王仙霞,武利慶,楊彬,張寧,蘇萍,楊屹

1.北京化工大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 北京 100029; 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院， 北京 100029

生命科學(xué)與生物產(chǎn)業(yè)是21世紀(jì)最為活躍、影響最為深遠(yuǎn)的新興學(xué)科與朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，是世界各國(guó)創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)與產(chǎn)業(yè)革命的主攻方向，其長(zhǎng)足發(fā)展對(duì)于我國(guó)搶占新一輪科技革命和產(chǎn)業(yè)革命制高點(diǎn)、加快我國(guó)生命科學(xué)技術(shù)進(jìn)步、推動(dòng)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展、建設(shè)“健康中國(guó)”具有重要意義。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，更是基因功能的執(zhí)行者，它參與遺傳、發(fā)育、繁殖、物質(zhì)和能量的代謝、應(yīng)激、思維和記憶等生命的所有過(guò)程，是生物體內(nèi)最重要的生物大分子。當(dāng)前，蛋白質(zhì)科學(xué)研究已成為生命科學(xué)發(fā)展的核心領(lǐng)域，不論在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，還是在體外診斷、生物醫(yī)藥、食品安全等應(yīng)用領(lǐng)域，蛋白質(zhì)檢測(cè)都占有相當(dāng)重要的比重。蛋白質(zhì)檢測(cè)對(duì)精確結(jié)果的需求催生了蛋白質(zhì)計(jì)量技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。蛋白質(zhì)的特性量值包括含量、活性、結(jié)構(gòu)等，其中蛋白質(zhì)含量描述了目標(biāo)蛋白分子數(shù)的多少，是蛋白質(zhì)的基本屬性。蛋白質(zhì)含量測(cè)定是體外診斷結(jié)果量值溯源的依據(jù)，是蛋白類藥物等生物產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，也是蛋白質(zhì)其他特性量值計(jì)量的基礎(chǔ)，因此蛋白質(zhì)含量計(jì)量是蛋白質(zhì)計(jì)量的首要任務(wù)[1]。

1995年國(guó)際計(jì)量局原局長(zhǎng)Quinn T J在國(guó)際計(jì)量局物質(zhì)的量咨詢委員會(huì)(Consultative Committee for Amount of Substance:Metrology in Chemistry and Biology，CCQM)上提出了“基準(zhǔn)方法”這一名詞，基準(zhǔn)方法(primary method)[2]是具有最高計(jì)量品質(zhì)(也即最高的準(zhǔn)確度)的方法，它具有兩個(gè)特征，第一是操作可以被完全地描述和理解，第二是不確定度可直接用SI單位(international system of units)表述。蛋白質(zhì)含量計(jì)量技術(shù)圍繞精準(zhǔn)定量和溯源到SI單位的目標(biāo)，近年來(lái)逐漸建立起一些高準(zhǔn)確度的計(jì)量方法，這些方法滿足基準(zhǔn)方法的定義，但是尚未被CCQM正式認(rèn)定為基準(zhǔn)方法，因此通常稱為“權(quán)威計(jì)量方法”或“潛在計(jì)量基準(zhǔn)方法”。這些方法包括：質(zhì)量平衡法(mass balance method)、同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)、定量核磁法(quantitative NMR,qNMR)、電噴霧-差分電遷移-顆粒計(jì)數(shù)法(electrospray-differential mobility analysis-condensation particle counter, ES-DMA-CPC)、高效液相-圓二色光譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-circular dichroism spectroscopy,LC-CD)，本文對(duì)這些方法進(jìn)行了綜述，以期為蛋白質(zhì)含量計(jì)量相關(guān)研究提供參考。

1 質(zhì)量平衡法

質(zhì)量平衡法依據(jù)蛋白質(zhì)(或肽段)主成分與雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為1，從總和“1”中逐一扣除相關(guān)結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)、水分、殘留的揮發(fā)性有機(jī)溶劑、非揮發(fā)性有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)等各類雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)得到主成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為蛋白質(zhì)純度的測(cè)量結(jié)果[3-5](式1)。在用于肽段和蛋白質(zhì)測(cè)量之前，該方法已經(jīng)成功應(yīng)用在有機(jī)小分子的準(zhǔn)確定量中[6-10]。

wA=1 000-(wRS+wW+wVOC+wNV)

