高佳奇,陳碩,王迪,龍艷,李亮*,張曉*

1.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長春 130022； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 北京 100081

玉米、大豆、水稻、油菜、棉花和小麥?zhǔn)侨粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚募Z食與經(jīng)濟作物，由于轉(zhuǎn)基因作物的上市和推廣，其安全性問題受到廣泛關(guān)注[1-2]。隨著來自轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)品和成分進入食品市場，信息對等和透明度對于消費者接受這些新產(chǎn)品至關(guān)重要，這一問題的一個關(guān)鍵因素是能否找到區(qū)分轉(zhuǎn)基因食品和傳統(tǒng)食品的方法。

在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品檢測方面，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因具有區(qū)分不同作物的分子特征。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是指能夠區(qū)分物種的特異性、具有單一或恒定的低拷貝數(shù)、低變異的保守DNA序列[3]。指定作物種類的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在轉(zhuǎn)基因成分檢測、物種及其產(chǎn)品判別等眾多領(lǐng)域內(nèi)作為鑒別其他物種的遺傳標(biāo)志。種間特異性指的是內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的物種特異性，指定物種與其他物種可通過內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的物種特異性區(qū)分出來；種內(nèi)非特異性指的是在同一物種的不同栽培品種中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擁有較高的同源性和相似性[4]。在轉(zhuǎn)基因定量檢測中，若要計算出樣品的轉(zhuǎn)基因含量、獲得外源目的基因和樣品基因組DNA的質(zhì)量或拷貝數(shù)，則需對內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源目的基因進行擴增[4]。樣品中植物成分來源的精準(zhǔn)判斷可通過建立內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的PCR系統(tǒng)進行檢測，為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)[5]。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因作為轉(zhuǎn)基因成分的絕對定量檢測的關(guān)鍵要素，其擴增效果受引物探針的靈敏度和目標(biāo)檢測物質(zhì)拷貝數(shù)的影響。

對于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的篩選，首先要對候選基因進行生物信息學(xué)分析，其次通過實驗進行驗證，最后選擇合適的具有種間特異性的基因作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。一種理想的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因應(yīng)具有3個特征：物種特異性，基因組中單拷貝數(shù)或拷貝數(shù)低以及不同品系之間的異質(zhì)性低[6]。其中，低異質(zhì)性通常取決于目標(biāo)DNA序列中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的最小數(shù)量以及不同品系之間的高PCR擴增性能[7-8]?；旌蠘悠分械霓D(zhuǎn)基因作物含量、轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的源性成分、實驗系統(tǒng)的真實性和穩(wěn)定性均需通過內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因來檢驗[9]。因此，選擇可靠的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)τ讷@得可靠的結(jié)果至關(guān)重要，理想的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有望在不同條件(如植物發(fā)育階段和組織類型)下呈現(xiàn)恒定的表達(dá)水平，且其表達(dá)應(yīng)不受實驗參數(shù)的影響?；诖耍鶕?jù)國內(nèi)外已有的研究成果，本文綜述了6種檢測或鑒定需求較大的作物(包括玉米、大豆、油菜、棉花、水稻和小麥)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的研究進展，并對常見作物的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進行了系統(tǒng)地比較和研究，以期為植物源性、轉(zhuǎn)基因成分及相關(guān)檢測鑒定提供技術(shù)支撐。

