蔡晨依，孟飛龍，饒琳，劉云玥，趙小立

綜 述

誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)及其在疾病研究中的應(yīng)用

蔡晨依，孟飛龍，饒琳，劉云玥，趙小立

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳與再生生物學(xué)研究所，浙江省細胞與基因工程重點研究實驗室，杭州 310058

自2006年Takahashi和Yamanaka報道生成誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)以來，多能干細胞領(lǐng)域進入了前所未有的發(fā)展狀態(tài)，在疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)以及細胞療法等各方面都發(fā)揮重要作用，促進了細胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。目前，iPSCs技術(shù)已成為研究病理機制的重要工具，利用iPSCs技術(shù)篩選的新藥物正在研發(fā)中，使用iPSCs衍生細胞的臨床試驗數(shù)量也在逐漸增長。iPSCs與基因編輯技術(shù)以及3D類器官相結(jié)合的最新研究進展促進了iPSCs在疾病研究中的進一步應(yīng)用。本文介紹了近年來重編程方法的革新，分析了整合病毒載體系統(tǒng)、整合非病毒載體系統(tǒng)、非整合病毒載體系統(tǒng)以及非整合非病毒載體系統(tǒng)四種重編程方法的利弊；同時綜述了iPSCs在疾病建模以及臨床治療等方面的最新研究進展，為促進iPSCs各領(lǐng)域的深入研究提供參考。

iPSCs；重編程；疾病建模；細胞療法

最初人們認為，動物的成熟體細胞的基因組被永久鎖定在體細胞狀態(tài)，無法恢復(fù)到具有完全的多能性狀態(tài)[1]。然而，1958年Gurdon等[2]將非洲爪蟾()蝌蚪的體細胞核注射到同一物種的去核卵母細胞中，由此產(chǎn)生了一只功能完善的蝌蚪。39年后，Wilmut等[3]利用核移植技術(shù)培育了第一個哺乳動物克隆羊——“多莉”。這些克隆研究表明，分化細胞仍然保留著對機體發(fā)育至關(guān)重要的“遺傳”記憶。1981年，Evans等[4]發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)可以從小鼠囊胚的內(nèi)細胞團中獲得，其后Thomson等[5]從人囊胚內(nèi)細胞團成功獲得了人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)。ESCs是多能的，它們具有無限制的自我更新能力，同時擁有向所有細胞類型分化的潛能。1987年，Weintraub等[6]發(fā)現(xiàn)單個基因的表達可以將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為骨骼肌細胞。這一發(fā)現(xiàn)證明每種細胞都有自身的主調(diào)節(jié)基因，這些主調(diào)節(jié)基因起到維持細胞特性的作用。2006年，Takahashi和Yamanaka[7]從24個不同的基因入手，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向體細胞引入轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引入4種轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)可以將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)，從而建立了誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技術(shù)。

2007年，日本京都大學(xué)Takahashi研究小組和美國威斯康星大學(xué)Yu研究小組分別報道了從人成纖維細胞中產(chǎn)生人類誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSCs)的案例[8,9]。自此，迅速發(fā)展起來的hiPSCs技術(shù)為疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開啟了一個令人興奮的新時代。鑒于hiPSCs在疾病建模方面相對于傳統(tǒng)細胞篩選的優(yōu)勢，將hiPSCs模型用于藥效和潛在毒性的藥物篩選變得越來越流行。hiPSCs的優(yōu)點包括它們起源于人類、易獲得、可擴展和能夠產(chǎn)生幾乎所有所需的細胞類型，避免與hESCs相關(guān)的倫理問題，以及具有可以利用患者特定的iPSCs開發(fā)個性化藥物，進行個性化治療的潛力。隨著3D培養(yǎng)技術(shù)以及基因編輯技術(shù)，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，hiPSCs在人類疾病建模和基于干細胞的臨床治療方面展示出巨大的前景。本文主要介紹了重編程方法的革新以及iPSCs在人類遺傳疾病建模和細胞治療方面的最新發(fā)展，總結(jié)了目前iPSCs技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)并探討了解決這些問題的方法。

