鄭子繁,柳方方,劉衛(wèi)曉,金蕪軍,李亮

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

核酸的序列、多樣性和豐度分析是現(xiàn)代生物學(xué)的基礎(chǔ)。由于分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸定量技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，核酸定量技術(shù)也相應(yīng)地更新?lián)Q代：在傳統(tǒng)的定量PCR(quantitative PCR，qPCR)基礎(chǔ)上，數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[1]。1992年，Sykes等[2]報(bào)道了巢式PCR定量技術(shù)，巢式PCR技術(shù)是基于樣品稀釋和泊松分布數(shù)據(jù)處理成立的,同時(shí)他還提出了數(shù)字PCR的構(gòu)想。1997年，Kalinina等進(jìn)行了微升(μL)級(jí)的PCR反應(yīng)，使用毛細(xì)玻璃管作為反應(yīng)器，通過(guò)熒光探針收集到基因組DNA的單分子信號(hào)，進(jìn)而發(fā)展出了單分子定量技術(shù)[3]。1999年，Vogelstein和Kinzler[4]基于以上報(bào)道采用96孔板系統(tǒng)將PCR擴(kuò)增方法發(fā)展到了微升級(jí)，并對(duì)結(jié)腸癌的致癌突變基因ras進(jìn)行了定量分析。

早期數(shù)字PCR技術(shù)的反應(yīng)單元使用的是96/384孔板[2]。由于數(shù)字PCR技術(shù)的反應(yīng)單元數(shù)與靈敏度和準(zhǔn)確度成正相關(guān)，因此需要找到比普通的96/384孔板更高精度的反應(yīng)器才能滿足越發(fā)精密的檢測(cè)需要。為了提高精度，需要將反應(yīng)單元數(shù)目成倍提高，因此反應(yīng)體積從微升級(jí)精確到了納升級(jí)[3]，數(shù)字PCR技術(shù)也因此愈發(fā)成熟。

在許多診斷應(yīng)用和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中，能夠進(jìn)行準(zhǔn)確、可靠和可重復(fù)的核酸定量(DNA/RNA)是十分重要的[2]。為了準(zhǔn)確地定量核酸，需要用已知測(cè)量不確定性的量的靶核酸序列(拷貝數(shù)或拷貝數(shù)濃度)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[5]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(reference material，RM)是一種足夠均勻的，具有一種或多種相對(duì)容易確定的特性值的材料或物質(zhì)，可用于給材料賦值、評(píng)價(jià)測(cè)量方法及校準(zhǔn)測(cè)量?jī)x器等[6]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有通用屬性。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以用于定性檢測(cè)，也可以用于定量檢測(cè)。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值具有穩(wěn)定性、均勻性和準(zhǔn)確性，現(xiàn)已被越來(lái)越多地應(yīng)用在分析測(cè)量、國(guó)內(nèi)外貿(mào)易、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療衛(wèi)生、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、國(guó)防建設(shè)以及人民生活等各個(gè)領(lǐng)域[7]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分類方式多樣，按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域，ISO/REMCO將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為17大類：地質(zhì)學(xué)、核材料及放射性材料、有色金屬、塑料/橡膠/塑料制品、生物/植物/食品、臨床化學(xué)、石油、有機(jī)化工產(chǎn)品、物理學(xué)和計(jì)量學(xué)、物理化學(xué)、環(huán)境、黑色金屬、玻璃/陶瓷、生物醫(yī)學(xué)/藥物、紙、無(wú)機(jī)化工產(chǎn)品、技術(shù)和工程。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即為用于核酸擴(kuò)增技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一種。生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擁有已知的生物含量、活性和特性測(cè)定的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)和溯源體系，使得各生產(chǎn)單位在進(jìn)行產(chǎn)品的生產(chǎn)、研發(fā)和檢測(cè)時(shí)結(jié)果具有可比性。本文著重介紹了數(shù)字PCR的基本原理、類型，以及數(shù)字PCR目前在核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用進(jìn)展,以期為核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供參考。

