王仙霞,武利慶,楊彬,張寧,蘇萍,楊屹

1.北京化工大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 北京 100029； 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院， 北京 100029

隨著生物學(xué)理論與方法的不斷發(fā)展，生命科學(xué)經(jīng)歷了從“描述生物學(xué)”到“實(shí)驗(yàn)生物學(xué)”再到“創(chuàng)造生物學(xué)”發(fā)展的歷程，當(dāng)今的生命科學(xué)已經(jīng)從現(xiàn)象描述逐漸轉(zhuǎn)變到精準(zhǔn)定量。生命科學(xué)的發(fā)展突破了傳統(tǒng)的診斷與醫(yī)藥領(lǐng)域，拓展到了農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境、能源等眾多領(lǐng)域，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確與否關(guān)系著大眾的健康與安全。

蛋白質(zhì)計(jì)量的主體是蛋白質(zhì)測(cè)量理論、測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)與測(cè)量技術(shù)，其終極目的是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)特性量值與標(biāo)稱特性檢測(cè)結(jié)果在國(guó)際范圍內(nèi)的準(zhǔn)確與可比。蛋白質(zhì)的特性量值指的是由確定蛋白質(zhì)的特性量的數(shù)以及單位、參考程序等形式表示的特性量的大小，如含量、活性等。對(duì)于蛋白質(zhì)特性量值的計(jì)量，主要是通過(guò)建立蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果的量值溯源傳遞體系，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確與可比。蛋白質(zhì)的標(biāo)稱特性是不以大小進(jìn)行區(qū)分的蛋白質(zhì)的特性，如序列、結(jié)構(gòu)等。對(duì)于蛋白質(zhì)標(biāo)稱特性的計(jì)量，關(guān)鍵是提高測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性與可比性。

經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展，蛋白質(zhì)含量計(jì)量已經(jīng)日趨成熟，相繼發(fā)展了同位素稀釋質(zhì)譜、定量核磁、質(zhì)量平衡等系列權(quán)威計(jì)量方法，并研制了相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，初步構(gòu)建起蛋白質(zhì)含量量值溯源傳遞體系[1]。但是，蛋白質(zhì)含量計(jì)量中僅僅考慮了依據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列形成的“被測(cè)量”，但實(shí)際上蛋白質(zhì)是由不同的氨基酸通過(guò)酰胺鍵脫水縮合而成的長(zhǎng)鏈大分子，分子通過(guò)盤旋折疊形成復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)分子活性和功能的實(shí)現(xiàn)不僅僅依賴于其一級(jí)氨基酸序列，更為重要的是其形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)一級(jí)結(jié)構(gòu)不變而高級(jí)結(jié)構(gòu)改變時(shí)蛋白質(zhì)的活性和功能可能喪失。蛋白質(zhì)含量計(jì)量技術(shù)是依賴于蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列進(jìn)行定量，不能反映出具有功能的蛋白質(zhì)的活性濃度，而在實(shí)際應(yīng)用中，如生物醫(yī)藥或體外診斷中，會(huì)更多的考慮蛋白質(zhì)的活性。因此僅測(cè)定蛋白質(zhì)的含量具有一定的局限性，還必須對(duì)具有特定功能的蛋白質(zhì)活性濃度進(jìn)行精確測(cè)定，這就需要蛋白質(zhì)活性計(jì)量的支撐(圖1)。蛋白質(zhì)的活性一般都由參考方法等進(jìn)行定義，同一個(gè)蛋白根據(jù)活性定義的不同，可以具有不同的活性量值。建立各種蛋白質(zhì)活性的量值源頭、研究建立蛋白質(zhì)活性計(jì)量方法并研制相關(guān)活性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，成為蛋白質(zhì)活性計(jì)量研究的主要內(nèi)容。當(dāng)前，蛋白質(zhì)活性計(jì)量的突破主要集中于酶催化活性濃度計(jì)量技術(shù)以及免疫親和活性濃度計(jì)量技術(shù)，其測(cè)量結(jié)果可以溯源到SI單位。此外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)活性測(cè)量結(jié)果無(wú)法建立到SI單位的溯源途徑時(shí)，仍然廣泛使用參考測(cè)量程序或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立量值源頭。

圖1 蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)活性濃度定量示意圖Fig.1 Quantitative diagram of protein content and protein activity concentration

