鄭子繁,劉衛(wèi)曉,金蕪軍,李亮

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所， 北京 100081

為保證不同地區(qū)、不同時間測量結果的可比性，測量結果需溯源至適當?shù)?、?guī)定的參考標準，而標準物質(zhì)就是化學、生物、工程、物理學等領域材料和樣品測量的參考標準[1]。標準物質(zhì)是一種足夠均勻的、具有一種或多種相對容易確定的特性值的材料或物質(zhì)，在評價測量方法、給材料賦值及校準儀器方面有廣泛的用處。如在有機化學方面，有機標準物質(zhì)化學純度定值技術是賦予標準物質(zhì)準確量值的關鍵。有機標準物質(zhì)種類繁多，在進行研制時，需根據(jù)不同樣品的化學性質(zhì)選擇合適的測量方法[2]。近年來，生物標準物質(zhì)研制逐漸成為熱點領域，包括醫(yī)療領域的分子診斷、農(nóng)業(yè)領域的轉(zhuǎn)基因成分[3]和動植物疫病檢測、食品領域摻假與微生物超標，使得新型的標準物質(zhì)迅速發(fā)展。標準物質(zhì)定值方法中，最權威的是基準方法?；鶞史椒?primary method)是一種具有最高計量學特性的測量方法，其可以被完全地操作和理解，最終不確定度可以用國際單位制(SI)表述，基準方法的溯源流程見圖1[4]。

圖1 基準方法溯源圖[4]Fig.1 Benchmark method traceability graph[4]

質(zhì)量平衡法也為新型生物類標準物質(zhì)研制提供了可能。它是一種常用的純度測量方法，對樣品中雜質(zhì)進行分析后，將其中的各組分(如水分、灰分、有機雜質(zhì)等)分別定量出來，之后從總量的100%中將其扣除，最后剩下的就是樣品的純度[5]。盡管質(zhì)量平衡法在每個雜質(zhì)進行定性、定量分析時的工作量十分龐大，但測定過程中并不需要待測樣品的標準物質(zhì)，且結果穩(wěn)定性好，測量結果也比其他方法更加精確[5]。質(zhì)量平衡法目前在化工、冶金、環(huán)境、醫(yī)學、地質(zhì)等方面的標準物質(zhì)研制都有著廣泛的應用[6-8]。若在各部分測量中都使用了基準測量方法推薦的方法，質(zhì)量平衡法則有望成為一種基準方法。基于此，對質(zhì)量平衡法原理及質(zhì)量平衡法在標準物質(zhì)的研制中的應用進行介紹，并對近期質(zhì)量平衡法在標準物質(zhì)中的最新應用進行總結，以期探索質(zhì)量平衡法在標準物質(zhì)研制中的更多可能。

1 質(zhì)量平衡法介紹

質(zhì)量平衡法(mass balance)是一種綜合方法，通過應用多種分析技術進行雜質(zhì)的分析。從質(zhì)量分數(shù)為100%的原樣品中減去可檢測的雜質(zhì)含量，即可獲得主成分的純度(質(zhì)量分數(shù))[4]。其計算公式如下:

純度=[100%-w(n)]×[100%-w(s)-w(a)-w(m)]×100%[9]

式中，w(n)—非揮發(fā)性雜質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，w(s)—溶劑殘留的質(zhì)量分數(shù)，w(a)—灰分的質(zhì)量分數(shù)，w(m)—水分的質(zhì)量分數(shù)。

質(zhì)量平衡法主要分為兩個部分，第一部分是稱量出總的質(zhì)量，第二部分則是分析出樣品中的各種雜質(zhì)，包括非揮發(fā)性雜質(zhì)(有機雜質(zhì))、水分、揮發(fā)性溶劑和灼燒殘渣(無機離子)的含量，最后從總物質(zhì)量中減去這些的雜質(zhì)的含量即可得出該物質(zhì)的含量。質(zhì)量平衡法通常被認為是一種具有較高準確度的方法，其能夠直接溯源到SI中質(zhì)量單位(kg)，世界衛(wèi)生組織及歐洲藥典推薦質(zhì)量平衡法為藥品標準物質(zhì)定值方法[5]。

