：如通過基因編輯技術獲得產(chǎn)量的增加；通過基因編輯技術對水稻基因進行替換和敲除從而獲得抗除草劑以及抗逆的優(yōu)質水稻新品種[8-10]。

轉基因生物自出現(xiàn)以來就備受關注，到目前為止我國已有幾種作物被允許進行轉基因產(chǎn)品的生產(chǎn)及加工。通過基因編輯技術編輯靶標基因后，生物的全部遺傳物質中只有少數(shù)基因發(fā)生了改變，尤其是一些少量或者單堿基插入缺失造成突變的基因編輯產(chǎn)物，這導致現(xiàn)有的一些轉基因檢測技術無法用于基因編輯產(chǎn)物的檢測。因此目前亟需新的檢測技術應對越來越多的基因編輯生物，做好轉基因產(chǎn)品的檢測工作，為農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)與發(fā)展提供技術支撐。

焦磷酸測序(pyrosequencing)技術是通過 4 種酶(ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及熒光素酶)共同催化反應體系的一種酶級聯(lián)化學反應。該技術可用于對已知短序列的測序分析，不需要熒光標記引物及電泳檢測。相比較其他測序方法，焦磷酸測序技術具有實時檢測、分析快速準確等特性[11-12]。目前已成為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因分型、突變檢測等的一種有效手段。由于基因編輯產(chǎn)物大多是通過突變、敲除或者插入幾個堿基，類似于物種的定向突變，因此利用焦磷酸測序技術檢測轉基因產(chǎn)品就成為了可能。

本研究利用焦磷酸測序技術檢測 CRISPR/Cas9 編輯技術誘導的水稻PL3基因中的靶向突變，以期建立一種基因編輯水稻檢測技術，期望本研究能夠在現(xiàn)有轉基因產(chǎn)品的檢測體系中進行提升及補充，從而更好更快的開展轉基因檢測工作，并為其他基因編輯產(chǎn)物的檢測提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試基因編輯型水稻與親本日本晴(野生型水稻)均由山東省農(nóng)業(yè)科學院基因功能研究團隊提供?；蚓庉嬓退纠?CRISPR/Cas9 技術在 LOC_Os01g56780 位點誘導插入堿基 A，導致PL3基因功能發(fā)生改變。

1.2 試驗儀器

Pyro Mark焦磷酸測序儀(Pyro Mark Q96 ID)、普通 PCR 儀(ABI Veriti 96)、凝膠成像儀(Azure C150)、電泳儀(EPS-3000-VII)、高速冷凍離心機(Eppendorf Centrifuge 5810/5810 R)、恒溫水浴鍋(HH-600)、超微量分光光度計(Nanodrop 1000)。

1.3 試驗試劑及配置

植物DNA提取試劑盒(TianGen公司)、DNA Marker(TaKaRa公司)、GelRed 染料、 2×GoTaq Green Master Mix(Promega公司)、乙二酸四乙酸二鈉(EDTA·Na2)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；冰乙酸； Binding Buffer(QIAGEN)； Annealing Buffer(QIAGEN)、Washing Buffer、Sepharose beads (Qiagen公司)。

1.4 DNA提取

將野生型水稻和編輯型水稻種子經(jīng)滅菌處理后種植并放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待生長至3葉期時取植株幼嫩葉片組織。用液氮充分研磨葉片后取100 mg樣品粉末置于2 mL離心管中。使用植物 DNA 提取試劑盒提取水稻DNA，經(jīng)分光光度計測定樣品DNA濃度后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 焦磷酸測序引物設計及有效性檢測

使用 PSQ Assay Design 軟件設計焦磷酸測序PCR 擴增引物(PL3-Pyro-F、PL3-Pyro-R、測序引物 PL3-Pyro-Seq)，引物由金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