(1)

其中,wA—目標(biāo)多肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1；wRS—結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1；wW—水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1；wVOC—?dú)埩舻膿]發(fā)性有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1；wNV—非揮發(fā)性有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg-1。

1.1 雜質(zhì)成分的扣除

質(zhì)量平衡法成功實(shí)施的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確鑒定并定量出各類雜質(zhì)成分并逐一扣除，如圖1所示，其中結(jié)構(gòu)類似物一般通過(guò)高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用等方式，使用不同的色譜柱、流動(dòng)相、流動(dòng)相梯度等，從樣品中盡可能多的分離出觀察到的雜質(zhì)，并一一通過(guò)高分辨質(zhì)譜鑒定出各個(gè)雜質(zhì)，最常用的分離手段是反相高效液相色譜,如采用C18柱進(jìn)行分離[11]。

圖1 質(zhì)量平衡法流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the mass balance method process

肽或蛋白質(zhì)的雜質(zhì)大部分為目標(biāo)肽段氨基酸缺失、二聚體、氧化、脫氨基等形成的雜質(zhì)。應(yīng)注意一些脫氨基的雜質(zhì)在C18柱上有可能和主成分共同流出[12]，在雜質(zhì)分析時(shí)，推薦至少使用2種不同填料的色譜柱分析脫氨基與乙?；碾亩坞s質(zhì)。鑒定出的雜質(zhì)盡可能合成出相應(yīng)肽段的純品，用氨基酸分析法或基于氨基酸的同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定出各個(gè)雜質(zhì)肽段純品的含量，再通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)外標(biāo)法對(duì)樣品中含有的各個(gè)雜質(zhì)肽段進(jìn)行定量，從而得到結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。當(dāng)雜質(zhì)肽段不易合成或鑒定有困難時(shí)，可以在離子流色譜圖上選擇與其分子量及峰面積接近的已知含量的肽段雜質(zhì)，假定這兩個(gè)雜質(zhì)肽段在質(zhì)譜上具有類似的響應(yīng)，從而可以通過(guò)已知雜質(zhì)肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知雜質(zhì)肽段進(jìn)行定量。

水分含量主要通過(guò)卡爾·費(fèi)休滴定法[13]或熱重分析法確定，其中卡爾·費(fèi)休滴定法可以用水分含量有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行方法驗(yàn)證或校準(zhǔn)[14]。

殘留的有機(jī)溶劑一般通過(guò)將肽段溶解在合適的溶劑中，如二甲基亞砜(DMSO)等，再用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)頂空進(jìn)樣的方式進(jìn)行分析，以各種純?nèi)軇┑臉?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或純品通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行定量。

非揮發(fā)性有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)主要是各類無(wú)機(jī)陽(yáng)離子與陰離子。無(wú)機(jī)陽(yáng)離子一般先用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)進(jìn)行半定量掃描，如果存在含量較高的無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，可進(jìn)一步采用離子色譜法、ICP-MS或電感耦合等離子體發(fā)光發(fā)射光譜儀(ICP-OES)等方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量[15]；無(wú)機(jī)陰離子一般采用離子色譜法進(jìn)行測(cè)定。不論無(wú)機(jī)陰離子的測(cè)定還是陽(yáng)離子的準(zhǔn)確定量，都應(yīng)當(dāng)采用具有溯源性的國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)待測(cè)離子無(wú)國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，可采用純品替代，但是在含量較高時(shí)，為獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，需要對(duì)純品的純度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。如合成肽段中經(jīng)常含有的三氟乙酸根，由于沒(méi)有國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可采用定量核磁的方法對(duì)作為標(biāo)準(zhǔn)品的三氟乙酸或三氟乙酸鹽的純度進(jìn)行測(cè)定[16-18]。Josephs等[19]用質(zhì)量平衡法精確測(cè)定了人血管緊張素Ⅰ的含量，結(jié)果與同位素稀釋質(zhì)譜與定量核磁得到的結(jié)果一致。Stocks等[20]鑒定并定量了人血管緊張素Ⅱ中的低含量雜質(zhì)肽段，采用質(zhì)量平衡法測(cè)定了人血管緊張素Ⅱ的含量。Bros等[21]采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用以及離子淌度質(zhì)譜鑒定了Hepcidin中的雜質(zhì)，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定。

