楊佳怡,陳桂芳,高運華,王志棟,吳梟

1.中國計量科學研究院， 北京 100029 2.沈陽化工大學化學工程學院， 沈陽 110142

2008年，德國癌癥研究中心的科學家Harald zur Hausen因發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒(HPV)導致宮頸癌而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎?；谒难芯抗ぷ?，HPV獲得性預防疫苗快速發(fā)展，顯著降低了女性罹患宮頸癌的風險[1]。與此同時，HPV的檢測在宮頸癌的篩查和診斷過程中發(fā)揮著重要的作用。在了解HPV基因功能與作用機制的基礎上，研究者研發(fā)了多種針對HPV核酸的檢測方法，進而形成了商品化的檢測試劑盒。在基于PCR擴增的HPV DNA檢測試劑盒中，多數(shù)將編碼衣殼蛋白L1的基因作為檢測的目標區(qū)域，少數(shù)針對E1、E2基因或多種不同基因同時進行檢測[2-3]。隨著對癌變發(fā)生機制的深入研究，E6/E7 mRNA水平受到廣泛的關注，也是HPV RNA檢測的主要內容[4]。值得注意的是，HPV核酸檢測過程存在一些影響因素，例如病毒裂解與DNA提取和純化效率、引物探針的通用性等；對于熒光定量PCR過程，標準曲線的準確性將直接影響測量結果。上述多種影響因素可能導致檢測結果缺乏可比性，從而誤導對病情的判斷，不利于及時干預治療。具有確定量值的標準物質可以對不同的檢測試劑盒進行計量校準，提升檢測的準確性。本文討論了用于HPV核酸檢測過程的標準物質研究進展，分析了不同形式的標準物質候選物的特性，為進一步提升HPV檢測結果的準確性提供了參考。

1 高危型HPV常見檢測方法

人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種無包膜的雙鏈閉環(huán)DNA病毒，其基因組包括3個功能區(qū)：非編碼上游調控區(qū)(URR)、早期轉錄基因(E1、E2、E4、E5、E6和E7)、晚期轉錄基因(L1和L2)[5]。早期蛋白與病毒的細胞轉化功能及致癌作用關系密切[6]；L1和L2是HPV的主要和次要衣殼蛋白，共同形成病毒的衣殼，參與HPV感染細胞的過程。L1具有自組裝的功能，L2不能單獨自組裝但可以與L1共同組裝成病毒顆粒[7]。按照感染引起疾病的嚴重程度，HPV可以分為低危型(HPV6、11、40、42等)和高危型(HPV16、18、52、58等)，高危型HPV感染與宮頸癌的發(fā)生具有密切關聯(lián)[8]。已有研究證明，高危型HPV16、18中的E6蛋白能與細胞中的p53蛋白結合并導致p53蛋白的降解，從而破壞p53抑制腫瘤發(fā)生的作用[9]；E7蛋白則導致另一種抑制腫瘤發(fā)生的Rb蛋白降解[10]，E6、E7可以導致兩種重要的腫瘤抑制蛋白發(fā)生降解，解釋了宮頸癌形成的重要機制。大部分的HPV感染可以被人體清除，只有高危型HPV的持續(xù)感染才會導致癌癥的發(fā)生[11]。宮頸癌早期沒有明顯的臨床癥狀，因此針對HPV的檢測對于相關疾病的及時篩查與治療具有重要意義。

