王尚君,董蓮華

1.南京市計(jì)量監(jiān)督檢測院, 南京 210049; 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院, 北京 100029

數(shù)字PCR儀是一種采用絕對(duì)核酸定量技術(shù)，即通過極限稀釋，將待測核酸均勻分散到相互分離的大量的微小反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中含有一個(gè)或零個(gè)待測核酸分子，經(jīng)過PCR反應(yīng)后，采集終點(diǎn)熒光信號(hào)，基于泊松分布對(duì)核酸起始濃度進(jìn)行絕對(duì)定量的儀器[1]。

1999 年，Vogelstein等[2]首次正式提出了數(shù)字PCR的概念，以96孔板和384孔板作為反應(yīng)器，定量研究了結(jié)直腸癌的KRAS 基因突變，并為數(shù)字PCR指明了設(shè)置更多反應(yīng)單元以獲得更高檢測靈敏度的發(fā)展方向。但是在這一時(shí)期，由于操作復(fù)雜、耗費(fèi)人工、樣品分散的數(shù)量不足、通量低和均勻性欠佳等因素，數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展受到了極大的限制。近二十年來，隨著微流控與微納加工技術(shù)的進(jìn)步，數(shù)字PCR技術(shù)突破了原有的技術(shù)瓶頸，得到了快速的發(fā)展，并實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室到商業(yè)化的跨越[3-4]。目前市場上使用的數(shù)字PCR儀根據(jù)PCR反應(yīng)單元形式的不同可分為三大類：①基于微流控芯片的數(shù)字PCR系統(tǒng)。該類平臺(tái)主要采用微納加工技術(shù)加工出具有大量微管和微腔室的芯片，采用集成化微泵微閥對(duì)液流進(jìn)行引入和分隔，實(shí)現(xiàn)樣品的檢測[5]?；谖⒘骺匦酒纳虡I(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)有美國Fluidigm公司的Biomark和德國Qiagen公司的QIAcuity。②基于微孔的數(shù)字 PCR 系統(tǒng)。該類平臺(tái)主要采用微納加工技術(shù)加工出超高密度親疏水微孔陣列芯片，利用芯片表面被處理成疏水、而微孔內(nèi)部為親水的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高通量的獨(dú)立微反應(yīng)[6-9]?；谖⒖椎纳虡I(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)有美國Life-technologies公司的QuantStudio 3D、新加坡JN MEDSYS公司的ClarityTM 數(shù)字PCR系統(tǒng)。③基于微滴的數(shù)字PCR系統(tǒng)。該類平臺(tái)主要通過微滴發(fā)生器將乳化液滴分散成大小均一的納升級(jí)至皮升級(jí)的液滴反應(yīng)單元，樣品在微滴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)[10-12]。目前，基于微滴的國外商業(yè)化數(shù)字PCR系統(tǒng)有美國Bio-Rad公司的QX100、QX200、QX ONE，法國 Stilla Technologies公司的Naica System。近些年來，國內(nèi)數(shù)字PCR儀的研發(fā)也蓬勃發(fā)展，如銳訊生物公司的DropX-2000、新羿公司的TD-1、小海龜公司的BioDigital等。

與傳統(tǒng)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)相比，數(shù)字PCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測靶向序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)熒光定量PCR更加出色的靈敏度、特異性和精確性，數(shù)字PCR被迅速應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面體現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可，其在臨床診斷[13]、轉(zhuǎn)基因成分定量[14]、致病微生物檢測[15]、下一代測序(next-generation sequencing, NGS)文庫精確定量和結(jié)果驗(yàn)證[16]等方面逐漸發(fā)揮重要作用。目前，數(shù)字PCR法作為轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品檢測和品系定量的標(biāo)準(zhǔn)方法被寫入了國家標(biāo)準(zhǔn)[17-18]，并已經(jīng)頒布實(shí)施，作為微生物痕量殘留測定方法的國家標(biāo)準(zhǔn)已通過批準(zhǔn)，在經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的相應(yīng)檢測實(shí)驗(yàn)室和分析測試中心將使用數(shù)字PCR儀提供對(duì)外檢測的數(shù)據(jù)。然而，數(shù)字PCR儀的國家產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和校準(zhǔn)規(guī)范尚未發(fā)布，國外也未發(fā)布相應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)，已發(fā)布的JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》只能針對(duì)數(shù)字PCR平臺(tái)中獨(dú)立的PCR儀的溫度控制系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，而數(shù)字PCR系統(tǒng)的擴(kuò)增過程包括樣品分散、樣品熱循環(huán)和樣品檢測，僅僅對(duì)獨(dú)立的溫控系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)無法反應(yīng)儀器的真實(shí)性能[19]。如何提升國產(chǎn)品牌數(shù)字PCR儀的研發(fā)質(zhì)量，保證實(shí)驗(yàn)室及檢測機(jī)構(gòu)內(nèi)的數(shù)字PCR儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，已成為亟待解決的難題。