1 植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的研究概況

在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的定性和定量PCR檢測中，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是不可或缺的關(guān)鍵因素。目前，已開發(fā)出多個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的轉(zhuǎn)基因作物主要有大豆、玉米、油菜、棉花、水稻和小麥。已開發(fā)的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因主要有凝集素基因(lectin)[7-11]、β-actin[6]和熱休克蛋白(hsp)[12]。其中，大豆中特有的是lectin基因，其最初被用作檢測轉(zhuǎn)基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[7,10-14]。在轉(zhuǎn)基因大豆定量檢測中，明確被測樣品中是否含有大豆來源和鑒定被測樣品DNA的質(zhì)量，均需通過對lectin基因的鑒定。在轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測中，玉米醇溶蛋白基因(zein)[11,15-17]、zSSⅡb[10,15,18]、族蛋白基因(high mobility group protein，hmgA)[19-20-22]、玉米轉(zhuǎn)化酶基因(invertase，Ivr)[9,12,21-22]和乙醇脫氫酶基因(alcohol dehydrogenase，adh1)[15]基因都曾被用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進行檢測；也有研究人員通過對玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zein[11,15-17]、zSSⅡb[8,18,23]、hmgA[19-20,24]、Ivr[9,12,21-22]和adh1[12]的比較，證明其適用于轉(zhuǎn)基因玉米的定性PCR檢測[4]。已開發(fā)的油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有十字花科素A基因(cruciferin A gene，CruA)[6]、油酰水解酶基因(oleoyl hydrolase gene，F(xiàn)atA)[17]、高遷移率族蛋白基因(highmobilitygroupprotein，HMG-I/Y)[11,19]和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEP)和BnACCg8基因[16,25-26]?；诿藁ㄩ_發(fā)為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的有磷酸果糖激酶基因(ppi Phosphofructokinase，Cotton-ppi-PPF)[17]、ACP1[3]、硬脂酰ACP去飽和酶基因(stearoyl-ACP desaturase，Sad1)[27-28]、SAH7(SinapisArabidopsishomolog7)[20]和纖維特異性?；d體蛋白基因(fiber-specific acyl carrier protein，fsACP1)。已開發(fā)的水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因主要有蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase，SPS)[29]、RBE4[30]、根部表達(dá)基因(rice root-specific gene，gos9)[24,31]、磷脂酶D基因(phospholipase D，PLD)和ppi-PPF[7]。小麥的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因包括乙酰輔酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)[31]、脫落酸誘導(dǎo)蛋白激酶基因(abscisic acid induced protein kinase，PKABA1)[32]、鋁誘導(dǎo)的蘋果酸轉(zhuǎn)運基因(aluminium-actived malate transporter，ALMT1)[8]、核糖體蛋白L21基因(ribosomal protein L21，RPL21)[8]、顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因(granule-bound starch synthase，Waxy-D1)[8]、γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)和PSG719基因[21]。

從目前已開發(fā)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其擴增片段來看，靶序列具有以下特征：首先，大多數(shù)引物設(shè)計在外顯子區(qū)域；其次，在設(shè)計內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測方法時擴增片段一般都較??；最后，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)為恒定的，且多為1個拷貝[33]。值得注意的是，雖然在轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品檢測中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是不可或缺的，但被國際實驗室循環(huán)認(rèn)證及國際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)證的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因較少[4]。到目前為止，通過國際實驗室循環(huán)驗證而被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)可的植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因主要是玉米zein[11,15-17]、zSSⅡb[10,18,23]基因和大豆的lectin[7,10-14]基因。其他基因只被報道或被一些國家的標(biāo)準(zhǔn)化機構(gòu)所認(rèn)可和采用。在未來的發(fā)展中，轉(zhuǎn)基因檢測中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因研究的重點和必然趨勢將是被國際循環(huán)實驗室實驗認(rèn)證和標(biāo)準(zhǔn)化[34]。

2 主要作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的研究進展

2.1 玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

玉米是世界三大谷類作物之一，也是重要的糧食作物。由于轉(zhuǎn)基因玉米具有重要的經(jīng)濟價值，其內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的獲取成為研究熱點。當(dāng)最常見的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因用作系統(tǒng)校準(zhǔn)物時，可通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)獲得轉(zhuǎn)基因玉米(ZeamaysL.)的定量結(jié)果。特別是，zein、adh1、Ivr1和hmg基因，它們被認(rèn)為以單拷貝形式存在于玉米基因組中[23]。目前為止，已開發(fā)出玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有zSSⅡb、hmgA、adhl、Ivr1等。表1列出了國內(nèi)外文獻(xiàn)中常見的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及引物探針序列等信息。Hernandez等[31]在轉(zhuǎn)基因玉米的定量PCR檢測和Southern印跡雜交實驗中，通過比較玉米的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Ivr1、10-kDazein、adhl、hmgA篩選出的4對引物均表現(xiàn)出了很好的特異性且有恒定的拷貝數(shù)，除10-kDazein為2個拷貝外，其他均為單拷貝。zSSⅡb基因是我國轉(zhuǎn)基因玉米檢測標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，而adhl基因是歐盟轉(zhuǎn)基因玉米檢測標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。由此可知，一個物種可以開發(fā)多個不同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，而且同一個基因的不同區(qū)域可能都適合作為特異性擴增的序列[3]。