1.2 質(zhì)量平衡法的應(yīng)用

質(zhì)量平衡法已經(jīng)成功應(yīng)用于有機(jī)小分子和肽段含量的準(zhǔn)確測(cè)量，成為世界各國(guó)計(jì)量研究院提高蛋白質(zhì)含量核心測(cè)量能力的主要手段。但是嚴(yán)格的質(zhì)量平衡法目前并不適用于分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、帶有翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。在使用質(zhì)量平衡法分析蛋白質(zhì)含量時(shí)，往往采用一種簡(jiǎn)化的分析方法。首先用高效液相色譜充分分離樣品中的雜質(zhì)與主成分，當(dāng)主成分的峰面積占所有峰面積的98.5%以上時(shí)，可按照式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。這種含量計(jì)算方式也經(jīng)常用于國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

wA=P(1-wW-wVOC-wNV)

(2)

其中,wA—目標(biāo)多肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1；P—主成分高效液相色譜峰面積占總峰面積的百分比，%；wW—水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1；wVOC—?dú)埩舻膿]發(fā)性有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1；wNV—非揮發(fā)性有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1。

我國(guó)最早研制的蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW09815牛血清白蛋白成分量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和GBW09816胰島素(豬)成分量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都采用了這種簡(jiǎn)化的質(zhì)量平衡法作為定值方法之一；李佳樂(lè)等[22]也將質(zhì)量平衡法用于人轉(zhuǎn)鐵蛋白含量的準(zhǔn)確測(cè)定中。

質(zhì)量平衡法各個(gè)雜質(zhì)的測(cè)定均采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行溯源，因此保證了測(cè)量結(jié)果的可溯源性。與目前其他蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法相比，該方法具有更小的測(cè)量不確定度，因此成為國(guó)際上各個(gè)國(guó)家計(jì)量研究院重點(diǎn)發(fā)展的肽或蛋白質(zhì)含量計(jì)量方法，也是各國(guó)計(jì)量研究院建立、申報(bào)肽段或蛋白質(zhì)校準(zhǔn)測(cè)量能力(CMC)的主要技術(shù)手段之一。但是，質(zhì)量平衡法也有比較明顯的缺點(diǎn)，它僅適用于純化后的固體或粉末狀的多肽或蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，不能用于溶液和基體中多肽或蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。由于方法需要對(duì)水分等進(jìn)行測(cè)定，需要的樣品量比較大，測(cè)一次通常需要幾十毫克到數(shù)百毫克的樣品量[4,16,23]，無(wú)法用于微量樣品的分析,即使可以分析，方法的分析成本也比較高昂。

2 同位素稀釋質(zhì)譜法

同位素稀釋質(zhì)譜法是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，通過(guò)采用待測(cè)目標(biāo)物的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)，能夠在樣品前處理、分離和質(zhì)譜分析過(guò)程中最大限度地消除系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差，保持目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的比例不變，從而得到高準(zhǔn)確度的分析結(jié)果。同位素稀釋質(zhì)譜法具有準(zhǔn)確度高、適用范圍廣、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已在無(wú)機(jī)元素及有機(jī)小分子的準(zhǔn)確定量中得到了廣泛應(yīng)用，成為CCQM認(rèn)定的基準(zhǔn)方法之一。但是，對(duì)于肽或蛋白質(zhì)這類大分子的分析，一般需要將其水解成氨基酸或酶切成肽段后，通過(guò)同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定水解液中的氨基酸含量或酶解液中的肽段含量，間接計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量，水解效率或酶解效率會(huì)影響蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，肽或蛋白質(zhì)的同位素稀釋質(zhì)譜法是一種潛在的計(jì)量基準(zhǔn)方法。