目前，國內(nèi)外計(jì)量機(jī)構(gòu)按照機(jī)構(gòu)內(nèi)部確認(rèn)的方法對(duì)數(shù)字PCR儀進(jìn)行校準(zhǔn)。據(jù)了解，國內(nèi)計(jì)量機(jī)構(gòu)有選取溫度示值誤差、溫度均一性、升降溫速率、拷貝數(shù)示值誤差、拷貝數(shù)重復(fù)性、微滴熒光強(qiáng)度重復(fù)性和微滴個(gè)數(shù)重復(fù)性作為性能指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)評(píng)定。Bio-Rad在對(duì)微滴式數(shù)字PCR儀開展3Q確認(rèn)時(shí)，分別進(jìn)行了光路校準(zhǔn)和液路驗(yàn)證，對(duì)分離室的個(gè)數(shù)、熒光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度變異性等參數(shù)進(jìn)行了確認(rèn)。

本研究對(duì)國內(nèi)市場上數(shù)字PCR儀做了調(diào)研，對(duì)不同種類的數(shù)字PCR儀進(jìn)行了比較分析，剖析其計(jì)量技術(shù)指標(biāo)，以期探尋一套簡單適用的校準(zhǔn)方法，供使用單位和計(jì)量部門參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選用GBW09857人(女性)基因組DNA定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國計(jì)量科學(xué)研究院)；電子天平選用XPE56微量分析天平(瑞士METTLER TOLEDO)；移液器選用10、100、200 μL(芬蘭 Biohit公司)；數(shù)字 PCR 儀選用 QX200 Droplet Digital PCR 系統(tǒng) (美國 Bio-Rad 公司)；離心機(jī)選用Minispin plus(德國Eppendorf公司)；引物及探針由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成；TE0.1溶液(10 mmol·L-1Tris, 0.1 mmol·L-1EDTA, pH 8.0)由實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀釋

經(jīng)查閱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值信息，可知標(biāo)準(zhǔn)值為6.30×104copy·μL-1。用TE0.1溶液將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至5 000 copy·μL-1，稀釋時(shí)用天平稱量，分別記錄取用的稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量。

1.3 關(guān)鍵參數(shù)的測量方法

1.3.1數(shù)字PCR參數(shù)的設(shè)定 數(shù)字PCR反應(yīng)體系為：ddPCR supermix for probes 10 μL，10 μmol·L-1的FAM標(biāo)記的探針對(duì)應(yīng)的前后引物各0.5 μL，10 μmol·L-1HEX標(biāo)記的探針對(duì)應(yīng)的前后引物各1.8 μL，10 μmol·L-1的FAM標(biāo)記的探針和HEX標(biāo)記的探針各0.1 μL，稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 μL，加ddH2O補(bǔ)足到20 μL。

校準(zhǔn)孔排布：1個(gè)微滴發(fā)成卡具備8個(gè)加樣孔，前6個(gè)設(shè)置為加入含樣品的ddPCR 預(yù)混液，后兩個(gè)加入含ddH2O的ddPCR預(yù)混液作為空白對(duì)照。

微滴生成：將含有樣品的20 μL ddPCR預(yù)混液與70 μL微滴生成油分別依次加入微滴發(fā)生卡，用膠墊封好后置于微滴生成儀生成微滴，將成功生成的40 μL微滴轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，用封膜儀封膜后，轉(zhuǎn)移至PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 變性10 min，變速溫度 (Ramp)2 ℃·s-1；94 ℃ 變性30 s，Ramp 2 ℃·s-1，58 ℃退火延伸1 min，Ramp 2 ℃·s-1，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；98 ℃延伸10 min，Ramp 2 ℃·s-1；12 ℃保存。

信號(hào)讀?。簲U(kuò)增結(jié)束后，將96孔板轉(zhuǎn)移至微滴讀取儀中進(jìn)行信號(hào)讀取，并運(yùn)用QuantaSoft軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到絕對(duì)定量的校準(zhǔn)結(jié)果。

1.3.2拷貝數(shù)濃度相對(duì)示值誤差 記錄含有待測樣品孔的拷貝數(shù)濃度，按公式(1)計(jì)算拷貝數(shù)濃度相對(duì)示值誤差。

(1)

1.3.3拷貝數(shù)濃度重復(fù)性 對(duì)稀釋后的樣品進(jìn)行6次重復(fù)測量，按公式(2)計(jì)算拷貝數(shù)濃度測量重復(fù)性。

(2)

1.3.4熒光通道一致性 分別用FAM通道測定得到的拷貝數(shù)濃度除以VIC通道測定得到的拷貝數(shù)濃度，得到比值的平均值來表征熒光通道定量的一致性。按公式(3)計(jì)算熒光通道一致性。

(3)

1.3.5反應(yīng)單元個(gè)數(shù)重復(fù)性 對(duì)稀釋后的樣品進(jìn)行6次重復(fù)測量，按公式(4)計(jì)算反應(yīng)單元個(gè)數(shù)測量重復(fù)性。

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 拷貝數(shù)濃度相對(duì)示值誤差與重復(fù)性