1 數(shù)字PCR概述

目前，核酸定量的金標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)[5]。然而，這種定量方法需要將未知物與參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較[8]，這意味著如果使用了不同的標(biāo)準(zhǔn)或校準(zhǔn)物，不同實(shí)驗(yàn)室之間得到的結(jié)果將很難進(jìn)行對(duì)比。數(shù)字PCR是近些年的新興技術(shù)，無(wú)需外參曲線，能夠獨(dú)立精準(zhǔn)地對(duì)未知物進(jìn)行測(cè)量，目前已有很多文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了報(bào)道。

1.1 數(shù)字PCR的原理

數(shù)字PCR的基本原理是將含有靶核酸、引物、探針和主混合物的反應(yīng)混合物隨機(jī)分布到數(shù)百至數(shù)百萬(wàn)個(gè)均勻大小的納升或皮升分區(qū)中，使得一些分區(qū)含有靶分子的復(fù)合物，單分子間通過(guò)稀釋被分離，在單個(gè)分區(qū)中獨(dú)自進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后分析每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物[9]。每個(gè)分區(qū)的DNA模板數(shù)少于或者等于1個(gè)，這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)(或一個(gè)以上)DNA模板的分區(qū)是亮的，沒(méi)有DNA模板的分區(qū)就是暗的[10]，然后計(jì)算靶核酸拷貝數(shù)濃度。

數(shù)字PCR作為一種參考方法已在一些計(jì)量機(jī)構(gòu)使用，這種方法能夠?qū)⒖截悢?shù)濃度聯(lián)系到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[9,11-12]，將常規(guī)定量分子檢測(cè)中使用的校準(zhǔn)物質(zhì)追溯到國(guó)際單位制(SI)[13]。一項(xiàng)國(guó)際對(duì)比研究[14]表明，dPCR和qPCR結(jié)果之間具有極好的可比性，且dPCR具有更好的精確度。dPCR可以直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子數(shù)量且不需依靠任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)，只通過(guò)對(duì)單個(gè)分子計(jì)數(shù)就能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，因此有著相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。相較于qPCR而言，dPCR的關(guān)鍵特性列于表1。目前，dPCR逐漸應(yīng)用在量化DNA靶標(biāo)、稀有[10,15-16]病原體檢測(cè)[13,17]、病毒載量測(cè)試[18]、檢測(cè)食品中的轉(zhuǎn)基因成分[19]和大規(guī)模平行序列文庫(kù)的量化等方面。

1.2 數(shù)字PCR的分類

根據(jù)反應(yīng)單元形成方式的不同，數(shù)字PCR可分為微滴、微流控芯片和微滴芯片式數(shù)字PCR等。

1.2.1微滴數(shù)字PCR 微滴數(shù)字PCR基于乳液PCR(emulsion PCR)技術(shù)[12-13]，是使用微滴發(fā)生器來(lái)一次生成數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴，用這些很小的油包水微滴來(lái)作為數(shù)字PCR的樣品分散載體。通過(guò)油水不相溶的原理，油形成油膜將水包裹在其中，形成一個(gè)個(gè)微滴作為反應(yīng)室。PCR反應(yīng)結(jié)束后對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，含有陽(yáng)性樣品的微滴會(huì)有熒光信號(hào)(圖1)。微滴數(shù)字PCR以微滴為單位，PCR反應(yīng)體系體積更小，因此更容易進(jìn)行高通量實(shí)驗(yàn)，而且系統(tǒng)簡(jiǎn)單、成本低，是理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)。

圖1 微滴數(shù)字PCR原理Fig.1 Principle of droplet digital PCR

1.2.2微流控芯片數(shù)字PCR 微流控芯片數(shù)字PCR基于微流控芯片技術(shù)，能夠快速并準(zhǔn)確地將樣品流體分成若干個(gè)獨(dú)立的單元，從而進(jìn)行多步平行反應(yīng)。這種數(shù)字PCR得益于微流體技術(shù)、納米制造技術(shù)和微電子技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展，具有成本低、體積小和高通量的優(yōu)勢(shì)，是理想的數(shù)字PCR平臺(tái)[9，11]。目前使用微流控芯片技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)有Fluidigm公司的Bio-MarkTM基因分析系統(tǒng)、Life Technologies公司的QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。