2.1 肽或蛋白質(zhì)純物質(zhì)含量的同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定

采用同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)肽或蛋白質(zhì)純物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，需要首先將其水解為氨基酸，一般采用酸水解的方式，選用的鹽酸濃度為6或8 mol·L-1，為了減少水解過(guò)程中的副反應(yīng)，水解需要在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行或者在水解體系中加入少量的苯酚，可采用液相水解、氣相水解或微波輔助水解等多種形式[24-30]。即使有氮?dú)饣虮椒拥谋Ｗo(hù)，部分氨基酸也會(huì)在酸水解過(guò)程中被破壞，只有少數(shù)氨基酸，如脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等，能夠在水解過(guò)程中保持穩(wěn)定，常被用來(lái)計(jì)算肽或蛋白質(zhì)的含量。精氨酸、賴氨酸、組氨酸和甘氨酸也能夠保持穩(wěn)定，可在需要的情況下用于肽或蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[25]。

同位素標(biāo)記氨基酸可采用13C、15N或D標(biāo)記的氨基酸，為減少非標(biāo)記氨基酸天然同位素豐度對(duì)標(biāo)記氨基酸質(zhì)譜檢測(cè)的影響，一般要求標(biāo)記氨基酸的質(zhì)量數(shù)比非標(biāo)記氨基酸至少大3 Da。同位素標(biāo)記氨基酸在水解前或水解后加入均可，13C、15N標(biāo)記的氨基酸可在水解前加入，在水解過(guò)程中這些標(biāo)記氨基酸能夠保持穩(wěn)定；由于氫氘交換的存在，D標(biāo)記的氨基酸一般應(yīng)在水解后加入。如果在水解前加入，要求樣品處理和水解過(guò)程中不能有轉(zhuǎn)移操作，否則會(huì)影響定量準(zhǔn)確度。

氨基酸的分離一般采用反相色譜(reversion phase chromatography, RPC)[31,32]或親水色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)[33]進(jìn)行，有時(shí)為了進(jìn)一步提高氨基酸之間的分離度，尤其是亮氨酸與異亮氨酸之間的分離度，還可加入一些離子對(duì)化合物，如全氟庚酸等。質(zhì)譜檢測(cè)一般采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiresponse monitoring model，MRM)進(jìn)行，采用單點(diǎn)法或括號(hào)法進(jìn)行定量，通過(guò)提取各個(gè)離子對(duì)的離子流色譜圖計(jì)算峰面積后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。通過(guò)同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定肽或蛋白的含量，可通過(guò)國(guó)家氨基酸純度有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終溯源到SI單位[34]。

即便是經(jīng)過(guò)純化后的肽或蛋白純物質(zhì)，也會(huì)或多或少的含有雜質(zhì)肽或雜蛋白，這些雜質(zhì)在水解過(guò)程中也會(huì)釋放出氨基酸，如果不加區(qū)分采用水解后的氨基酸計(jì)算肽或蛋白的含量，必然過(guò)高估計(jì)此含量值。因此，為了獲得準(zhǔn)確定量結(jié)果，在采用同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定的氨基酸含量計(jì)算肽或蛋白質(zhì)含量之前，還需要對(duì)雜質(zhì)肽或雜蛋白水解產(chǎn)生的氨基酸進(jìn)行校正。校正有兩種方法，第一種方法與質(zhì)量平衡法中結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)的分析方法類似，通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)樣品中含有的結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)進(jìn)行鑒定，然后合成出這些雜質(zhì)純品并確定含量，以這些已知含量的純品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)LC-MS外標(biāo)法定量出這些雜質(zhì)的含量，并以此計(jì)算雜質(zhì)水解后產(chǎn)生的氨基酸的量。從同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定的總氨基酸含量中減去所有雜質(zhì)水解后產(chǎn)生的氨基酸的量進(jìn)行校正，再用校正后的氨基酸的量計(jì)算肽或蛋白質(zhì)的含量，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)肽或蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定。第二種方法適合于高效液相色譜上雜質(zhì)能夠與主成分完全分離的情況，首先通過(guò)對(duì)色譜條件的充分優(yōu)化，使樣品中的主成分和雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)基線分離，雜質(zhì)間分離情況不做要求。接著采用餾分收集的方式，在一次進(jìn)樣中將主成分之前的所有雜質(zhì)收集于試管1中，主成分收集于試管2中，主成分之后的所有雜質(zhì)收集于試管3中，分別稱量3個(gè)試管中液體的質(zhì)量，并在3個(gè)試管中定量加入同位素標(biāo)記氨基酸后進(jìn)行水解，通過(guò)同位素稀釋質(zhì)譜法即可測(cè)定不同試管中各個(gè)氨基酸的含量，分別記為w1、w2、w3，則主成分中某一氨基酸的比例可通過(guò)式(3)進(jìn)行計(jì)算：

