繆青梅,趙楊,徐曉麗,徐俊鋒,汪小福,陳笑蕓*

1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所， 杭州 310021； 2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 杭州 310058

近年來，隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物種植面積和轉(zhuǎn)基因作物品種都大幅增加。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)發(fā)布的2018年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展態(tài)勢報告，2018年全球共有26個國家或地區(qū)批準了轉(zhuǎn)基因作物的種植，44個國家或地區(qū)批準了轉(zhuǎn)基因作物作為加工原料進口，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達1.917億hm2[1]。轉(zhuǎn)基因大豆作為最主要的轉(zhuǎn)基因作物，全球種植面積達9 590萬hm2，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%[2]。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，全球已有60多個國家或地區(qū)相繼實施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標識閾值管理，其中，歐盟將轉(zhuǎn)基因成分標識閾值設(shè)定為0.9%，日本設(shè)為5%，韓國設(shè)為3%[3-4]。我國自2001年起也先后頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，明確規(guī)定了我國對所有的轉(zhuǎn)基因食品實行零容忍定性標識管理制度。因此，轉(zhuǎn)基因安全管理實施定量標識和閾值管理是發(fā)展的必然趨勢[5]。而建立快速、精準的轉(zhuǎn)基因定量檢測方法體系可以為實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識閾值管理制度、規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品銷售行為、保護消費者的知情權(quán)、加強農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持。

PCR技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、準確性強、操作簡便的優(yōu)勢，是國際上轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測的主要方法。特別是實時熒光定量PCR技術(shù)，因具有更高的靈敏度、更強的特異性和準確性、檢測過程耗時短且能實現(xiàn)高度自動化等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的檢測[6]。目前針對大豆、水稻、玉米等作物的特定轉(zhuǎn)基因品系的實時熒光定量PCR檢測方法已陸續(xù)研發(fā)成功[7-12]。

轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆ZUTS-33是由浙江大學(xué)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化栽培大豆華春3號獲得的，ZUTS-33可產(chǎn)生G10-EPSPS蛋白，對草甘膦高抗，可以滿足大豆種植者對田間雜草的有效防治，具有較好的農(nóng)藝性狀和商業(yè)化潛力[13]。但到目前為止，尚未發(fā)布專門針對轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體及其衍生品種的檢測方法。本研究以轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33為研究對象，設(shè)計轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33的轉(zhuǎn)化體特異性檢測引物和TaqMan探針，利用優(yōu)化的實時熒光定量PCR檢測方法評價該引物對和探針的特異性、準確度、精確度和重復(fù)性，并確定此檢測方法的檢測極限(limit of detection，LOD)和定量極限(limit of quantity，LOQ)，以期建立轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33品系的檢測鑒定方法，為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗材料 試驗所用轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33及其受體材料由浙江大學(xué)提供；其他轉(zhuǎn)基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON88302、73496、MON87769、MON87705、FG72、DAS68416-4、SHZD32-1)，轉(zhuǎn)基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、雙抗12-5、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307)，轉(zhuǎn)基因棉花混合物(MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102)，轉(zhuǎn)基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、OXY235、Topas19/2、MON88302、73496)，轉(zhuǎn)基因水稻混合物(TT51-1、科豐6號、克螟稻、M12、科豐8號、科豐2號、G6H1、T1C-19)陽性材料購置于深圳卓越生物科技有限公司和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心；其他非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、棉花等材料由本實驗室自備。

1.1.2主要試劑 TaqMan Fast Advanced Master Mix預(yù)混液購自美國Thermo Fisher公司；植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3主要儀器 CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司；NanoDrop 2000C核酸蛋白測定儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 DNA 提取與純化

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取并純化所有材料的基因組DNA，具體步驟按照試劑盒使用說明書操作。獲得的基因組DNA用NanoDrop 2000C核酸蛋白測定儀進行核酸質(zhì)量分析。為符合進一步檢測的要求，所有材料基因組DNA OD260/OD280在1.7～2.0之間，濃度在30～70 ng·μL-1之間，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實時熒光定量PCR方法建立