1 酶催化活性濃度計(jì)量技術(shù)

酶催化活性簡(jiǎn)稱酶活性(enzyme activity)，是常見的一類蛋白質(zhì)活性，它是指酶催化特定生化反應(yīng)的能力，單位可用酶催化活性濃度單位表示，即在特定條件下(25 ℃，或其他最適條件)，單位時(shí)間內(nèi)引起一定量(1 μmol)的底物發(fā)生反應(yīng)的酶量，單位為kat。除了法定計(jì)量單位，常用的酶活性濃度單位還有國(guó)際單位IU(或U)，它們和SI單位kat之間的換算關(guān)系如式(1)。

1 IU = 1 μmol·min-1≈16.67 nkat

(1)

酶催化活性濃度的測(cè)定需要嚴(yán)格按照酶催化活性濃度的參考測(cè)量程序中定義的方案進(jìn)行操作以保證量值的準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)。參考測(cè)量程序中往往規(guī)定了測(cè)量時(shí)的底物濃度、pH、反應(yīng)溫度、測(cè)量時(shí)間、波長(zhǎng)、光程等參數(shù)，測(cè)量過(guò)程中所有參數(shù)均需要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立起到SI單位的溯源性。酶催化活性濃度的測(cè)定多采用分光光度法，測(cè)量的方式包括終點(diǎn)法與速率法等。目前，國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC) 提出了7個(gè)血清酶學(xué)參考測(cè)量程序并被收錄到檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)(Joint Commission on The Traceability of Laboratory Medicine,JCTLM )的參考測(cè)量程序數(shù)據(jù)庫(kù)中，這7個(gè)酶分別是α-淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶、γ-谷酰胺轉(zhuǎn)移酶和乳酸脫氫酶，IFCC的這些血清酶學(xué)參考測(cè)量程序已成為臨床酶催化活性濃度測(cè)量結(jié)果的溯源依據(jù)[2-9]。

2 免疫親和活性濃度計(jì)量技術(shù)

免疫分析法是利用抗原-抗體間特異性相互作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物定性定量分析的方法，也是蛋白質(zhì)常規(guī)檢測(cè)中經(jīng)常使用的分析方法。由于使用了抗體進(jìn)行捕獲和檢測(cè)，因此免疫分析法測(cè)定的是目標(biāo)蛋白質(zhì)中能夠與抗體結(jié)合的部分，那些由于高級(jí)結(jié)構(gòu)改變使得抗原決定簇破壞或被隱藏的蛋白質(zhì)分子則不能被抗體識(shí)別并結(jié)合，免疫分析法也就無(wú)法測(cè)定，因此免疫分析法測(cè)定的是目標(biāo)蛋白分子中能夠與抗體結(jié)合部分的一個(gè)子集，稱為免疫親和活性濃度。蛋白質(zhì)免疫親和活性濃度與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系如圖2所示，其單位與蛋白質(zhì)含量的單位相同，仍然溯源到SI單位。如果一個(gè)蛋白質(zhì)的免疫親和活性濃度為ap，相應(yīng)蛋白質(zhì)的含量為cp，則存在式(2)。

圖2 目標(biāo)物在偶聯(lián)有抗體的金箔表面擴(kuò)散結(jié)合與解析的過(guò)程Fig.2 The process of diffusion binding and analysis of the target substance on the surface of the gold foil coupled with the antibody

ap≤cp

(2)

當(dāng)抗體不同時(shí)，同一個(gè)蛋白質(zhì)由于識(shí)別位點(diǎn)的不同，可能存在多個(gè)ap，但是對(duì)于給定的抗體(antibaody, Ab)，該免疫親和活性濃度ap(Ab)是唯一的。為了測(cè)定該濃度，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)多種免疫親和活性濃度的絕對(duì)測(cè)定技術(shù)，主要包括基于表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)的無(wú)標(biāo)活性濃度定量(calibration free concentration analysis, CFCA)技術(shù)和基于數(shù)字ELISA的技術(shù)。

2.1 SPR-CFCA技術(shù)

CFCA[10-12]是利用已知蛋白質(zhì)抗原的擴(kuò)散系數(shù)，通過(guò)測(cè)定在擴(kuò)散速率部分限制條件下的結(jié)合速率直接計(jì)算抗原的濃度，該過(guò)程如圖3 所示。