2 質(zhì)量平衡法中的常用分析技術

各部分雜質(zhì)的測量在方法的選擇上需要根據(jù)被測物質(zhì)的性質(zhì)決定。其中，常見的水分檢測是利用卡爾費休水分滴定法；灰分(指樣品中的固體無機成分)含量常用高溫灼燒得到的殘渣質(zhì)量進行分析；非揮發(fā)的液體有機物可以用高效液相色譜法分離；揮發(fā)性有機試劑和醇類等殘留溶劑的含量可以采用頂空氣相色譜法，當程序升溫達到不同的沸點時，不同的組分會在對應的保留時間處被檢測到；無機元素殘留可以用電感耦合等離子質(zhì)譜法檢測，且該方法可以同時檢測出多種無機離子，是質(zhì)量平衡法中測量無機元素最常用的方法。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)又稱“高壓液相色譜”“高分離度液相色譜”等，是色譜法的一個重要分支。高效液相色譜的原理是以液體為流動相，用高壓輸液系統(tǒng)將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱[10]。流動相的各成分在柱內(nèi)被分離后即可進入檢測器進行檢測，從而對試樣進行分析。高效液相色譜法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術[9]。

2.2 頂空分析法

頂空分析(headspace analysis)技術可用于檢測產(chǎn)生于分析固體或液體頂部蒸氣相中的有機揮發(fā)性物質(zhì)，最早報道可追溯到1939年Harger等[11]對水相中醇含量的測定。氣相色譜法如何進行樣品的制備和采用何種有效的進樣方法一直是氣相色譜成功分析的關鍵因素。氣相色譜適用于分析揮發(fā)性和半揮發(fā)性的化合物，因此頂空分析既可以是一種可以單獨處理樣品的技術，也能夠與氣相色譜聯(lián)用。與液-液萃取和固相萃取方法相比，頂空分析能專一地收集樣品中易揮發(fā)的成分，這樣可降低共提取物所引起的干擾，并規(guī)避在除去溶劑時引起揮發(fā)性物質(zhì)的損失，這使頂空分析方法在對樣品中微量的有機揮發(fā)性物質(zhì)分析時比溶劑提取方法更為靈敏，分析速度更快[12]?，F(xiàn)代頂空分析法已經(jīng)形成了一個相對完善的分析體系，主要可分為3類：靜態(tài)頂空分析(static headspace analysis)、動態(tài)頂空分析(dynamic headspace analysis or purge and trap analysis)、頂空-固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction analysis)[13]。

2.3 卡爾費休法

水分的測定方法有多種，卡爾費休水分滴定法(Karl-Fischer)是其中的一種。與傳統(tǒng)方法(如灼燒法)相比，卡爾費休水分滴定法操作更為簡單，自動化程度高，測試結果較為可靠，因此得到了較為廣泛的應用。卡爾費休水分滴定法在操作、準確性、精度、速度等方面都有著相當?shù)膬?yōu)勢。

卡爾費休試劑是由I2、SO2、吡啶和甲醇組成的溶液?？栙M休水分滴定法的原理是，樣品中的游離水和結晶水都可與已知滴定度的卡爾費休試劑進行定量反應[14]。樣品在裝有滴定溶劑的反應器內(nèi)用卡爾費休標準溶液進行滴定，雙鉑電極能夠自動檢測終點，根據(jù)消耗的標準溶液的體積，儀器自動計算出樣品中的水分含量[15]。卡爾費休反應的方程式為：

H2O+I2+SO2+CH3OH+3RN→(RNH)SO4CH3+2(RNH)I

從反應式中可以得出，甲醇是溶劑的同時還直接參與了反應。吡啶僅作為緩沖劑，并沒有直接參與反應[16]。

卡爾費休法可分為容量滴定法和庫侖滴定法。當樣品水分含量在小于或等于500 mg·kg-1(0.05%)的情況下，使用庫侖滴定法的測量可使結果更為準確[17]。使用卡爾費休庫倫滴定儀測量樣品中水分測定公式為[18]：

Pwater=

式中，ICEQ是總消耗電荷，將其轉(zhuǎn)換為總檢測出的水質(zhì)量(單位：μg)；時間是以min為單位的KF庫侖測量總時間；Drift(單位:μg·min-1)是在分析之前由KF庫侖滴定儀測量的系統(tǒng)水含量；Blank(單位:μg)是測得的系統(tǒng)空白；m是用于KF庫侖分析的樣品重量(單位：g)；C是將μg·g-1單位轉(zhuǎn)換為kg·kg-1的常數(shù)1×106。

2.4 電感耦合等離子質(zhì)譜法

1983年第一臺電感耦合等離子質(zhì)譜儀問世，此后，電感耦合等離子質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)得到了迅速的發(fā)展，在地質(zhì)、生物、冶金、化工、環(huán)境、醫(yī)學等方面都有著廣泛的應用。ICP-MS可用于痕量元素的測定、同位素比對、形態(tài)分析等方面[19]。