(3)

其中，w1—試管1中某一氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1；w2—試管2中某一氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1；w3—試管3中某一氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·g-1；m1—試管1中收集流出液的質(zhì)量，g；m2—試管2中收集流出液的質(zhì)量，g；m3—試管3中收集流出液的質(zhì)量，g。

將樣品同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定的總氨基酸含量乘以比例因子R進(jìn)行校正，再用校正后的氨基酸的量計(jì)算肽或蛋白質(zhì)的含量，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)肽或蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定。與第一種方法相比，這種方法無(wú)需對(duì)樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行一一鑒定和定量，大大節(jié)約了人力和分析成本，但是要求主成分和雜質(zhì)必須能夠基線分離。

Josephs等[23]采用同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定了人血管緊張素Ⅰ的含量，質(zhì)量平衡與定量核磁得到的結(jié)果一致；Pritchard和Kato也用該方法測(cè)定了人血管緊張素Ⅰ的含量[29,33]。Kinumi等[35]用同位素稀釋質(zhì)譜方法研制了可溯源到SI單位的C肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NMIJ CRM6901-a。該方法還被用于胰島素、乙醇脫氫酶、C肽、人生長(zhǎng)激素、C-反應(yīng)蛋白、β-2-微球蛋白、胱抑素C、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、BNP、糖化血紅蛋白等含量的測(cè)定[24,31,32,36-43]。

此外，還可以將蛋白質(zhì)消解為無(wú)機(jī)態(tài)，然后通過(guò)同位素稀釋電感耦合等離子體質(zhì)譜(ID-ICP-MS)的方式，使用34S作為同位素稀釋劑，測(cè)定消解液中的32S，再進(jìn)行含S雜質(zhì)校正后，計(jì)算得到蛋白質(zhì)的含量。Lee等[44]用這種方法分析了溶液中人生長(zhǎng)激素的含量。Schauml?ffel等[45]采用柱前同位素稀釋結(jié)合納升級(jí)高效液相色譜與ICP-MS實(shí)現(xiàn)了肽段的準(zhǔn)確定量。采用ID-ICP-MS定量牛血清白蛋白、超氧化物歧化酶和金屬硫蛋白的工作也有報(bào)道[46]。

2.2 復(fù)雜基體中肽或蛋白質(zhì)含量的同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定

血清等復(fù)雜基體中小肽含量的同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)定與復(fù)雜基體中小分子的同位素稀釋質(zhì)譜定量沒(méi)有本質(zhì)差別，同位素標(biāo)記肽段一般以同位素標(biāo)記氨基酸為原料通過(guò)固相合成的方法得到，要求標(biāo)記肽段與非標(biāo)記肽段之間的質(zhì)荷比相差3以上。如果樣品基質(zhì)過(guò)于復(fù)雜可通過(guò)沉淀蛋白等操作去除或降低基質(zhì)的干擾；當(dāng)樣品中目標(biāo)肽段含量較低時(shí)，可采用固相萃取、親和捕獲等方式對(duì)目標(biāo)肽段進(jìn)行富集后測(cè)定。質(zhì)譜檢測(cè)通常采用MRM模式進(jìn)行，要求肽段母離子和子離子的質(zhì)荷比都在三重串聯(lián)四級(jí)桿的檢測(cè)范圍內(nèi)，采用單點(diǎn)法或括號(hào)法對(duì)肽段進(jìn)行定量。