1.3.1引物和探針設(shè)計 根據(jù)轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33左右邊界側(cè)翼序列信息[13]，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計轉(zhuǎn)化體特異性引物和探針。轉(zhuǎn)化體特異性探針5′端修飾基團為6-羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM)，3′端為黑洞淬滅基團(BHQ1),內(nèi)源基因為編碼大豆凝集素的基因Lectin基因，引物探針引用歐盟CRLVL08/05VR[14]中的序列，具體信息見表1。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes used in this study

1.3.2引物探針適用性測試 以質(zhì)量分數(shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA為模板，采用通用的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序進行擴增。反應(yīng)體系為：2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.0 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL，25 mg·L-1DNA 2.0 μL，補水至25 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸 1 min(在此階段收集熒光信號)，共40個循環(huán)。根據(jù)熒光曲線的線性、相對Ct值等因素，確定引物和探針組合。

1.3.3實時熒光定量PCR方法反應(yīng)體系優(yōu)化 為獲得最優(yōu)的引物和探針反應(yīng)濃度，將探針的濃度設(shè)置為0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 μmol·L-16個探針濃度梯度，對應(yīng)的引物濃度為探針濃度的2倍，采用通用的實時熒光定量PCR反應(yīng)程序進行擴增。根據(jù)熒光曲線的線性、相對Ct值等因素，確定體系中引物和探針的最優(yōu)濃度。

1.4 實驗室內(nèi)方法確認

1.4.1檢測方法特異性 選用質(zhì)量分數(shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33、62種不同的主要商業(yè)化轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33陰性對照(即受體)、其他非轉(zhuǎn)基因大豆作為測試對象，對1.3中建立的耐除草劑大豆ZUTS-33實時熒光PCR方法進行特異性測試，以驗證候選引物和探針組合是否僅在陽性樣品中獲得預(yù)期的擴增。

1.4.2標準曲線繪制 根據(jù)EURL[15]對實時熒光定量PCR標準回歸曲線的各項參數(shù)的詳細規(guī)定，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，擴增效率E[Efficiency=10(-1/slope)-1]的范圍為90%～110%，斜率(slope)范圍為-3.1～-3.6。提取質(zhì)量分數(shù)為100%的ZUTS-33大豆樣品的DNA，將基因組DNA(25 ng·μL-1)按6倍濃度梯度依次進行稀釋，配制成了5個含量的標準樣品，依次為22 422、3 737、623、104、17 copies·μL-1。采用1.3中建立的最優(yōu)體系和通用反應(yīng)程序進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，每個PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行，重復(fù)3次實驗。根據(jù)標準DNA溶液PCR反應(yīng)的Ct值及初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)繪制ZUTS-33的標準曲線。根據(jù)標準曲線的各項參數(shù)(R2、效率E、斜率)確認方法是否符合要求。

1.4.3準確度、精確度和重復(fù)性評價 將研磨好的轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33品系大豆和其受體材料(非轉(zhuǎn)基因大豆)按照質(zhì)量百分比進行混合，配制了3個不同轉(zhuǎn)基因百分含量的樣品，質(zhì)量分數(shù)分別為5.0%、1.0%和0.5%。采用1.3中建立的最優(yōu)體系和通用反應(yīng)程序進行內(nèi)標準基因Lectin和轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測。每次設(shè)3個平行，重復(fù)3次實驗，計算多次測試的偏差(Bias)和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，評價測試方法的準確度和精確度。

1.4.4檢測極限和定量極限確定 根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 實時熒光定量PCR方法制定指南》(農(nóng)業(yè)部2259號公告-5-2015)的規(guī)定，轉(zhuǎn)基因檢測方法的檢測極限(limit of detection，LOD)應(yīng)不高于目標濃度的1/20，定量極限(limit of quantity，LOQ)應(yīng)不高于目標濃度的1/10。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，我國目前對轉(zhuǎn)基因食品實行強制標識管理制度，只要食品中檢出轉(zhuǎn)基因成分就需進行標識，并未設(shè)定閾值[15]。本研究設(shè)定的目標濃度參考歐盟閾值0.9%，因此，檢測極限LOD≤0.045%(相當于50 ng DNA模板中含有約20拷貝的ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列)，定量極限LOQ≥0.09%(相當于50 ng DNA模板中含有約40拷貝的ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列)。