1 重編程方法

1.1 OSKM轉(zhuǎn)錄因子的作用

Oct4是一種與多能干細胞(PSCs)的多能性維持有關(guān)的同源域轉(zhuǎn)錄因子。Sox2在控制Oct4的表達中起著至關(guān)重要的作用[10]，與Nanog和Oct4一起構(gòu)成了多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。c-Myc是一種與多種癌癥病因相關(guān)的原癌基因，負責(zé)招募染色質(zhì)修飾蛋白，誘發(fā)廣泛的轉(zhuǎn)錄激活。由于c-Myc有一定的致瘤性，后續(xù)有研究用無轉(zhuǎn)化活性的L-Myc替代以解決此問題[11]。Klf4作為腫瘤蛋白或腫瘤抑制因子，是白血病抑制因子的下游靶點，能激活Sox2的表達[12]。重組轉(zhuǎn)錄因子與體細胞多能性相關(guān)序列結(jié)合的能力主要受DNA甲基化、組蛋白修飾和ATP依賴性染色質(zhì)重塑產(chǎn)生的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的調(diào)節(jié)[13]。據(jù)Stadtfeld和Hochedlinger[14]的報道，細胞的多能性被誘導(dǎo)時會激發(fā)兩個轉(zhuǎn)錄波。在第一個轉(zhuǎn)錄波中，c-Myc通過甲基化的H3K4me2和H3K4me3與體細胞基因組相結(jié)合，標志著染色質(zhì)的重塑。隨后是體細胞相關(guān)基因表達的沉默，包括Thy1、Snai1、Snai2、Zeb1和Zeb2等間充質(zhì)基因[13,15]。第二個轉(zhuǎn)錄波更局限于染色質(zhì)重塑的細胞。OSKM到達早期多能相關(guān)基因(pluripotency-associated genes, PAG)的增強子和啟動子，并觸發(fā)其轉(zhuǎn)錄和表達。在此轉(zhuǎn)錄波中，體細胞被迫改變其形態(tài)，加強增殖，并經(jīng)歷間充質(zhì)樣向上皮樣的轉(zhuǎn)化(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)。這導(dǎo)致了Cdh1和Ocln等上皮基因的上調(diào)和上皮特征基本狀態(tài)的建立[16]，形成了更大的ES樣細胞團。但MET是一個隨機和低效的過程，因為多能誘導(dǎo)基因上存在甲基化組蛋白，而甲基化組蛋白負責(zé)封閉染色質(zhì)構(gòu)象[13]。

Klf4在這兩個階段都扮演著重要的角色。首先，在第一階段Klf4結(jié)合并激活包括在內(nèi)的上皮基因，抑制分化基因[17]。其次，在第二階段加速內(nèi)源性O(shè)ct4和Sox2的表達，從而建立維持多能狀態(tài)的自我調(diào)節(jié)環(huán)。Klf4通過控制細胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡等過程，在多能干細胞中發(fā)揮重要的作用。Klf4與Oct4和Sox2之間超強的相互作用激活一組如Nanog、Esrrb、Klf2、Sall4和ZFP42等轉(zhuǎn)錄因子，以及如Smad1和Stat3等信號通路調(diào)節(jié)因子[18]。

1.2 重編程載體

在Yamanaka的開創(chuàng)性研究之后，陸續(xù)有幾個研究室使用不同的方法來生成iPSCs，以滿足有效治療應(yīng)用的安全性和質(zhì)量標準。這些重編程策略大致分為兩組：(1)通過基因整合或非整合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)；(2)利用病毒或非病毒方法。兩組重編程策略將現(xiàn)有的重編程方法主要分為四種：整合病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、整合非病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、非整合病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及非整合非病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，通過4種重編程方法將各類細胞重編程成iPSCs的過程如圖1所示。每種方法都有其優(yōu)缺點，目前并未找到一個無限制或無潛在不良后果的單一的重編程轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

1.2.1 整合病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的重編程

iPSCs最初是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引入重編程因子產(chǎn)生的，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛用作體外和體內(nèi)研究的基因轉(zhuǎn)移載體[19]。在重編程過程的后期，由于表觀遺傳修飾[20]，轉(zhuǎn)入基因的表達被沉默[21]，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只提供外源DNA序列的瞬時表達。若未能完全激活與多能性相關(guān)的內(nèi)源基因的表達，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生成的iPSCs的質(zhì)量將受到部分損害[22]。此外，一些報道指出，病毒轉(zhuǎn)基因的重新激活及其在產(chǎn)生iPSCs中的殘留活性會改變細胞的發(fā)育過程，并可能導(dǎo)致嵌合動物腫瘤的形成[23,24]。