圖3 基于數(shù)字PCR的蛋白質(zhì)免疫親和活性濃度測(cè)定原理Fig.3 Principle of protein immunoaffinity activity concentration determination based on digital PCR

如圖3所示，當(dāng)含有蛋白質(zhì)抗原的溶液在偶聯(lián)有抗體的金箔芯片表面以一定速率流過(guò)時(shí)，溶液中的抗原將擴(kuò)散到金箔表面，其中只有具有正確的抗原決定簇的抗原分子可以被抗體識(shí)別并結(jié)合，從而帶來(lái)SPR信號(hào)的改變，因此測(cè)定的結(jié)果為免疫親和活性濃度。芯片表面抗原濃度asurface與樣品中的抗原濃度abulk之間的關(guān)系可用式(3)表示。

(3)

根據(jù)質(zhì)量作用定律，可以得到公式(4)。

(4)

(5)

(6)

式中,D—分析物擴(kuò)散系數(shù)，m2·s-1；F—通過(guò)流動(dòng)池溶液的體積流速，m3·s-1；h,w和l—流動(dòng)池尺寸(高度、寬度和長(zhǎng)度)，m；M—分析物分子量，Da；ηrel—溶劑與水的相對(duì)粘度(20 ℃)，無(wú)量綱。

由于要求分子間的結(jié)合發(fā)生在傳質(zhì)擴(kuò)散限制的條件下，因此限制了CFCA方法分析的分子測(cè)量范圍，這種方法只能用于分子量大于5 000 Da的蛋白質(zhì)的分析。

Grover等[13]首次展示了CFCA方法在直接檢測(cè)患有不同傳染病和非傳染病患者的血清樣品中的生物標(biāo)志物中的應(yīng)用。此方法在快速監(jiān)測(cè)血清樣品中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物豐度、臨床診斷和藥物發(fā)現(xiàn)方面具有非常大的潛力。Karlsson等[14]采用該方法研究了抗體的活性濃度。Su等[15]提出用CFCA法測(cè)定G2-EPSPS蛋白的免疫親和活性濃度，發(fā)現(xiàn)活性濃度僅為同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量的20%左右；Hu等[16]采用基于SPR的CFCA法對(duì)人肌紅蛋白的活性濃度進(jìn)行了絕對(duì)定量，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抗體的優(yōu)化篩選，選擇對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)不敏感的抗體，測(cè)得的蛋白質(zhì)活性濃度結(jié)果與同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)量的結(jié)果一致。該方法測(cè)定過(guò)程中不需要任何標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)量原理可以用方程清晰地描述，測(cè)量結(jié)果可以用國(guó)際單位制表示，因此該方法有望成為新的蛋白質(zhì)含量與免疫親和活性濃度計(jì)量的權(quán)威方法。

2.2 數(shù)字ELISA技術(shù)

數(shù)字ELISA技術(shù)也可獲得蛋白質(zhì)分子免疫親和活性濃度，目前比較成熟的是借助數(shù)字PCR技術(shù)建立起數(shù)字ELISA的分析方法。數(shù)字PCR是一種由Vogelstein和Kinzler于20世紀(jì)末提出的核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)將核酸分子稀釋到單分子水平后加入到小孔進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增完成后測(cè)定每個(gè)小孔的信號(hào)強(qiáng)度，再根據(jù)泊松分布原理來(lái)確定原樣本中核酸濃度的定量技術(shù)[17]。數(shù)字PCR定量技術(shù)不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，也不依賴于熒光定量PCR所需要的閾值(Ct值)，是一種無(wú)標(biāo)絕對(duì)定量技術(shù)，具有較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。采用兩條寡聚核苷酸探針標(biāo)記抗體，通過(guò)鄰位連接技術(shù)(PLA)[18]即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的熒光實(shí)時(shí)定量PCR免疫分析，如果將熒光實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增體系轉(zhuǎn)移到數(shù)字PCR平臺(tái)上，即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的免疫親和活性濃度的絕對(duì)定量，測(cè)量原理如圖4所示[19-20]。