對(duì)于分子量較大的蛋白質(zhì)，現(xiàn)有的質(zhì)譜技術(shù)難以采用MRM模式直接對(duì)完整的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，需要將蛋白酶解成肽段后，從中選擇特異性的肽段進(jìn)行同位素稀釋質(zhì)譜的定量，根據(jù)酶切特異性肽段的含量，間接計(jì)算出基體中蛋白質(zhì)的含量。加入的同位素內(nèi)標(biāo)可以是同位素標(biāo)記肽段或同位素標(biāo)記的目標(biāo)蛋白。使用同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，酶切效率對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定準(zhǔn)確度有顯著影響，必須保證酶切的完全。如果酶切不完全，需要對(duì)酶切效率進(jìn)行校正才能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。王洋等[47]研究發(fā)現(xiàn)，采用同位素標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)對(duì)溶液中β-乳球蛋白定量時(shí)，酶切效率只有75.7%；若在奶粉基質(zhì)中進(jìn)行酶切，酶切效率僅為6.1%，如果不進(jìn)行酶切效率校正，誤差將是顯著的。但是，當(dāng)進(jìn)行兩個(gè)蛋白含量比例測(cè)定如糖化血紅蛋白(HbA1c)含量測(cè)定時(shí)[43]，結(jié)果為糖化血紅蛋白和糖化與非糖化血紅蛋白總和的比值，這兩個(gè)蛋白比較接近，酶切效率也接近，實(shí)驗(yàn)觀察到隨著酶切時(shí)間的進(jìn)行，雖然酶切一直在進(jìn)行中尚未達(dá)到完全酶切，但是計(jì)算出來(lái)的比例基本恒定，因此，在采用同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定兩個(gè)相近蛋白含量之比時(shí)，可以不進(jìn)行酶切效率的校正。Kilpatrick等[48]采用該技術(shù)建立了血清中C反應(yīng)蛋白準(zhǔn)確定量的參考測(cè)量程序。

使用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，由于標(biāo)記蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)一致，因此酶切效率也認(rèn)為相同，從而大大降低了酶切效率對(duì)基體中蛋白質(zhì)含量測(cè)量準(zhǔn)確度的影響，一般情況下酶切效率的影響可以忽略不計(jì)。同位素標(biāo)記蛋白有兩種獲得方式，一種是體外通過(guò)同位素親和標(biāo)簽試劑分別與純蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)標(biāo)記條件的優(yōu)化確保標(biāo)記效率接近100%，并通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)標(biāo)記蛋白的分子量和LC-MS檢測(cè)標(biāo)記后特異性肽段等方式進(jìn)行確認(rèn)。然后將標(biāo)記好的標(biāo)準(zhǔn)品與樣品充分混合均勻后進(jìn)行酶切，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)標(biāo)記與非標(biāo)記肽段的峰面積比值，并根據(jù)加入的純蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的量計(jì)算出基體中目標(biāo)蛋白的含量。此種方法無(wú)需基因克隆和同位素標(biāo)記蛋白表達(dá)純化等步驟，方便快捷。在使用商品化的同位素親和標(biāo)簽試劑進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，應(yīng)進(jìn)行同位素豐度的校正。李佳樂(lè)等[22]采用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽試劑(tandem quality label reagents,TMT)獲得標(biāo)記的人轉(zhuǎn)鐵蛋白，進(jìn)而建立了血清中人轉(zhuǎn)鐵蛋白的準(zhǔn)確定量方法。第二種獲取同位素標(biāo)記蛋白的方式是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，在同位素培養(yǎng)基上通過(guò)原核表達(dá)或真核表達(dá)等方式，獲得同位素標(biāo)記的目標(biāo)蛋白。將純化后的同位素標(biāo)記蛋白分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中進(jìn)行酶切，選擇特異性的肽段通過(guò)同位素稀釋質(zhì)譜方法進(jìn)行定量。最后根據(jù)測(cè)得的特異性肽段的含量及該肽段在目標(biāo)蛋白中的重復(fù)次數(shù)，計(jì)算出復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)蛋白的準(zhǔn)確含量。同樣，當(dāng)基質(zhì)有可能影響準(zhǔn)確定量時(shí)，可通過(guò)蛋白沉淀等方式降低或去除基質(zhì)干擾；當(dāng)目標(biāo)物濃度較低時(shí)，可采用固相萃取、反相色譜、親和捕獲等方式，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集與凈化。Pritchard等[49]采用該方法建立了血清中人生長(zhǎng)激素的準(zhǔn)確定量方法。