慢病毒載體(lentivirus, LV)因其廣泛的親和性而被認為比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更加有效[24]，因此LV被用來重編程許多體細胞類型。LV基因傳遞方法如今仍是最有效的重編程策略之一，重編程效率為0.1%~1%[14,25]，但科學(xué)家們?nèi)栽谂Ω纳七@一途徑的安全性[26]。在設(shè)計有效的重編程LV方面取得的進展之一是研制了一種多順反子LV，它在一個表達系統(tǒng)中攜帶了由源自口蹄疫病毒的2A“自裂”肽序列連接的一個啟動子驅(qū)動的四個重編程因子[23,27]。該系統(tǒng)減少了病毒在轉(zhuǎn)基因細胞中整合的拷貝數(shù)，降低了轉(zhuǎn)基因沉默的風(fēng)險，簡化了轉(zhuǎn)化過程，并建立了一致的重編程因子的化學(xué)計量法[28]。此外，為了消除低效率沉默和轉(zhuǎn)基因再激活的影響，通過引入可切除載體(Cre/loxP系統(tǒng))[29]和可誘導(dǎo)系統(tǒng)(四環(huán)素/強力霉素誘導(dǎo)系統(tǒng))[26,30]重組多順反子病毒載體，整合后的轉(zhuǎn)基因可以通過瞬時表達Cre從宿主細胞基因組中移除。但這種策略的轉(zhuǎn)移效率很低[31]，并且可能導(dǎo)致iPSCs突變，因為Cre/loxP系統(tǒng)在重新編程后可能會留下loxP的痕跡[32]。

圖1 產(chǎn)生iPSCs的各種細胞來源和重編程方法

1.2.2 整合非病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的重編程

由于目前整合病毒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的局限性，科學(xué)家們一直在積極研究其他重編程方法，如非病毒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，這些方法對于治療應(yīng)用更安全。第一個成功的非病毒性iPSCs是由成熟的胚胎成纖維細胞經(jīng)兩個質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的：第一個質(zhì)粒編碼c-Myc，而第二個質(zhì)粒多順反子載體編碼OSKM重編程因子[23]。這些發(fā)現(xiàn)表明OSKM的瞬時過表達足以誘導(dǎo)體細胞的多能性，但是整合的風(fēng)險和重編程的效率低下又成了主要問題[33]?？茖W(xué)家們又設(shè)計了一個整合的依賴性基因轉(zhuǎn)移載體，將轉(zhuǎn)錄因子整合到重組結(jié)構(gòu)的loxP位點中以解決整合風(fēng)險的問題[28,29]。然而，短的載體片段可以存在于切除后的基因組細胞中，這可能會影響細胞功能[33]。人們又發(fā)現(xiàn)利用如piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子等可移動的基因元件來傳遞外源多能性基因非常有效，且PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)座效率高、刪除精確等優(yōu)點[34]。此方法通過短暫的轉(zhuǎn)位表達，可以從重新編程的細胞中完全去除該元件的殘余[35]。不幸的是，人類基因組中有內(nèi)源性的類PB轉(zhuǎn)座子元件，在轉(zhuǎn)基因切除后會引起非特異性的基因組改變[36]。為克服PB轉(zhuǎn)座子的局限性，人們又引入了Sleeping Beauty(SB)系統(tǒng)，使其整合頻率低于PB轉(zhuǎn)座子，并且人類基因組中沒有類SB元件[37]。然而這又導(dǎo)致了新的問題：此方法的重編程效率很低，使用可切除的元件還可能會導(dǎo)致重新整合的風(fēng)險[33]。