1.2.3微滴芯片式數(shù)字PCR 法國(guó)Stilla Technologies公司專注于開(kāi)發(fā)新一代核酸絕對(duì)定量技術(shù)，其旗下品牌有NaicaTMCrystal全自動(dòng)微滴芯片數(shù)字PCR。數(shù)字PCR過(guò)程的唯一耗材是cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片——Sapphire芯片。樣品通過(guò)毛細(xì)通道網(wǎng)格以25 000～30 000個(gè)微滴陣列形式進(jìn)入2D芯片中，可稱作Crystal微滴，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)在芯片上實(shí)現(xiàn)，采用微滴成像技術(shù)檢測(cè)含有擴(kuò)增片段的微滴。最終對(duì)陽(yáng)性微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)得到精準(zhǔn)的核酸絕對(duì)數(shù)量[19]。

1.3 dPCR測(cè)量的影響因素

作為高精度參考方法，眾多影響因素都會(huì)對(duì)測(cè)量精度產(chǎn)生影響或造成測(cè)量結(jié)果的偏差，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)控制或盡可能縮小這些影響因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。目標(biāo)分子DNA濃度計(jì)算方法如式(1)所示。

(1)

式(1)中，P—陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)，R—反應(yīng)總數(shù)，VR—反應(yīng)體積，D—稀釋因子。如等式(1)所示，反應(yīng)總數(shù)和陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)計(jì)數(shù)的多少會(huì)直接影響靶DNA拷貝數(shù)濃度，而制備PCR反應(yīng)體系過(guò)程中樣品的稀釋產(chǎn)生的反應(yīng)體積(VR)和稀釋因子(D)，其誤差也會(huì)反映到最終濃度上。除此之外，某些外部因素，如樣品制備、原液及任何中間稀釋溶液的均勻性和穩(wěn)定性、DNA構(gòu)象和熱溫度變化均會(huì)影響dPCR數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

一些研究[8，16]已闡述了反應(yīng)數(shù)、陽(yáng)性率和反應(yīng)體積對(duì)dPCR濃度的影響。Corbisier等[20]研究闡述了微滴體積對(duì)拷貝數(shù)數(shù)據(jù)的影響，并表明拷貝數(shù)濃度依據(jù)液滴體積的變化而變化。因此，在使用dPCR進(jìn)行計(jì)量時(shí)，最終結(jié)果需加上不確定度以確保目標(biāo)分子拷貝數(shù)濃度結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 測(cè)量的不確定度

為了得到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中需考慮測(cè)量值的偏差與不確定度[7]。任何測(cè)量都存在缺陷，由于所有的測(cè)量結(jié)果都會(huì)或多或少地偏離被測(cè)量的真值，所以在給出測(cè)量結(jié)果的同時(shí)指出所給測(cè)量結(jié)果的可靠程度是十分必要的。因此要用測(cè)量不確定度評(píng)定來(lái)指出測(cè)量結(jié)果的可靠程度[20]。

根據(jù)JJF1005-2016測(cè)量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量量值的分散性非負(fù)參數(shù)。根據(jù)測(cè)量不確定度的定義，標(biāo)準(zhǔn)不確定度以標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。實(shí)際工作中則以實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差S作為其估計(jì)值。

在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的過(guò)程中，將定值不確定度與均勻性評(píng)估、穩(wěn)定性考察引入的不確定度按照平方和開(kāi)方的方法疊加就給出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uCRM，該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k得出的不確定度稱為擴(kuò)展不確定度U[21]。

2 數(shù)字PCR在核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用

近年來(lái)，我國(guó)生物制品產(chǎn)業(yè)逐步發(fā)展壯大，目前主要的生物制品有病毒性疫苗、細(xì)菌性疫苗、基因工程產(chǎn)品、血液制品、診斷試劑、基因芯片和基因治療產(chǎn)品等類型。同時(shí)，以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)正快速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、出入境檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。為了準(zhǔn)確地定量核酸，需要用已知測(cè)量不確定性的量的靶核酸序列(拷貝數(shù)或拷貝數(shù)濃度)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[5]。數(shù)字PCR作為一種絕對(duì)定量的方法，在多種領(lǐng)域的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中均有應(yīng)用。