將人基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至目標(biāo)濃度5 000 copy·μL-1，經(jīng)天平稱量重量并記錄，計(jì)算得到實(shí)際稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)值為4 859 copy·μL-1。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重復(fù)測量6次，取FAM通道測定的樣品的平均值，計(jì)算相對(duì)示值誤差，并計(jì)算重復(fù)性。結(jié)果如表1所示，相對(duì)示值誤差為6.5%，重復(fù)性為0.7%。

表1 拷貝數(shù)濃度相對(duì)示值誤差和重復(fù)性校準(zhǔn)結(jié)果Table 1 Calibration data of copy number concentration relative indication error and repeatability

2.2 熒光通道一致性

分別用FAM通道測定得到的儀器示值的拷貝數(shù)濃度除以VIC通道測定得到的儀器示值的拷貝數(shù)濃度，得到的比值的平均值來表征熒光通道定量的一致性。二重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增熱圖見圖1，可見兩個(gè)通道的陰陽性微滴均明顯分開。檢測結(jié)果如表2所示，熒光通道一致性為1.04，理論的熒光通道的一致性為1.00。

圖1 二重?cái)?shù)字PCR特異性擴(kuò)增熱圖Fig.1 Double digital PCR specific amplification heat diagram.

表2 熒光通道一致性校準(zhǔn)結(jié)果Table 2 Calibration data of fluorescence channel consistency

2.3 反應(yīng)單元個(gè)數(shù)重復(fù)性

記錄讀取的微滴的個(gè)數(shù)，計(jì)算反應(yīng)單元個(gè)數(shù)的重復(fù)性。結(jié)果如表3所示，反應(yīng)單元個(gè)數(shù)均大于10 000，表明檢測結(jié)果可信度高，重復(fù)性為5.9%。

表3 反應(yīng)單元個(gè)數(shù)重復(fù)性校準(zhǔn)結(jié)果Table 3 Calibration data of repeatability of reaction units number

3 討論

為實(shí)現(xiàn)數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)方案的標(biāo)準(zhǔn)化，MIQE(minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments)指南提出在描述數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)生成的數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)發(fā)布一系列必要信息，如：每個(gè)分離室的平均拷貝數(shù)(λ)、反應(yīng)單元數(shù)目、有效分離單元的總體積等[20]。這些必要信息的數(shù)據(jù)都是數(shù)字PCR儀直接提供的，因此這些參數(shù)在數(shù)字PCR儀校準(zhǔn)時(shí)也應(yīng)密切關(guān)注。根據(jù)調(diào)研市場上不同品牌的數(shù)字PCR儀，了解到分離單元數(shù)目、分離室體積、動(dòng)態(tài)范圍、精密度、熒光通道為主要的官方列出的性能參數(shù)。經(jīng)過梳理共性參數(shù)，本文選擇拷貝數(shù)濃度相對(duì)示值誤差、拷貝數(shù)濃度重復(fù)性、熒光通道一致性和反應(yīng)單元個(gè)數(shù)重復(fù)性，作為數(shù)字PCR儀整機(jī)校準(zhǔn)的計(jì)量技術(shù)指標(biāo)。

數(shù)字PCR儀采用概率統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法，即通過泊松分布的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。為滿足泊松分布的要求，分離單元應(yīng)該足夠大，而當(dāng)生成的微滴數(shù)較少時(shí)，測得的陽性反應(yīng)單元數(shù)目偏低，使用泊松分布計(jì)算不合適，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，測定反應(yīng)單元個(gè)數(shù)的重復(fù)性，確保反應(yīng)單元數(shù)量均勻，可提高檢測結(jié)果的可信度。對(duì)數(shù)字PCR儀整機(jī)性能的校準(zhǔn)，應(yīng)使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以保證溯源性。為保證每個(gè)反應(yīng)單元里含有1個(gè)或0個(gè)目標(biāo)核酸分子，需要對(duì)高濃度的樣品進(jìn)行稀釋。待測樣品濃度過高有被高估的風(fēng)險(xiǎn)，而濃度過低會(huì)導(dǎo)致檢測的重復(fù)性差。本文將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至5 000 copy·μL-1，處于合理的拷貝數(shù)濃度范圍，保證了數(shù)字PCR測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。將定量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，得出拷貝數(shù)濃度相對(duì)示值誤差與重復(fù)性，可直觀地反映數(shù)字PCR儀的定量性能。熒光通道的一致性可以反映熒光檢測系統(tǒng)的性能，理想條件下，熒光通道的一致性應(yīng)為1.00，如果測量結(jié)果差別過大，可能是光路通道差異或熒光檢測靈敏度差異造成的。

本文通過在QX200數(shù)字PCR儀上的初步實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了校準(zhǔn)思路和方法的可行性，該方法操作性強(qiáng)，能夠滿足儀器技術(shù)要求以及用戶需求，為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的數(shù)字PCR儀的質(zhì)量控制提供了參考，提高了數(shù)字PCR儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)進(jìn)一步拓展和深化數(shù)字 PCR 技術(shù)的應(yīng)用具有積極的促進(jìn)作用。