該技術(shù)需要使用兩個(gè)不同的單克隆抗體或一個(gè)多克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，兩個(gè)抗體分別與抗原蛋白分子的兩個(gè)不同抗原決定簇結(jié)合，因此，采用該方法測(cè)定的蛋白質(zhì)的免疫活性濃度是蛋白質(zhì)分子中可同時(shí)與兩個(gè)抗體結(jié)合的部分，這個(gè)與SPR-CFCA技術(shù)得到的結(jié)果是不一樣的。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同樣的蛋白和抗體，該方法得到的結(jié)果遠(yuǎn)小于SPR-CFCA方法得到的結(jié)果，這與理論預(yù)測(cè)是一致的[21]。

Albayrak等[22]通過(guò)結(jié)合鄰近連接測(cè)定(PLA)和數(shù)字PCR的非常實(shí)用的工作流程，對(duì)單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和mRNA進(jìn)行了極其靈敏和絕對(duì)的定量分析。Hu等[23]報(bào)告了一種簡(jiǎn)單且低成本的基于微芯片的dPCR方法，借助PLA技術(shù)，用于定量低濃度蛋白質(zhì)，方法的線性動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到3～4個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限達(dá)到飛摩爾級(jí)。Christina等[24]利用PCR蛋白定量技術(shù)通過(guò)檢測(cè)活性半胱天冬酶-3的含量來(lái)檢測(cè)原代腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。Hu等[21]建立了基于qPCR和dPCR的G2-EPSPS蛋白定量方法，測(cè)定了G2-EPSPS在雙抗體夾心條件下的免疫親和活性濃度。

3 其他蛋白質(zhì)活性計(jì)量技術(shù)

除了上述可溯源到SI單位的蛋白質(zhì)活性計(jì)量技術(shù)外，目前大多數(shù)蛋白質(zhì)活性的量值溯源與傳遞仍然通過(guò)約定的參考測(cè)量程序和標(biāo)準(zhǔn)品形成蛋白質(zhì)活性量值的源頭并進(jìn)行量值的傳遞，這些約定可以是國(guó)際范圍內(nèi)的，也可以是國(guó)內(nèi)范圍的，甚至是一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域或一個(gè)具體產(chǎn)品范圍內(nèi)的。國(guó)際范圍內(nèi)用于體外診斷的參考測(cè)量程序可以從國(guó)際計(jì)量局網(wǎng)站(https://www.bipm.org/)JCTLM參考測(cè)量程序數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行查詢；約定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品可以從英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)網(wǎng)站進(jìn)行查詢。此外，也有根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能活性的相關(guān)性，建立蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-活性的構(gòu)效關(guān)系建立蛋白質(zhì)的活性量值，但是該技術(shù)仍然在研究探索中，尚未見成熟技術(shù)的報(bào)道。

4 展望

隨著生命科學(xué)的進(jìn)步和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)蛋白質(zhì)計(jì)量技術(shù)的需求將愈發(fā)強(qiáng)烈。生物制藥、體外診斷等不僅需要蛋白質(zhì)含量的量值溯源傳遞體系，更迫切需要建立蛋白質(zhì)活性量值的溯源傳遞體系。目前，蛋白質(zhì)的活性計(jì)量技術(shù)剛剛起步，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)活性量值無(wú)法溯源到SI單位，仍然依靠約定的參考測(cè)量程序和約定的標(biāo)準(zhǔn)品建立量值源頭并開展量值溯源與傳遞。在可溯源到SI單位的蛋白質(zhì)活性計(jì)量研究中，臨床酶催化活性濃度測(cè)量是應(yīng)用最為成功的范例，其量值溯源傳遞已經(jīng)形成了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[25]。蛋白質(zhì)免疫親和活性濃度的測(cè)量已經(jīng)引起相關(guān)研究人員的興趣，有助于提高蛋白質(zhì)相互作用的親和常數(shù)與動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)量準(zhǔn)確度[26]?？傊磥?lái)在一段時(shí)期內(nèi)，蛋白質(zhì)活性計(jì)量還是要以基礎(chǔ)研究為主，逐步建立蛋白質(zhì)活性測(cè)量結(jié)果到SI單位的溯源性，進(jìn)一步驗(yàn)證現(xiàn)有蛋白質(zhì)活性計(jì)量技術(shù)并建立新的蛋白質(zhì)活性計(jì)量技術(shù)，同時(shí)積極探索蛋白質(zhì)活性量值溯源傳遞體系在生物產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。