本研究設(shè)置了反應(yīng)體系中含有20拷貝和10拷貝2種ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列對方法LOD進行測試，設(shè)置了40拷貝和20拷貝2種ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列對方法LOQ進行測試，以確定方法的LOD和LOQ。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針適用性測試

為了獲得擴增效果最好的引物和探針，以質(zhì)量分數(shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA為模板進行適用性測試。測試結(jié)果(圖1)表明，4組引物探針組合擴增Ct值無明顯差異，但組合A擴增曲線上升幅度最大，線型最好，即引物探針組合ZUTS-33-LB-qF/qR/P(以下文中定名為ZUTS-33-qF/qR/P)的擴增效果最好。因此，選擇ZUTS-33-qF/qR/P作為候選的實時熒光定量PCR引物進行進一步測試。

圖1 實時熒光PCR引物的適用性測試Fig.1 Suitability test of real-time PCR primers

2.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

為了獲得最優(yōu)的反應(yīng)體系，本研究對反應(yīng)體系中引物和探針設(shè)置了不同的濃度進行測試。結(jié)果表明(圖2)，隨著引物和探針濃度的增加，擴增曲線呈現(xiàn)上升的趨勢，Ct值逐漸減小，0.20 μmol·L-1及以上濃度的Ct值無明顯差異。當反應(yīng)體系中探針濃度為0.10 μmol·L-1時，Ct值約為33，當反應(yīng)體系中探針濃度為0.20 μmol·L-1及以上時，Ct值約為32?？紤]內(nèi)源基因擴增反應(yīng)體系，最終確定檢測的引物濃度為0.40 μmol·L-1，探針濃度為0.20 μmol·L-1。反應(yīng)體系確定為：2×Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.0 μL，10 μmol·L-1探針0.5 μL，25 mg·L-1DNA 2.0 μL，補水至25 μL。

圖2 實時熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化Fig.2 Optimization of the real-time PCR systems

2.3 特異性測試

為了驗證適應(yīng)性試驗篩選出的候選引物和探針組合是否僅在陽性材料中獲得預(yù)期的擴增，采用質(zhì)量分數(shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33、62種不同的主要商業(yè)化轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33陰性對照(即受體)、其他非轉(zhuǎn)基因大豆作為測試對象，進行了特異性試驗。測試結(jié)果(圖3)顯示，僅耐除草劑大豆ZUTS-33獲得了典型的擴增曲線，其余轉(zhuǎn)化體及ZUTS-33陰性對照、其他非轉(zhuǎn)基因大豆均未出現(xiàn)擴增，表明建立的實時熒光PCR方法具有高度的特異性。

圖3 ZUTS-33轉(zhuǎn)化體檢測方法特異性測試Fig.3 Specificity test of the detection method on the ZUTS-33 transformant

2.4 標準曲線繪制

將質(zhì)量分數(shù)為100%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA進行梯度稀釋，以獲得的5個濃度的基因組DNA為模板，利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和通用反應(yīng)程序進行實時熒光定量PCR，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33品系特異性序列的標準曲線。3次重復(fù)實驗中ZUTS-33檢測反應(yīng)標準曲線的回歸系數(shù)R2、效率E、斜率、截距等所有指標全部滿足了轉(zhuǎn)基因定量檢測的要求[17](圖4)。表明ZUTS-33檢測體系的Ct值與模板拷貝數(shù)間均具有良好的線性關(guān)系。

圖4 ZUTS-33檢測方法標準曲線Fig.4 Standard curves of the ZUTS-33 detection method

2.5 準確度、精確度和重復(fù)性測試

為了驗證建立的檢測方法是否具有良好的準確度、精確度和重復(fù)性，利用預(yù)期轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分數(shù)為5.0%、1.0%、0.5%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33材料基因組DNA對內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)化體特異性序列進行擴增，計算多次測試的偏差(Bias)和相對標準偏差(RSD)以評估檢測方法的準確度、精確度和重復(fù)性。3次重復(fù)測試結(jié)果(表2)顯示3個濃度的偏差(Bias)均小于25%，相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)均小于25%，說明ZUTS-33檢測方法的準確度與精確度均符合檢測的要求，重復(fù)性較好。