表1 玉米常見內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Table 1 Common reference genes in maize

2.2 油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

耐除草劑的轉(zhuǎn)基因油菜已被允許在美國種植，如耐草甘膦油菜RT73(孟山都)或耐磷化氫油菜MS8xRF3(AgrEvo/PGS)[16]。表2列出了國內(nèi)外文獻(xiàn)中常見的油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及引物探針序列等信息。

表2 油菜常見內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Table 2 Common reference genes in rape

目前已開發(fā)的油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有：BnAccg8(X77576)基因、PEP(D13987)基因、CruA(X14555)基因、FatA(AJ294419)基因、HMG-I/Y(AF127919)基因。BnAccg8(X77576)基因作為轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA的定量檢測中的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，其拷貝數(shù)為2～3個拷貝，該基因拷貝數(shù)的不確定性成為一大難題[16]。PEP(D13987)也被用作油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，但未明確拷貝數(shù)及物種特異性。研究表明，PEP基因被用于轉(zhuǎn)基因油菜的定量與定性檢測，發(fā)現(xiàn)其有不同擴增的靶序列[26-27]。CruA(X14555)基因被歐盟轉(zhuǎn)基因檢測實驗室循環(huán)認(rèn)證并采用，可以用于RT73等轉(zhuǎn)基因油菜品種的鑒定，而Hernandez等[31]發(fā)現(xiàn)該基因在其他物種中出現(xiàn)了擴增的現(xiàn)象，且CruA基因種間特異性偏低，表明CruA作為油菜標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因還有待考證。有研究采用FatA(AJ294419)基因作為轉(zhuǎn)基因油菜RT73鑒定的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，但BLASTn結(jié)果表明FatA基因的引物及擴增片段與芥菜基因的同源性較高，所以FatA的物種特異性滿足油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的說法也令人懷疑[19]。此外，Yang等[40]認(rèn)為HMG-I/Y基因因其特異性好且為單拷貝，適合作為油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因；Weng等[38]對HMG-I/Y(AF127919)基因進行了細(xì)致的研究，并對該基因的靈敏度、拷貝數(shù)、物種特異性進行了驗證，認(rèn)為該基因符合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)比較研究表明，HMG-I/Y(AF127919)能將甘藍(lán)(Brassicaoleracea，CC)、芥菜型油菜(Brassicajuncea，AABB)、甘藍(lán)型油菜(AACC)區(qū)分出來。目前已開發(fā)的存在著等位基因變化的油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有HMG-I/Y、CruA、PEP，在不同油菜品種中其Ct值波動較大、穩(wěn)定性較差的基因有BnAccg8、HMG-I/Y，且BnAccg8、HMG-I/Y、CruA、FatA、PEP出現(xiàn)了與擬南芥、蘿卜等作物有交叉反應(yīng)的現(xiàn)象[3]。因此，科學(xué)、確切、真實的轉(zhuǎn)基因油菜檢測技術(shù)迫切需要重新設(shè)計引物或開發(fā)新的適合的油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[3]。

2.3 水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

水稻是世界三大糧食作物之一，也是我國最重要的糧食作物。隨著轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的發(fā)展，我國轉(zhuǎn)基因水稻的研究處于國際先進水平。表3中列出了國內(nèi)外文獻(xiàn)中常見的水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及引物探針序列等信息。研究表明，通過檢驗gos9基因的靈敏度、物種特異性、拷貝數(shù)、定量系統(tǒng)的穩(wěn)定性和真實性可知，gos9基因符合水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的要求[31]。經(jīng)歐盟各實驗室轉(zhuǎn)基因水稻定性和定量檢驗的循環(huán)認(rèn)證，選取了PLD作為水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[35]。同樣通過了國際循環(huán)認(rèn)證的是上海交通大學(xué)楊立桃教授團隊開發(fā)的水稻SPS內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[29,34,40]。通過物種特異性、拷貝數(shù)、以及定性定量PCR實驗，并建立一系列的檢測系統(tǒng)以及開展國際間驗證、協(xié)同實驗等，證明SPS基因符合在轉(zhuǎn)基因檢測中水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特征，且SPS定性PCR檢測方法的檢測下限為0.1%[4,33]。Jeong等[30]通過對RBE基因細(xì)致的研究開發(fā)了RBE4基因作為水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。余笑波等[42]通過對gos9、PLD、SPS、RBE4和UBQ5(Ubiquitin5)5種水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進行定量定性檢驗，篩選出和外源基因PCR產(chǎn)物最為接近的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因為RBE4。對現(xiàn)在已建立的gos9、PLD、SPS、RBE4這4個水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，除PLD與高粱、甘蔗、土豆有交叉反應(yīng)外，其他基因都具有較好的物種特異性，且均無等位基因的變化[42]。所以適用于轉(zhuǎn)基因水稻的檢測水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因為gos9、SPS、RBE4基因。