1.2.3 非整合病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的重編程

Stadtfeld等[38]利用腺病毒等非整合病毒載體成功地建立了人和小鼠iPSCs，從這些研究中獲得的iPSCs顯示在宿主基因組中沒有外源DNA的插入。然而，目前的非整合病毒載體傳遞方法的重編程效率僅限于0.001%，因此有人認為OSKM的瞬時表達不足以產(chǎn)生完全的表觀遺傳重塑[14,36]。盡管如此，腺病毒方法在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用仍有很大的前景[24]。另一種方法是使用負單鏈RNA仙臺病毒(Sendai- virus, Se-V)，因為它在許多類型的細胞和組織中導(dǎo)入外源基因非常有效，但也遇到了低重編程效率的障礙[39]。盡管如此，人們?nèi)栽谂﹂_發(fā)一種改良的Se-V[40]，因為Se-V在囊性纖維化基因治療[41]和艾滋病疫苗[42]方面具有巨大的潛力，希望可用于人iPSCs的細胞替代治療[43]。

1.2.4 非整合非病毒載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的重編程

為了產(chǎn)生不含載體整合到染色體的iPSCs，可以使用細胞質(zhì)RNA、附加體型載體(一種自我復(fù)制和選擇的載體)[44]或多順反子微環(huán)DNA非病毒載體系統(tǒng)[45]，將多潛能標記基因直接和瞬時地傳遞到體細胞中。這些方法相對容易使用，但重編程效率比LV低5~10倍[24]。因此，使用細胞質(zhì)RNA和微環(huán)DNA載體需要廣泛的優(yōu)化以備將來的應(yīng)用[24]。

小鼠和人成纖維細胞已成功地通過直接轉(zhuǎn)移純化的重編程蛋白[46]或從ESCs[47]、轉(zhuǎn)基因HEK293細胞中分離的總蛋白[48]提取物進行重編程。然而這種方法存在一定的弊端，因為大量合成這樣的蛋白質(zhì)具有很大的挑戰(zhàn)性，且轉(zhuǎn)化效率特別低，細胞重編程過程需要8周。有實驗室指出通過化學(xué)重編程產(chǎn)生iPSCs也許是可行的，但這一過程可能導(dǎo)致突變，因為細胞基因組易受DNA和組蛋白修飾[14,33]。引入合成RNA或編碼重編程因子的信使RNA (mRNA)也許是建立無整合多能干細胞的有力平臺，盡管這些方法可能需要多輪轉(zhuǎn)染，但在生成具有更安全的iPSCs方面相對有優(yōu)勢[49]。

1.3 提高重編程效率的方法

為了改進重編程過程，人們采用了諸如microRNA (miRNA)等新方法來提高重編程效率。例如，miR- 291-3p、miR-294和miR-295被用來代替c-Myc以產(chǎn)生均勻的hiPSCs集落[50]。此外，化學(xué)化合物如丙戊酸、丁酸鈉和組蛋白脫乙酰酶抑制劑等已被證明能促進iPSCs的生成[51~53]。培養(yǎng)環(huán)境的改變，如缺氧培養(yǎng)也能提高重編程效率[54]。抑制p53途徑[55]或抑制NuRD(Mbd3/核小體重塑和去乙酰化抑制因子)復(fù)合物的組成成分Mbd3，都可以進一步促進iPSCs的生成[56]。卵母細胞中特異表達的其他因子，如Glis1和H1foo，也能提高重編程效率[57,58]。

除了可以提高重編程效率，有些小分子在重編程過程中還能發(fā)揮部分OSKM轉(zhuǎn)錄因子的作用，甚至能完全代替OSKM轉(zhuǎn)錄因子將體細胞重編程為iPSCs。例如，使用組蛋白脫乙酰酶抑制劑和轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑的培養(yǎng)基可以在沒有c-Myc或Klf4的情況下提高iPSCs的生成，并且可以替代Oct4來維持細胞的多能性[59]。此外，用Aza(DNA甲基化抑制劑)和TSA(組蛋白脫乙酰酶抑制劑)誘導(dǎo)多能基因、、的表達，可以將小鼠骨髓前體細胞(BPCs)重編程為iPSCs[60]。另一項研究報告表明，盡管重編程效率較低，但轉(zhuǎn)入miRNA-302/367家族可以在沒有轉(zhuǎn)入OSKM轉(zhuǎn)錄因子的情況下成功地將小鼠和人類體細胞重編程為iPSCs[61]。Hou等[62]使用7種小分子化合物成功將小鼠體細胞重編程成iPSCs，且重編程效率高達0.2%。雖然單用小分子對體細胞進行重編程在臨床上有很大的應(yīng)用價值，但由于重編程不完全，誘導(dǎo)后的多能干細胞容易恢復(fù)體細胞特征，這將限制小分子重編程在臨床研究中的發(fā)展。