表2 ZUTS-33檢測方法準確度和精確度測試Table 2 Accuracy and precision test of ZUTS-33 detection method

2.6 檢測極限和定量極限測試

2.6.1LOD測試 為了確定本研究建立的檢測方法的LOD，分別設(shè)置反應(yīng)體系中含20拷貝和10拷貝2種轉(zhuǎn)化體特異性序列對方法LOD進行60個平行測試。測試結(jié)果(圖5)顯示，反應(yīng)體系中2種目標濃度60個平行反應(yīng)均有擴增信號。為有更好的適應(yīng)性，本方法LOD設(shè)定為20拷貝。

圖5 ZUTS-33 LOD測試擴增曲線Fig.5 ZUTS-33 LOD tested the amplification curve

2.6.2LOQ測試 為了確定本研究建立的檢測方法的LOQ，分別設(shè)置反應(yīng)體系中含40拷貝和20拷貝2種轉(zhuǎn)化體特異性序列對方法LOQ進行15個平行測試。LOQ測試結(jié)果見表3。當反應(yīng)體系中含有20拷貝ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列(相當于ZUTS-33含量為0.045%)時，15次測試結(jié)果的偏差為2.0%，小于25%；RSD為18.3%，小于25%。當DNA模板中含有40拷貝ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列(相當于ZUTS-33含量為0.09%)時，15次測試結(jié)果的偏差為7.8%，小于25%；RSD為10.6%，小于25%。因此，由實驗室內(nèi)的驗證估測本檢測方法的LOQ不高于20拷貝，為了有更好的適應(yīng)性，本方法LOQ設(shè)定為40拷貝。

表3 ZUTS-33檢測方法LOQ測試Table 3 ZUTS-33 detection method LOQ test

3 討論

目前中國已經(jīng)批準了12種轉(zhuǎn)基因大豆品系(A2704-12、DP356043、DP305423、GTS40-3-2、A5547-127、MON87705、MON89788、MON87751、DAS44406-6、DAS-81419-2、305323× GTS40-3-2、SYHT0H2)作為加工原料進口。為了規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，正確引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的消費，保護消費者的知情權(quán)，建立準確、快速、高效的轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)十分重要[18-19]。2019年上海交通大學(xué)的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書[農(nóng)基安證字(2019)第293號]，目前浙江大學(xué)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆品系ZUTS-33也進入生產(chǎn)性試驗。但到目前為止尚未發(fā)布針對該轉(zhuǎn)化體的檢測方法。

轉(zhuǎn)基因成分實行閾值標識管理需要相應(yīng)的精準定量檢測技術(shù)支持，目前，實時熒光定量PCR法被國內(nèi)外用作對轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的“金標準”。本研究基于實時熒光PCR法，首先在轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33外源基因插入位點旁側(cè)序列設(shè)計引物和探針并對引物和探針的適用性進行確認，然后對獲得的候選引物和探針進行條件優(yōu)化，最后對建立的方法從特異性、準確度和精確度等方面進行確認。研究結(jié)果表明建立的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性實時熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性、準確性、穩(wěn)定性，方法的LOD為20拷貝，LOQ為40拷貝。

本研究建立的轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33定量檢測方法可為耐除草劑大豆ZUTS-33大豆及其衍生產(chǎn)品的精準檢測、標準制定、標準物質(zhì)和試劑盒等衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持。然而，實時熒光定量PCR作為一種相對定量方法也有其局限性，在定量過程中需要依賴標準品建立標準曲線來達到對未知樣品的相對定量。數(shù)字PCR作為一種核酸絕對定量技術(shù)，它最大的特點是無需借助標準物質(zhì)構(gòu)建標準曲線來實現(xiàn)定量目的，可以有效地解決實時熒光定量PCR法的局限性。本研究開發(fā)的引物和探針具有良好的適用性和特異性，為開發(fā)數(shù)字PCR定量檢測方法提供了研究基礎(chǔ)。