2.1 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用

截至2018年，全球共有70個(gè)國(guó)家種植或進(jìn)口了轉(zhuǎn)基因作物，這已是全球連續(xù)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因作物的第23年。2018年，26個(gè)國(guó)家(21個(gè)發(fā)展中國(guó)家和5個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家)共種植了1.917億hm2轉(zhuǎn)基因作物，比2017年的種植面積增加了190萬(wàn)hm2?，F(xiàn)如今，由于越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因作物得以在全球范圍內(nèi)大規(guī)模種植和消費(fèi)，多個(gè)國(guó)家和地區(qū)實(shí)施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)管理制度。由于轉(zhuǎn)基因作物在種植收割、生產(chǎn)加工和運(yùn)輸消費(fèi)等過(guò)程中不可避免地出現(xiàn)混雜的情況，目前有60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)設(shè)置了閾值，如歐盟規(guī)定合法轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)閾值為0.9%、非法轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)閾值為0.5%，日本和俄羅斯規(guī)定的標(biāo)識(shí)閾值為5%[22]。在這些國(guó)家和地區(qū)的規(guī)定中，產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分含量低于閾值可以不用標(biāo)識(shí)。轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)閾值是大勢(shì)所趨，我國(guó)相關(guān)部門也正將其引入轉(zhuǎn)基因安全管理體系當(dāng)中。目前，AOCS已有GMO標(biāo)物45種，歐盟IRMM及ERM 125種，中國(guó)研制GMO標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)46種。轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)根據(jù)其形態(tài)特征，可分為基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?；蚪MDNA和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的形態(tài)是液體，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的形態(tài)主要是粉末。

在基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，通過(guò)使用雙重?cái)?shù)字PCR法和熒光定量PCR方法結(jié)果互相比對(duì)驗(yàn)證，研制了MON89788純品粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因大豆MON89788是孟山都公司研發(fā)的耐除草劑品種，我國(guó)于2008年批準(zhǔn)進(jìn)口MON89788用作加工原料，是我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的重要對(duì)象。MON89788基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制彌補(bǔ)了前期研制的低濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不能滿足定量檢測(cè)需求的缺陷。且數(shù)字PCR定值較熒光定量PCR技術(shù)更為準(zhǔn)確，解決了國(guó)外純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無(wú)準(zhǔn)確量值的問(wèn)題[21]。

與此類似的還有使用二重?cái)?shù)字PCR方法研制轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中使用了MIR604/Adh1進(jìn)行二重?cái)?shù)字PCR定量實(shí)驗(yàn)，消除了單重?cái)?shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中因取樣誤差造成的影響。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是先正達(dá)公司(Syngenta)研發(fā)的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米，我國(guó)2008年批準(zhǔn)其進(jìn)口用作加工原料，是我國(guó)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的重要對(duì)象。研制轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其加工產(chǎn)品的定性和定量檢測(cè)，將為我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理及標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供有效的技術(shù)支撐[23]。再如對(duì)于拜耳作物科學(xué)公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米T25，有實(shí)驗(yàn)室通過(guò)數(shù)字PCR的方法對(duì)樣品的特異性、動(dòng)力學(xué)范圍等進(jìn)行了檢測(cè)。最后通過(guò)多家實(shí)驗(yàn)室的二重?cái)?shù)字PCR法的聯(lián)合定值，研制了轉(zhuǎn)基因玉米T25的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。T25已經(jīng)在中國(guó)、美國(guó)、澳大利亞、加拿大、阿根廷、日本等國(guó)家被批準(zhǔn)進(jìn)口用作加工原料。T25標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制可用于對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米T25及其加工產(chǎn)品的定性和定量檢測(cè)，有效加強(qiáng)了我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識(shí)制度[24]。除此之外，數(shù)字PCR技術(shù)還應(yīng)用在水稻KeFeng6號(hào)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[25]、轉(zhuǎn)基因水稻品系“Bt汕優(yōu)63”[21]、轉(zhuǎn)基因水稻KMD的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中[26]。