2 基于iPSCs的疾病建模

2.1 基因編輯技術(shù)

基于iPSCs的疾病模型的建立和使用通常包括以下步驟：收集來源患者的體細胞，通過重編程技術(shù)將其重編程成病人特異性iPSCs；利用CRISPR/ Cas9等基因編輯技術(shù)建立等基因?qū)φ?通常通過編輯已知疾病相關(guān)基因獲得修復(fù)后的健康iPSCs)；將細胞分化為各種與疾病相關(guān)的特定細胞，并通過比較患病和健康的特定細胞或類器官來定義疾病特異性表型；在分子水平上研究這些表型可以識別新的病理機制，為藥物發(fā)現(xiàn)和個性化治療提供新的機會。iPSCs衍生的特定細胞和類器官在疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和細胞治療中的應(yīng)用如圖2所示。

快速發(fā)展的基因組編輯技術(shù)現(xiàn)在能夠在特定位置將基因改變引入iPSCs，包括糾正患者來源的iPSCs中的致病基因突變以及將特定突變引入非疾病野生型iPSCs。這些方法提供以引入的突變作為唯一的變量來產(chǎn)生基因匹配的、等基因的iPS細胞系，確保了對真實病理的可靠鑒定，同時避免了由于可能的細胞系間變異導(dǎo)致的遺傳背景差異或偶發(fā)現(xiàn)象的混淆。等基因iPSCs控制在模擬散發(fā)性或多基因疾病時尤其重要，因為這些疾病的表型差異很小[63]。

可編程位點特異性核酸酶的開發(fā)，包括鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)[64,65]、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)[66,67]和CRISPR/Cas9系統(tǒng)[68]，通過誘導(dǎo)基因修飾位點的DNA雙鏈斷裂，顯著提高了人ESCs和iPSCs的基因編輯效率。其中CRISPR/ Cas9技術(shù)由于設(shè)計簡單、使用方便等優(yōu)點，在人類胚胎干細胞和iPSCs的基因編輯中得到了廣泛的應(yīng)用。這種基因編輯技術(shù)允許研究人員將致病突變引入非患者iPSCs或消除患者iPSCs中的致病突變，從而創(chuàng)建基于iPSCs的疾病建模等基因控制平臺。盡管使用CRISPR/Cas9技術(shù)可能會產(chǎn)生偏離目標的效果，如CRISPR/Cas9在腫瘤細胞系[69]中發(fā)現(xiàn)了相對較高水平的非靶基因修飾，但來自多個實驗室的全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)研究表明，非靶基因修飾在正常人類細胞(包括人iPSCs和ESCs)中很少見[70,71]。基因編輯工具也在不斷改進和完善，這可能有助于解決脫靶效應(yīng)的問題。最初CRISPR/Cas9通過誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂來編輯一個基因組位點；后來由成對向?qū)NA或特異性增強的工程化Cas9核酸酶變體(engineered Cas9 nuclease variants with enhanced specificity, eSpCas9)指導(dǎo)的Cas9核酸內(nèi)切酶變體(D10A突變體)越來越多地用于基因組編輯[72]，因為這兩種方法都能在保持對靶點的嚴格切割的同時顯著降低了脫靶效應(yīng)[73]。此外，催化死亡的Cas9 (dead Cas9, dCas9)通過與轉(zhuǎn)錄激活劑或抑制因子融合，用于調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄或通過與熒光蛋白融合來成像基因組位點[74]。對CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的改造也能以精確的單等位或雙等位基因的方式高效地引入DNA序列的變化[75]。最近在堿基編輯方面的一個新進展是利用CRISPR/Cas9與胞苷脫氨酶融合，使胞苷直接轉(zhuǎn)化為尿苷而不需要雙鏈DNA斷裂[76]。這種新方法提高了基因編輯效率，并將進一步促進人類iPSCs的基因編輯發(fā)展。用于人類iPSCs的基因編輯技術(shù)以及作用機理如表1所示。

圖2 來源于iPSCs的特定細胞和類器官在疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和細胞治療中的應(yīng)用