3 定量核磁法

定量核磁共振技術(shù)(qNMR)是一種基于核磁共振原理的定量分析技術(shù)。該技術(shù)是通過(guò)向待測(cè)樣品中添加含量已知的標(biāo)記物，然后根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、選定的定量積分信號(hào)以及產(chǎn)生該信號(hào)的質(zhì)子數(shù)，代入計(jì)算公式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)含量的檢測(cè)。定量核磁共振波譜由于積分面積與質(zhì)子數(shù)的線性關(guān)系，將分子精細(xì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定與絕對(duì)定量結(jié)合在一起。由于其操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，不需要自身對(duì)照品就可以進(jìn)行含量的測(cè)定，定量和定性測(cè)定可以同時(shí)進(jìn)行，而且測(cè)定的是完整的肽段，因此該技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。該方法的缺點(diǎn)是當(dāng)分子變大時(shí)，譜峰會(huì)發(fā)生重疊且很難選擇合適的內(nèi)標(biāo)，因此不適用于大分子蛋白質(zhì)的含量分析。

Huang等[50]在qNMR的基礎(chǔ)上增加了質(zhì)子交換以去除多余的可交換峰，該方法使用安賽蜜作為內(nèi)標(biāo)分析了纈氨酸和肽T5。對(duì)于纈氨酸，其日內(nèi)CV為0.052%，而8個(gè)月內(nèi)的日間CV為0.071%。對(duì)于T5肽，與基于氨基酸的同位素稀釋質(zhì)譜法相比，操作更簡(jiǎn)單，分析時(shí)間更短且CV較小。該方法極大地提高了qNMR對(duì)小分子化合物的定量精度，并將qNMR的應(yīng)用范圍從小分子化合物擴(kuò)展到了肽。Josephs等[23]和Melanson等[16]以馬來(lái)酸為內(nèi)標(biāo)，分別確定了血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ的肽純度。Zhang等[51]采用高效液相色譜法和核磁共振定量技術(shù)，建立了一種人C肽樣品含量測(cè)定方法。Ma等[52]采用HPLC和qNMR相結(jié)合的方法測(cè)定人胰島素(human insulin，HI)的純度，拓展了qNMR在分子量為5 800 Da左右的蛋白質(zhì)上的應(yīng)用，表明該方法可廣泛應(yīng)用于大分子蛋白質(zhì)純度的檢測(cè)。

4 電噴霧-差分電遷移-顆粒計(jì)數(shù)法

電噴霧-差分電遷移-顆粒計(jì)數(shù)是近幾年新發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)，該系統(tǒng)由3個(gè)部分組成，如圖2所示：①帶有電荷中和器的電噴霧氣溶膠發(fā)生器(electrospray aerosol generator，ES)，其中電荷中和器用于中和液滴所帶電荷數(shù)，將液滴上的電荷降低到修正的玻爾茲曼電荷分布，使大多數(shù)帶電液滴只帶一種電荷；②差分電遷移率分析器(differential electromigration analyzer，DMA)，它根據(jù)粒子大小與電荷之比獲得粒子電遷移率分布，通過(guò)改變其操作電壓，可以選擇不同大小的蛋白質(zhì)；③冷凝粒子計(jì)數(shù)器(condensing particle counter，CPC)，用來(lái)計(jì)數(shù)由差分電遷移率分析器選擇的粒子。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)分子單體和二聚體的計(jì)數(shù)分析并依據(jù)泊松分布進(jìn)行擬合，即可在無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品的情況下得到蛋白質(zhì)分子的含量，是一種絕對(duì)分析方法。Li等[53]采用該技術(shù)建立了牛血清白蛋白和單克隆抗體的絕對(duì)定量方法；陳琰等[54]也采用該技術(shù)對(duì)牛血清白蛋白的準(zhǔn)確定量進(jìn)行了研究；Noémie等[55]用該方法分析了生物血清樣品中脂蛋白的含量，最后的結(jié)果與免疫濁度法測(cè)定結(jié)果一致。