表1 焦磷酸測序引物Table 1 Pyrosequencing primer

PCR擴增反應體系參照 Pyro Mark Q96 ID焦磷酸測序儀使用說明書進行設計。將野生型和基因編輯型水稻 DNA作為模板， PCR 擴增反應體系(50 μL)：2×PCR Master Mix 25 μL，PL3-Pyro-F 1 μL，PL3-Pyro-R 1 μL，DNA (25 ng·μL-1)2 μL， ddH2O 21 μL。PCR反應程序設置為：94℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50次循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。待PCR反應程序結束后使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的 PCR 產(chǎn)物質量，應出現(xiàn)條帶清晰且單一的目的條帶，在該試驗過程中同時加入一個空白樣品作為對照。將擴增完成的PCR產(chǎn)物放入4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 焦磷酸測序基因分型定性檢測

為保證本次試驗的準確性， Sepharose beads 在使用前要充分混勻，所有試驗試劑需提前 15 min放至室溫。具體操作步驟如下：①在96孔酶標板中加入47 μL Binding buffer 和3 μL Sepharose beads混勻后分別將電泳結束，剩余產(chǎn)物全部加入相應酶標板中，1 300 r·min-1混勻15 min；②將38.8 μL Annealing buffer 和1.2 μL測序引物加入測序反應板中，混合均勻備用；③酶標板中產(chǎn)物進行單鏈分離且釋放到測序板中，反應結束后將測序板置于金屬浴(80°C)反應2 min，冷卻后放入Pyro Mark Q96 ID焦磷酸測序儀中進行試驗；④選擇 SQA系統(tǒng)模式，將酶、底物混合物和4種dNTP(A、T、C、G )依次加入試劑艙，根據(jù)分析序列(5′-[A]CAATCCGTTGGCTTCAATTC-TCTTT-3′)和系統(tǒng)自動生成的噴入堿基順序(5′-GACATCG-3′)設置反應程序進行焦磷酸測序反應。

1.7 焦磷酸測序基因分型定量檢測

將基因編輯型和野生型水稻 DNA 模板(25 ng·μL-1)按表2的比例均勻混合成 8 個濃度梯度(S1～S8)，S1～S6 用于繪制不同分型的標準曲線，檢測焦磷酸測序定量分析的能力；通過 S7～S8 進行半定量檢測分析(盲樣)。參照 1.4 和 1.5 的方法步驟進行 PCR 擴增和焦磷酸測序檢測試驗。

表2 S1～S8焦磷酸測序模板體積比例Table 2 Volume ratio of S1～S8 pyrosequencing template (ng·μL-1)

2 結果與分析

2.1 PL3基因編輯水稻焦磷酸測序引物有效性檢測

本研究設計的擴增產(chǎn)物預期長度為129 bp，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所擴增的 PCR 目的片段大小與預期片段長度相一致。焦磷酸測序引物 PCR 擴增完成后(圖1)均出現(xiàn)清晰單一的特異性條帶，且對照(CK)未出現(xiàn)任何條帶。結果表明本試驗設計的焦磷酸測序引物有效性好,能夠滿足此次焦磷酸測序試驗要求。

2.2 焦磷酸測序基因分型定性檢測結果

通過 Sequence to Analyze、Dispensation order和Pyro Mark 程序獲得基因編輯型和野生型的焦磷酸測序結果(圖2A)：G堿基(第一位)是試驗反應程序中設置的陰性對照，其高度為零，作為此次試驗反應程序的陰性質控位點； A 堿基(第二位)為檢測靶標位點，根據(jù)圖2中峰值高度可分為3種類型，分別為 -/- (野生型水稻)、A/A (編輯型水稻)、 A/- (雜合類型)； A 堿基與 C 堿基(第三位)和 T 堿基(第五位)高度相同，而 A 堿基(第四位)和 C 堿基(第六位)高度是其2倍，這些為陽性質控位點。

以野生型水稻和編輯型水稻的 DNA 為模板對目的區(qū)域進行 PCR 擴增和焦磷酸測序反應檢測，使用系統(tǒng)中的 SNP 模式分析其測序結果發(fā)現(xiàn)可自動出現(xiàn)分型為“-/-”和“A/A”。同時在測序結果圖中看到所檢測的靶標位點序列，在野生型樣品中沒有 A 堿基(第二位)，而在編輯型水稻樣品中檢測到該堿基(圖2B～C)，表明該技術可以有效區(qū)分野生型水稻與PL3基因編輯型水稻樣品。