ICP-MS分析技術是一種無機微量及痕量元素分析技術，其可進行多元素同時分析，其測試結果受到的干擾少、精密度高、線性范圍寬、簡便快速，檢出限一般比等離子體發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES)低2～3個數(shù)量級[20]。ICP-MS在無機元素分析中有著諸多應用，如醫(yī)藥類多種微量元素測定、生物樣品中微量元素的檢測、地質(zhì)樣品中微量元素的測定等[15]，且ICP-MS已被2010年版中國藥典收載于附錄項下[21]。表1對上述4種方法的特性和適用范圍進行了總結。

表1 常用方法特性分析Table 1 Characteristic analysis of common methods

3 測量不確定度評定模式

測量不確定度是一個統(tǒng)計參數(shù)，它描述了測量結果的可能波動[22]。測量不確定度可以說是與測量結果相“綁定”的。在實驗室的各項研發(fā)中(如化學、醫(yī)療行業(yè)等)，實驗的結果往往需要在多個實驗室間進行傳遞比對。如果沒有測量不確定度，實驗結果就沒有一個范圍作為標準，將難以進行比對。不確定度是將來自各部分儀器、試劑、重復性等方面的不確定性進行了量值和計算，最后得到一個的區(qū)間。理論上測量不確定度應該是穩(wěn)定且較低的值，但不宜過低。在質(zhì)量平衡法中，測量不確定度需要統(tǒng)計測量各組分時使用儀器的不確定度以及所用試劑的不確定度，最終得到一個合成不確定度。

質(zhì)量平衡法的不確定度uMB計算公式如下[23]:

uMB=urel(P)=

式中，urel(P0)表示液相色譜法的相對不確定度；u(XW) 表示水分測定的不確定度；urel(P)表示純度結果的相對不確定度；u(Xa) 表示灰分測定的不確定度；u(XV) 表示揮發(fā)性物質(zhì)測定的不確定度；u(Xe) 表示無機元素測定的不確定度。

3.1 不確定度來源

根據(jù)實驗方法，測量各部分雜質(zhì)的過程中均可能產(chǎn)生不確定度，如液相色譜、天平、測量的重復性和均勻性等，大致如圖2所示。

圖2 溶液標準物質(zhì)定值不確定度來源分析及評定流程圖[24] Fig.2 Source analysis and evaluation flow chart of uncertainty of fixed value of solution reference materia[24]

3.2 質(zhì)量平衡法中各雜質(zhì)組分的測量不確定度評定

在計量測試領域，廣泛采用測量不確定度來定量地表示測量結果的質(zhì)量。根據(jù)《測量不確定度表示指南》(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM)的規(guī)定，不確定度的表示方法有：用測量結果的標準差表示的不確定度即標準不確定度，以及用標準差的倍數(shù)或說明了置信水平的區(qū)間半寬度來表示的不確定度即擴展不確定度[25]。本文對質(zhì)量平衡法中常用的雜質(zhì)測量方式的不確定度評定進行了總結，如表2所示。

表2 常用不確定度公式小結Table 2 Summary of commonly used uncertainty formulas

4 質(zhì)量平衡法在標準物質(zhì)中的應用

4.1 有機化學標準物質(zhì)

有機標準物質(zhì)作為參考標準廣泛應用于色譜分析領域，有機標準物質(zhì)化學純度定值技術對賦予標準物質(zhì)準確量值是十分重要的。質(zhì)量平衡法可用于有機標準物質(zhì)的定值，如在對1,2,3,4-四氯苯標準物質(zhì)純度定值中，使用了質(zhì)量平衡法對多種雜質(zhì)進行稱量[5]。其中，使用的氣相色譜用氫火焰離子檢測器(gas chromatography with hydrogen flame ionization detection，GC-FID)確定雜質(zhì)成分；用標準添加方式確認非揮發(fā)性雜質(zhì)為1,2,3,5-四氯苯，并用氣相色譜用電子俘獲檢測器(gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD)對其進行準確定量。溶劑殘留部分最終確定為乙醚，使用頂空GC-MS來分析，并用GC-FID對其準確定量。用庫侖法水分測量儀測量水分含量，通過對比灼燒前后樣品質(zhì)量差異測量灰分含量。最后獲得了1,2,3,4-四氯苯標準物質(zhì)[5]。1,2,3,4-四氯苯是現(xiàn)如今使用氯化方式凈化飲用水過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，氯苯化合物在化工企業(yè)中有著廣泛的使用，能通過多種途徑進入環(huán)境，對水體、土壤以及空氣造成嚴重污染，進而危害到人體。因此，1,2,3,4-四氯苯標準物質(zhì)的研制有著重要的現(xiàn)實意義[5]。