基于PCR擴增技術對HPV核酸進行分析是HPV檢測最常見的方法。對HPV DNA進行檢測可以診斷HPV的感染，并分析發(fā)生感染的HPV分型。現(xiàn)有的HPV DNA檢測方法，主要針對L1基因的保守性區(qū)域設計PCR引物[12-13]，PCR擴增完成后，可以利用反向雜交法對HPV進行分型分析[14]。一些檢測試劑盒基于熒光定量PCR技術，通過特異性的熒光探針，可以實現(xiàn)對特定亞型HPV的半定量檢測[15-16]。在熒光定量PCR反應中，對多重熒光信號分別檢測，可以同時實現(xiàn)HPV的分型與定量檢測，提高了檢測的效率[17]。HPV致病機制的研究揭示E6/E7 mRNA含量與病變過程密切相關[18]，因此E6/E7 mRNA的檢測也受到了越來越多的關注，已有研究者開發(fā)了針對E6/E7 mRNA的檢測試劑盒：利用逆轉錄酶和RNA聚合酶對RNA擴增，結合熒光標記的DNA探針進行檢測[3]。在分析比較HPV DNA和RNA檢測結果參考意義的探討中，有研究者提出，在HPV DNA檢測結果為陰性的情況下，判斷健康的參考性更好，而在HPV RNA陽性的情況下，判斷患病的參考性更好[19]。對于發(fā)生癌前病變的細胞(CIN3+)，兩種檢測方法均表現(xiàn)出較好的靈敏性，且具有較高的符合率[20]。

2 HPV核酸檢測過程的影響因素

對于基于PCR擴增的檢測方法，需要在反應前對樣品中的核酸進行提取，在針對人類巨細胞病毒DNA的定量檢測中，研究者證明了DNA提取過程的效率直接影響后續(xù)的測量結果[21]；在本團隊前期工作中，觀察到不同逆轉錄試劑盒導致豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA檢測結果表現(xiàn)出顯著差異[22]，提示為了全面理解核酸檢測結果，應充分考慮DNA提取或RNA逆轉錄過程的影響。在檢測HPV核酸的過程中，不同試劑盒提取DNA或逆轉錄RNA采用的試劑和方法不同，可能會對檢測結果造成影響。與此同時，對于使用通用型引物進行檢測的試劑盒，引物與不同亞型的HPV基因擴增區(qū)域的結合能力有所區(qū)別，在檢測HPV混合性感染的樣品時，可能會導致部分漏檢[23]。不同試劑盒引物和探針設計方法存在差異，其差異可能造成檢出限不同，從而導致檢測樣品的有效范圍不同[13,24]。在以上影響因素之外，不同檢測實驗室中定量PCR儀等相關儀器的運行狀態(tài)、實驗人員操作的規(guī)范程度都可能影響檢測結果。在缺乏計量標準的情況下，不同檢測試劑盒測量的結果難以做到完全一致可比，可能影響判斷的準確性并導致重復檢測造成的浪費。

熒光定量PCR的基本原理是測量PCR擴增過程中積累的熒光信號，在進行定量檢測的過程中依賴于標準曲線[25]。一般采用已知量值的工作標準物質繪制標準曲線，工作標準物質的量值準確性和溯源性是保證檢測結果可信度的關鍵，根據(jù)GB/T 21415—2008《體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》規(guī)定：為某一校準品或正確度控制品的一個指定值所賦的值的測量正確度取決于該值通過不同測量程序和測量標準(校準品)的不間斷比較鏈而具有計量學溯源性，比較鏈逐級向上,測量不確定度不斷減小。然而我國目前尚無針對核酸檢測試劑盒溯源性的明確技術要求[26]，這樣的情況也將導致不同的檢測試劑盒定量檢測的結果存在差異。

3 HPV標準物質與參考品的研究

為了提高HPV檢測結果的準確性和一致性，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)在2008年針對兩種高危型HPV16和HPV18，構建了包含全基因組序列的重組質粒，作為核酸標準物質對來自13個國家不同實驗室的定性和定量檢測結果進行了比對[27]。隨后，利用類似的方法，WHO還研制了包含2種低危型(HPV6、11)和5種高危型(HPV31、33、45、52、58)的核酸標準物質[28]。然而國際標準物質不易購買，很難滿足國內計量校準的巨大需求。國內的研究者相繼研制了包含HPV L1基因序列和全基因組基因序列的重組質粒DNA標準物質和質控品，涵蓋了常見的低危和高危HPV亞型，為HPV DNA分型與檢測過程提供了參考[29-31]。常見的檢測參考品形式還包括滅活的臨床樣品、細胞系以及假病毒等，下文將進行詳細的介紹。