注：M—DL 2000 marker；CK—空白對照；1，2—基因編輯型水稻 PCR擴增產(chǎn)物；3，4—野生型水稻 PCR擴增產(chǎn)物圖1 焦磷酸測序引物 PCR 產(chǎn)物擴增電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of PCR products amplified by pyrosequencing primers

A：焦磷酸測序結果示意圖；B：基因編輯型水稻焦磷酸測序結果；C：野生型水稻焦磷酸測序結果圖2 PL3基因編輯型水稻和野生型水稻焦磷酸測序結果Fig.2 PL3 gene edited and wild type rice DNA template pyrosequencing results

2.3 焦磷酸測序基因分型定量檢測結果

通過 SNP 和等位基因頻率量化(allele frequencies quantification，AQ)兩種模式可對焦磷酸測序檢測結果進行有效檢測，并得到等位基因頻率和基因分型。本研究將2種水稻 DNA 按濃度梯度進行相應稀釋并混勻分析構建了PL3基因編輯水稻的分型標準曲線，對焦磷酸測序的定量分析能力進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)，當基因編輯型水稻模板濃度逐漸上升時，[A]堿基的峰高度會逐漸下降(圖 3A )；同時選擇系統(tǒng)的 AQ 模式對該測序結果進行定量分析發(fā)現(xiàn)，在S1～S6 樣品中該位點的 AQ 值會逐漸下降，平均值分別為97%、80%、48%、25%、16%、0；在S7～S8樣品中 AQ 值分別為66%、38%。發(fā)現(xiàn) AQ 值與編輯型水稻的 DNA 含量呈線性關系：斜率為 1.007(圖3B )。表明該方法可對PL3基因編輯型水稻進行有效的定量檢測。

圖3 野生型和基因編輯型水稻不同濃度梯度測序結果(A)和標準曲線圖(B)Fig.3 Sequencing results (A) and standard curve (B) of wild type and gene editing rice with different concentration gradients

3 討論

基因編輯技術是一種新興且較為精確的可對生物體基因組特定目的基因修飾的基因工程技術。 CRISPR/Cas9 技術是目前進展最迅速的基因編輯技術，可對特定的 DNA 進行靶向切割，導致目的基因發(fā)生定點突變。 CRISPR/Cas9 技術已在水稻、小麥、玉米三大作物上實現(xiàn)了高效精確的單堿基定點突變[13-15]。目前檢測基因編輯位點主要使用 Sanger法測序，但該方法耗時且不適于進行大規(guī)模檢測，其他關于植物基因組編輯的檢測方法主要有 PCR/RE 法、錯配切割法、TaqMan 法等，但這些方法操作復雜、要求高且適用性有限，不能廣泛應用[16]。

焦磷酸測序是一種酶聯(lián)級聯(lián)測序技術，能夠對已知短序列的測序分析進行檢測。該方法操作簡單，可鑒定多種植物的病原微生物和成分。劉洪義等[17]通過焦磷酸測序法進行短序列測序分析，用來鑒定馬鈴薯感染的PVY株系。金瑩等[12]利用焦磷酸測序技術能夠有效檢測大豆過敏原成分。

在本研究中使用焦磷酸測序技術的兩種分析模式進行基因定性和定量檢測，發(fā)現(xiàn)該研究方法具有極高的準確性，操作簡便，效率高，同時可檢測大量樣品。本研究在基因分型定性試驗中對焦磷酸測序結果進行定性分析，發(fā)現(xiàn)陰性質控位點未出現(xiàn)峰，且陽性質控位點與系統(tǒng)生成峰高度保持一致；在基因分型定量試驗中對該檢測結果進行定量分析，發(fā)現(xiàn) AQ 值會隨編輯型模板含量的增加而升高。該方法可用來有效區(qū)分PL3基因編輯型水稻和野生型水稻。基于焦磷酸測序技術的基因編輯方法有望用于基因編輯產(chǎn)品檢測監(jiān)管。