表3 水稻常見內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Table 3 Common reference genes in rice

2.4 大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

大豆是人類主要的油料作物和植物性蛋白質(zhì)來源，而且是重要的工業(yè)原料，轉(zhuǎn)基因大豆是目前世界上種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物[8]。表4中列出了國內(nèi)外文獻(xiàn)中常見的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及引物探針序列等信息。Lectin基因作為轉(zhuǎn)基因大豆(如轉(zhuǎn)基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2)定量檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，檢測樣品來源及鑒定樣品DNA質(zhì)量均需對Lectin基因進行檢測[20]。張海波[4]將大豆的品系特異性序列RRS、CaMV35S、NOS序列，和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因序列Lectin分別構(gòu)建到載體不同的位置，并利用此質(zhì)粒建立了大豆定量檢測的復(fù)合PCR系統(tǒng)。Lectin基因被用作大豆的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是因其具有較高的物種特異性和恒定的拷貝數(shù)。而對于大豆的β-actin和hsp基因來說，因其拷貝數(shù)和擴增片段不適用于定性檢測的深度加工操作，只能作為定性PCR檢測中的內(nèi)部陽性對照。

表4 大豆常見內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Table 4 Common reference genes in soybean

2.5 棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國。表5中列出了國內(nèi)外文獻(xiàn)中棉花常見的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及引物探針序列等信息。歐盟實驗室采用ACP1作為棉花的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[20]；而Sad1基因被Yang等[34]通過一系列的定性定量PCR檢測和Southern雜交實驗證明了其種間特異性和種內(nèi)非特異性以及雙拷貝的特點，認(rèn)為Sad1基因符合棉花的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因標(biāo)準(zhǔn)，可用于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測。Baeumler等[20]以widestrike轉(zhuǎn)基因棉花為材料、以SAH7為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，建立優(yōu)化定量PCR反應(yīng)體系，檢測出該棉花含量在0.04%～0.05%，從而證實了SAH7適合作為棉花的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。與上述基因不同的是，研究表明，以玉米、棉花、水稻為材料，以ppi-PPF為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，可特異性擴增得到長度分別為148、262、79 bp的片段，并得到了定量PCR的驗證，提示ppi-PPF基因是玉米、棉花、水稻的共有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因[3]。

表5 棉花常見內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Table 5 Common reference genes in cotton

2.6 小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

對于轉(zhuǎn)基因小麥的檢測和定量，先前已經(jīng)報道了4種不同的內(nèi)源參考基因ACC1、PKABA1、ALMT1和Waxy-D1，以及相應(yīng)的實時PCR分析[21-24]。ACC1基因及其實時PCR檢測不僅適用于普通小麥，還適用于硬粒小麥的定量，其PCR性能在以18個普通小麥和10個硬粒小麥為模板的反應(yīng)中得到了驗證[22]。PKABA1實時PCR測定法對小麥和大麥具有特異性，因此開發(fā)了一種采用1組引物和2個TaqMan探針的雙鏈實時PCR測定法，用于定量小麥和大麥。但是，很難開發(fā)出一種適用于高特異性轉(zhuǎn)基因小麥分析的合適的PKABA1分析方法[45]。ALMT1實時PCR檢測對普通小麥具有高度特異性，可在15個品系中提供穩(wěn)定的PCR性能[15]。Waxy-D1實時熒光定量PCR檢測方法對普通小麥也具有高度特異性，在19個普通小麥品種中產(chǎn)生了相似的PCR性能[23]。