3.1 重組質粒DNA標準物質和參考品

在世界衛(wèi)生組織的組織和管理下，英國國家生物標準品和參考品研究所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)于2008年建立了第一個包含全基因組序列的HPV16(1×107IU·mL-1；International Unit, IU)和HPV18(1×107IU·mL-1)國際標準物質。其定值方法是通過分光光度法測定量值后，對標準物質直接賦值：在260 nm處測定標準物質原液的吸光度值并根據(jù)質粒分子量計算其濃度(genome equivalents·mL-1, GE·mL-1)，按一定比例稀釋到1×107GE·mL-1，分裝0.5 mL·瓶-1，凍干后賦值為5×106IU·瓶-1[27]。在此基礎上，NIBSC補充建立了7種HPV基因型的標準物質。定值時以已有標準物質為參照，使用實時熒光定量PCR建立標準曲線，并在不同實驗室對多種檢測試劑方法進行了評估比較[28]。

我國衛(wèi)生部臨床檢驗中心參考國際標準物質研制方法，建立了以人基因組DNA為基質的HPV16、18全基因組重組質粒DNA標準物質。使用4種實時熒光PCR試劑聯(lián)合測試，通過國際標準物質建立標準曲線完成定值，并計算不確定度，HPV16標準物質量值為(7.1±1.0)×106IU·mL-1，HPV18標準物質量值為(3.5±0.7)×106IU·mL-1；上海市臨床檢驗中心、廣州邦德盛生物科技有限公司等單位也分別研制了HPV16和HPV18全基因組重組質粒DNA的國家有證標準物質。這些標準物質具有確定量值和不確定度,量值均可溯源至國際標準物質HPV16或HPV18，表1中列舉了我國現(xiàn)有的可查詢的HPV核酸檢測的有證標準物質。

表1 HPV核酸檢測有證標準物質Table 1 List of certified reference materials for HPV nucleic acid detection

衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備了7種常見HPV基因型(HPV6、11、31、33、39、51、52)的全基因組重組質粒DNA參考品并進行了定值：采用分光光度法測定重組質粒在260 nm處的吸光度值，根據(jù)質粒分子量計算得到GE·mL-1濃度值，用含人基因組DNA的BSA溶液梯度稀釋至106GE·mL-1和105GE·mL-1[29]；中國藥品生物制品檢定所建立的包含L1基因的重組質粒DNA參考品，涵蓋常見的30種HPV基因型[30]；中國食品藥品檢定研究院建立了包含20種HPV基因型的全基因組重組質粒DNA參考品，經(jīng)1 mg·mL-1人基因組溶液稀釋至106copies·mL-1[31]；長春理工大學也建立了涵蓋14種中高危型和6種低危型的HPV全基因組重組質粒DNA參考品；將不同基因型參考品測定濃度值后統(tǒng)一調為50 pg·mL-1(108～109copies·mL-1)[32]；利用HPV DNA分型參考品，可以對相關試劑盒和實驗室的HPV分型檢測過程進行質量評估。

3.2 陽性臨床樣品參考品

臨床檢測實驗室的研究人員曾報道采用臨床樣品制備參考品進行室內質量控制：獲取低危型(HPV6/HPV11)和高危型(HPV16/HPV18)的臨床樣品，經(jīng)滅活、稀釋后配制室內參考品，用于HPV檢測的室內質量控制[33]。宮頸癌細胞系也被用作質控參考品，上海市臨床檢驗中心采用整合有L1基因的人宮頸癌細胞系(SiHa和HeLa)作為HPV16和HPV18檢測參考品，用實時熒光PCR試劑盒檢測，通過國際標準物質建立標準曲線計算定值為106IU·mL-1，梯度稀釋為不同濃度的參考品[34]。衛(wèi)生部臨床檢驗中心建立了HPV16/HPV18雙陽性的參考品：將載有HPV16基因的重組質粒轉染已包含HPV18的人宮頸癌細胞系(HeLa)，滅活后獲得同時含HPV16/HPV18基因組DNA的參考品，通過熒光定量PCR進行檢測[35]。與質粒DNA相比，滅活后的臨床樣品更加接近臨床樣品的狀態(tài)，可以為臨床實驗室間的質量評估提供參考。