圖2 ES-DMA-CPC示意圖Fig.2 Diagram of ES-DMA-CPC

5 高效液相-圓二色光譜技術(shù)

圓二色光譜是根據(jù)手性物質(zhì)對(duì)左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)(ε)相等的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)分子構(gòu)型或構(gòu)象進(jìn)行分析的技術(shù)。長(zhǎng)期以來(lái)，圓二色光譜主要用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的測(cè)定。一般情況下，一對(duì)手性化合物如D和L構(gòu)型的氨基酸，具有大小一致、方向相反的圓二色光譜信號(hào)，當(dāng)左旋和右旋的化合物等量時(shí)，化合物處于消旋狀態(tài)，其圓二色光譜信號(hào)為0。這一點(diǎn)非常類似于天平和砝碼的關(guān)系。圓二色光譜儀好比天平，當(dāng)一對(duì)手性化合物的含量相等時(shí)，天平居中，圓二色信號(hào)為0。根據(jù)這一特點(diǎn)，可以使用D型的氨基酸對(duì)L型氨基酸定量。天然蛋白質(zhì)都是由L型氨基酸組成，水解后將形成L型氨基酸的混合液，因此通過(guò)高效液相色譜-圓二色光譜聯(lián)用的方式，以已知純度的D型氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)，可以測(cè)定出水解液中L型氨基酸的含量，再根據(jù)L型氨基酸的含量計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。Luo等[56]以L-苯丙氨酸為例，介紹了一種基于高效液相色譜-圓二色光譜的定量方法。其定量結(jié)果與傳統(tǒng)同位素稀釋質(zhì)譜法得到的結(jié)果吻合較好。由于光譜法的重復(fù)性優(yōu)于質(zhì)譜法，因此高效液相-圓二色光譜法結(jié)果的測(cè)量不確定度可優(yōu)于同位素稀釋質(zhì)譜法。但是該方法與同位素稀釋質(zhì)譜法一樣，無(wú)法克服水解過(guò)程引入的誤差，并且由于圓二色光譜靈敏度不如同位素稀釋質(zhì)譜法，因此僅適合于高濃度蛋白溶液或純蛋白固體含量的測(cè)定，可作為傳統(tǒng)同位素稀釋質(zhì)譜方法的有益補(bǔ)充。Luo等[56]將該方法用于溶液中游離氨基酸和胰島素的定量，結(jié)果與同位素稀釋質(zhì)譜方法得到的結(jié)果一致。

6 展望

隨著生命科學(xué)的進(jìn)步和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)蛋白質(zhì)計(jì)量技術(shù)的需求將愈發(fā)迫切。當(dāng)前蛋白質(zhì)含量計(jì)量技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，并已建立起質(zhì)量平衡、同位素稀釋質(zhì)譜、定量核磁、電噴霧-差分電遷移-顆粒計(jì)數(shù)、高效液相色譜-圓二色光譜等計(jì)量技術(shù)，基本上可以解決蛋白質(zhì)純品及基體中蛋白質(zhì)含量準(zhǔn)確測(cè)定問(wèn)題。各種計(jì)量技術(shù)都有其各自的優(yōu)勢(shì)與不足，如表1所示。未來(lái)，蛋白質(zhì)含量一方面將繼續(xù)發(fā)展建立單分子計(jì)數(shù)等新的計(jì)量手段，另一方面將把現(xiàn)有計(jì)量手段進(jìn)一步擴(kuò)展到大分子蛋白、帶有翻譯后修飾的蛋白及復(fù)雜基體中痕量蛋白含量的準(zhǔn)確測(cè)定中，從而保證蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可比，提升我國(guó)生物產(chǎn)品質(zhì)量，加速我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

表1 蛋白質(zhì)含量計(jì)量技術(shù)的比較Table 1 Comparison of protein content metrology techniques