由于小麥品種(L屬)中復(fù)雜的基因型和核型，選擇合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進行轉(zhuǎn)基因小麥分析仍然存在困難[31]。根據(jù)定性PCR擴增結(jié)果，不僅在所有六倍體普通小麥品系中觀察到ACC1基因和PKABA1基因的擴增子，而且在AegilopsspeltoidesTausch.(BB)、TriticumurartuL.(AA)和硬粒小麥(BBAA)中均觀察到了這一現(xiàn)象。ACC1和PKABA1分析對普通小麥的特異性較低。ALMT1和Waxy-D1基因擴增子無法從AegilopsspeltoidesTausch.(BB)、小麥TriartumurartuL.(AA)和硬質(zhì)小麥(BBAA)中擴增，表明這2個基因更適合鑒定普通小麥品種。結(jié)果還表明，ACC1基因來自B基因組，PKABA1來自A基因組，Waxy-D1和ALMT1基因來自小麥D基因組。因此，不可能利用來自單倍體A、B和D基因組的任何基因從普通小麥品系中特異性鑒定中國八倍體小黑麥。這些結(jié)果表明，在為任何給定物種選擇新的內(nèi)源參考基因時，應(yīng)考慮基因型和核型情況[31-32]。

目前，依據(jù)文獻(xiàn)，小麥的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因共有7種，分別為乙酰膽堿羧基酶基因(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)[31]、脫落酸激酶基因(abscisic acid induced protein kinase，PKABA1)[32]、鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白基因(aluminium-actived malate transporter，ALMT1)[8]、核糖體蛋白L21基因(ribosomal protein L21，RPL21)[8]、顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因(granule-bound starch synthase，Waxy-D1)[8]、γ-醇溶蛋白基因(GAG56D)[8]和PSG719基因。表6中列出了國內(nèi)外文獻(xiàn)中小麥常見的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及引物探針序列等信息。黃華麗[5]評估了ACC1基因、PKABA1基因、ALMT1基因和Waxy-D1這4種小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的實時定量PCR中的可靠性和穩(wěn)定性，對這4種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量擴增靶標(biāo)區(qū)分別進行測序，結(jié)合測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在的SNP位點很大程度上影響了一些小麥品系基因組的定量檢測序結(jié)果和定量統(tǒng)計分析，最終得出Waxy-D1基因在小麥定量分析中適性更強些。劉易科等[48]篩選到小麥PSG719基因具有特異性強、拷貝數(shù)低等特性，并具有普通小麥的特異性和品種間的穩(wěn)定性，經(jīng)定性、定量PCR極限檢測，結(jié)果表明該基因PCR反應(yīng)的靈敏度較高，可以對小麥轉(zhuǎn)基因成分含量較低的樣品進行檢測和定量；以經(jīng)梯度稀釋的小麥基因組DNA為模板，定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.395，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。上述結(jié)果表明，普通小麥內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PSG719是一個理想的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，可以用于轉(zhuǎn)基因小麥的定性和定量檢測[47-48]。

表6 小麥常見內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Table 6 Common reference genes in wheat

3 展望

內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在植物分子生物學(xué)與分析測試中應(yīng)用十分廣泛。如今，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物均已開發(fā)相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，有的還有多個適用的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。分子生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用也隨之帶來一系列的安全問題，面對這些問題，植物產(chǎn)品的監(jiān)管與檢測就需要使用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的檢測以及作物成分的鑒定都需要以內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因為基準(zhǔn)，所以內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有著極大的開發(fā)應(yīng)用價值。但就目前而言，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的開發(fā)也有許多不足之處，如就物種特異性要求而言，已開發(fā)出的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的物種特異性不強。對于定量PCR或者數(shù)字PCR檢測，檢測結(jié)果的真實性及有效性對內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有著極大的要求。時至今日，較多的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性和拷貝數(shù)沒有經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的檢驗，導(dǎo)致應(yīng)用混亂。對于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的標(biāo)準(zhǔn)各國之間也存在很多不同之處，因此，我國有必要對各物種的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進行比較，篩選出最符合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因要求的基因并進行循環(huán)驗證。近些年來，各主要轉(zhuǎn)基因物種均發(fā)布了若干內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，但實踐表明，不同內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因所獲定量結(jié)果差異較大，如何選擇內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因成為重點和難點。后續(xù)可以通過查找玉米、大豆、油菜、棉花、水稻和小麥等主要作物的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因并創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫、優(yōu)化實驗方法找出最佳的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。