2.2 數(shù)字PCR在臨床方面標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和普及，核酸的分析檢測(cè)技術(shù)已取得了重大進(jìn)展?，F(xiàn)今臨床上通常采用PCR方法識(shí)別和定量DNA、RNA的變化，這是基因檢測(cè)的基本方法，但其具有一定的局限性。近年來(lái)，dPCR的發(fā)展使得高靈敏度和高精確度定量檢測(cè)稀有變異序列成為可能。dPCR在分析復(fù)雜的生物樣本上有很多的優(yōu)勢(shì)，除了相較于qPCR具有高靈敏度的定量檢測(cè)能力外，還可以避免生物樣本中存在的多種抑制劑的干擾，由于數(shù)據(jù)的高度重復(fù)性，還可以提高各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)可比性。dPCR在醫(yī)療診斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中也有了相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。

有研究通過(guò)數(shù)字PCR的方法研制了一種低濃度水平的短鏈DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于低濃度水平循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測(cè)過(guò)程的量值溯源，能夠?qū)Φ蜐舛人降亩替溁驑?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法進(jìn)行研究。基因異常表達(dá)常誘發(fā)一些疾病的產(chǎn)生，ctDNA是一類具備廣泛應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物，可用于腫瘤早期的無(wú)創(chuàng)診斷、發(fā)展過(guò)程監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷，以及個(gè)性化用藥指導(dǎo)，然而其含量非常低，約占整個(gè)循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.1%，只有準(zhǔn)確找到ctDNA并精準(zhǔn)定量才能對(duì)疾病做出精準(zhǔn)治療。ctDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制給低濃度水平基因測(cè)試方法的發(fā)展提供了可靠的計(jì)量依據(jù)[27]。

2.3 其他應(yīng)用

除用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和臨床上診斷所需的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之外，還有許多其他應(yīng)用領(lǐng)域。在已有和空缺的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中，數(shù)字PCR技術(shù)作為比熒光定量PCR更精確先進(jìn)的技術(shù)必然有著良好的應(yīng)用前景。

在食品安全方面，世界各國(guó)都非常關(guān)注食品中微生物引起食源性疾病的預(yù)防與控制，其中關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)便是食品中微生物的檢測(cè)技術(shù)。目前我國(guó)食品中微生物的檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)、血清抗體檢測(cè)和生化特征比較等方法為主，不能滿足日益發(fā)展的檢驗(yàn)檢疫工作需要。但與此同時(shí)，也有多家實(shí)驗(yàn)室在使用數(shù)字PCR等新興方法研制新的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。已有實(shí)驗(yàn)室使用ddPCR制備了食品中腸侵襲性大腸埃希氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。從致病菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的關(guān)鍵制備技術(shù)和保存技術(shù)入手，開(kāi)展均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，并對(duì)食品中致病菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度進(jìn)行深入細(xì)致的分析計(jì)算，最終研制出具有較好均勻性和穩(wěn)定性的腸侵襲性大腸埃希氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品[28]。如Wen等[29]通過(guò)3種不同的方法對(duì)質(zhì)粒濃度進(jìn)行定量，其中包括數(shù)字PCR方法。最終開(kāi)發(fā)了3個(gè)質(zhì)粒候選RM。

在動(dòng)物病毒方面，已有研究通過(guò)數(shù)字PCR法制備出了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用高精確度的數(shù)字PCR技術(shù)替代熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定值，從而充分保障了定值結(jié)果的可靠性和技術(shù)權(quán)威性[30]。

3 展望

核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在醫(yī)療診斷、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、生物安全等方面有著極大的發(fā)展空間。PCR測(cè)量準(zhǔn)確性對(duì)于疾病診斷和治療至關(guān)重要，并可應(yīng)用于動(dòng)植物疫病、轉(zhuǎn)基因植物等領(lǐng)域的檢測(cè)上。目前通用的金標(biāo)準(zhǔn)是qPCR，dPCR是qPCR的一種進(jìn)化方法，具備精確性高、可靠性好，且不需依賴外參，已經(jīng)用于多種化驗(yàn)及測(cè)量領(lǐng)域。因其定量方法的精確性，已被用作核酸CRM定值的參考方法，在CRM的研制和檢測(cè)上都有很好地適用性和更加深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。當(dāng)前新型冠狀病毒在全球肆虐新冠檢測(cè)方法在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)等層面已提上標(biāo)準(zhǔn)化日程[31]。后疫情時(shí)代，為更加完善生物安全防護(hù)工作，需要擴(kuò)大及加深生物安全領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)與應(yīng)用，做到早識(shí)別、早防范。