4.2 食品安全標準物質(zhì)

食品安全檢測是保證食品安全和貿(mào)易、食品產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、促進食品科學發(fā)展的基石。在食品標準物質(zhì)的研制中，質(zhì)量平衡法也是常用的研制方法。雙氰胺(dicyanodiamide，DCD)別名二氰二胺、氰基胍、二聚氰胺。雙氰胺復合肥料使用廣泛，在牧場中的過量使用，雙氰胺可能會積聚在牧草中，等奶牛攝食牧草后，雙氰胺最終會進入奶制品，危害人體健康；類似于三聚氰胺，雙氰胺也可能被添加到奶源中，提高奶制品中可被檢測到的氮元素含量[31]。在雙氰胺的標準物質(zhì)研制中，使用卡爾費休水分滴定儀對水分進行測定，使用電感耦合等離子質(zhì)譜法測量無機離子含量，揮發(fā)性溶劑的測量則采用頂空氣相色譜-質(zhì)譜方法[31]。雙氰胺標準物質(zhì)的研制對于食品安全檢測溯源體系的建立提供了技術支撐和物質(zhì)保證。

4.3 臨床及藥學相關標準物質(zhì)

藥品標準物質(zhì)是藥品質(zhì)量分析中使用的實物對照，也是藥品檢驗不可缺少的物質(zhì)。國家藥品標準物質(zhì)指供藥品質(zhì)量標準中理化測試及生物方法試驗用，具有確定特性，用以校準設備、評價測量方法或給供試藥品定性或賦值的物質(zhì)。川皮苷又名蜜橘黃素、川皮亭、川陳皮素，是一種白色結晶性粉末，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領域有廣泛應用。在川皮苷(nobiletin)的標準物質(zhì)研制中，用到了定量核磁法和質(zhì)量平衡法共同定值的方式。使用了卡爾費休水分滴定法測量水分；電感耦合等離子質(zhì)譜法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測量無機離子；頂空氣相色譜法測定揮發(fā)性雜質(zhì)含量；HPLC-UV法測定川皮苷主成分。研制川皮苷等類黃酮純度標準物質(zhì)，可在相關柑橘產(chǎn)品溯源與真實性檢測、保健品、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控上起到重要作用[32]。

再如，醋酸氫化可的松的標準物質(zhì)研制中也用到了質(zhì)量平衡法。醋酸氫化可的松的化學名稱是11β,17α,21三羥基孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯，分子式為C23H32O6，是一種重要的糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)。但若是長期使用這種物質(zhì)，通過皮膚的吸收可引起全身的副作用，導致色素沉積、產(chǎn)生黑斑、皮膚萎縮變薄，甚至具有致癌性。實驗采用頂空進樣-氣相色譜法測定待測樣品中的溶劑殘留含量；卡爾·費休庫倫法測定樣品中的水分含量；用熱重分析法測量灰分含量。醋酸氫化可的松標準物質(zhì)的研制能在檢測偽劣化妝品中起到重要作用[8]。

5 展望

本文總結了質(zhì)量平衡法在標準物質(zhì)研制中的常用方法和在不同領域中的應用，以及雜質(zhì)分析、均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察等方面的不確定度評定。標準物質(zhì)對于檢測含量、監(jiān)管質(zhì)量、保障人民健康等方面有著重要的作用，而質(zhì)量平衡法在諸多領域的標準物質(zhì)研究中有著普遍的應用，如化學、臨床、冶金、環(huán)境等等?，F(xiàn)如今，質(zhì)量平衡法在化學領域的應用越發(fā)成熟，除了常用的測量雜質(zhì)方式之外，若能使用基準測量方法規(guī)定的方法，如同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)、庫倫法、重量法、滴定法、凝固點下降法等，這些方法為基于SI基本量進行的直接測量方法，或依據(jù)物理、化學理論建立起的可間接溯源到SI基本量的測量方法，較其他方法更有溯源優(yōu)勢，質(zhì)量平衡法的準確度理論上可以更上一級。但是在生物成分分析等領域，質(zhì)量平衡法的使用還較少。近期在肽段純度的測量方面已采用了該技術體系[33]。將質(zhì)量平衡法應用到生物相關的標準物質(zhì)研制中，有望提升標準物質(zhì)研制的定量與測量不確定度評定水平。