3.3 假病毒形式的參考品

近年來，假病毒技術的不斷發(fā)展為HPV標準物質和參考品的研制提供了新的工具，假病毒可以攜帶外源病毒的特定基因片段，因為不包含外源病毒的完整基因，假病毒只能對細胞進行“一次性”感染，在研究致病性病毒的過程中具有較好的安全性[36]；假病毒顆粒具有衣殼蛋白包裹核酸的完整結構，更接近真實病毒樣品的狀態(tài)，可以對病毒顆粒裂解、核酸提取純化以及PCR擴增與檢測的全過程進行質量控制。在衣殼蛋白的保護下，假病毒可以更好的抵抗核酸酶降解，利于在運輸和儲存過程中保持其穩(wěn)定性。針對高危型HPV的衣殼蛋白編碼基因(L1、L2)，研究者制備了同時包含熒光蛋白報告基因的假病毒顆粒，并將其應用于血清中的免疫原性檢測[37-38]。在癌癥發(fā)病進程的診斷中，HPV E6/E7 mRNA水平逐漸受到更多的關注，利用大腸桿菌表達體系，研究者制備了包含E6/E7 RNA的假病毒質控品，并通過反轉錄-熒光定量PCR的方法進行了定值，為HPV E6/E7 mRNA檢測試劑的應用提供了參考[39]。表2總結了WHO研制的和國內常見的用于HPV核酸檢測的標準物質和參考品。

表2 常見用于HPV核酸檢測的標準物質和參考品Table 2 List of reference materials for HPV nucleic acid detection

3.4 分析比較

HPV質粒DNA標準物質和參考品的應用過程中，雖然通過加入人類基因組DNA，可以一定程度上模擬檢測過程中的基質效應，但質粒DNA作為質控時，其應用范圍僅限于DNA擴增和檢測環(huán)節(jié)，很難對病毒顆粒裂解、DNA提取與純化等步驟的效率進行考察[27]。雖然現(xiàn)階段HPV核酸標準物質還是以質粒DNA的形式為主，但其明顯的局限性也提示了研制不同形式標準物質的重要性。臨床樣品作為參考品存在的問題是來源不夠穩(wěn)定，細胞系建立與培養(yǎng)的過程較為復雜。而假病毒不僅包含檢測目標基因同時具有衣殼蛋白結構、操作安全、存儲穩(wěn)定，可以作為未來HPV核酸標準物質重點關注和研究的方向。

4 展望

標準物質是指足夠均勻且具有確定的特征，用以校準測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質。標準物質具有復現(xiàn)、保存和傳遞量值的作用，是保證測量結果準確性與可溯源性的重要計量“器具”，為了進一步提升HPV核酸檢測的有效性，標準物質的研制工作必不可少。質粒DNA形式的標準物質無法對DNA提取純化等過程進行質控，應用范圍有所限制。假病毒具有安全穩(wěn)定、包含完整病毒結構的優(yōu)勢，適用于相關試劑盒的整體檢測過程，可以作為核酸標準物質的候選物質。HPV致病機制的前期研究，揭示了不同基因的調控作用和編碼蛋白的生物學功能，為檢測目標的選擇提供了基礎。結合假病毒技術開展HPV標準物質的研究工作，有助于提升HPV檢測的有效性，從而促進女性宮頸癌的準確診斷和及時治療，改善患者的生存質量。與此同時，標準物質也將幫助解決眾多檢測試劑盒量值溯源混亂的問題，為實現(xiàn)量值準確可比提供計量支撐。