2.2 傳統(tǒng)二維細胞建模

識別人類疾病的病理機制對于發(fā)現(xiàn)新的治療策略具有關(guān)鍵作用。雖然利用原代患者來源細胞建立疾病模型有助于研究人類疾病的病因和制定治療策略，但一個關(guān)鍵的限制因素是無法獲得可擴展的患者原代細胞，尤其是腦細胞和心臟細胞。人類iPSCs由于自我更新的內(nèi)在特性和幾乎可以分化為體內(nèi)任何細胞類型的潛能而成為一個有吸引力的替代品，因為人類疾病(特別是那些有明確遺傳原因的疾病)原則上可以使用容易獲得的細胞類型(如皮膚成纖維細胞和血細胞)的iPSCs建模?；颊咛禺愋詉PSCs可以提供大量與疾病相關(guān)的細胞和各種以前無法獲得的細胞類型，如神經(jīng)元和心肌細胞。此外，由于iPSCs可以從相關(guān)患者自身獲得，因此它們可以使個性化疾病建模成為精準醫(yī)學(xué)的核心部分。

基于iPSCs的疾病模型被廣泛用于研究由單基因突變引起的疾病(單基因疾病)[77]，這種方法非常適合于此類疾病，因為iPSCs可以很容易地從這些疾病患者身上獲得并分化成如神經(jīng)元等與疾病相關(guān)的細胞。例如，從患者iPSCs中分化出來的神經(jīng)元被用來模擬脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)，這是一種由基因突變引起的早發(fā)性疾病，基因突變導(dǎo)致運動神經(jīng)元變性和隨后的肌肉萎縮[77]。Ⅰ 型SMA患者通常在出生后6個月出現(xiàn)癥狀，疾病進展迅速，在兩歲時死亡[78]。在最初的基于iPSCs的疾病模型研究中[77]，iPSCs來源于 Ⅰ 型SMA患者的成纖維細胞，并分化為與疾病相關(guān)的細胞類型——運動神經(jīng)元。與未受影響的對照組相比，患者iPSCs分化的運動神經(jīng)元存活率降低。此外，來源于SMA患者的iPSCs能夠?qū)Ρ焖岷屯撞济顾?已知兩種化合物能增加SMN蛋白的表達量)產(chǎn)生反應(yīng)，且這兩種化合物可以提高SMA患者iPSCs的SMN蛋白水平[77]。這項研究提供了一個原則性的證據(jù)，病人來源的iPSCs可以用來模擬早發(fā)性遺傳疾病，并可作為潛在的藥物篩選平臺。

表1 用于人類iPSCs的基因編輯技術(shù)

對發(fā)病較晚的疾病進行建模更具挑戰(zhàn)性，因為從人類iPSCs分化出來的細胞通常表現(xiàn)出不成熟的表型。例如，理想情況下來源于iPSCs的心肌細胞在用于再生醫(yī)學(xué)或藥物發(fā)現(xiàn)時應(yīng)該是成熟的，其成熟度將類似于成年心肌中心肌細胞的成熟度，從而使衍生細胞顯示出相似的收縮性、電生理性能和對藥物刺激的反應(yīng)。然而，在現(xiàn)實中，iPSCs來源的心肌細胞是未成熟的，其形態(tài)特征等方面更符合胚胎狀態(tài)下的心肌細胞[79]。未成熟心肌細胞較少顯示有組織的肌節(jié)結(jié)構(gòu)和鈣處理機制，這些特征反映在成熟相關(guān)肌節(jié)基因(如、、和)和離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(如和)的低表達上[80]。研究人員已在誘導(dǎo)心肌細胞成熟方面做了很多努力：添加甲狀腺激素[81]，長期培養(yǎng)[82]，用三維心肌組織中的機械調(diào)節(jié)結(jié)合電刺激[83]等方法都對iPSCs衍生心肌細胞的成熟有作用。除了要解決iPSCs衍生細胞不成熟表型的問題外，建模晚發(fā)性疾病更大的困難在于如何誘導(dǎo)細胞衰老。對人iPSCs衍生的細胞進行誘導(dǎo)衰老的一種方法是用細胞應(yīng)激源處理細胞，包括如吡咯菌素和MG-132等的靶向線粒體功能或蛋白質(zhì)降解的化合物[84]；另一種誘導(dǎo)細胞衰老的方法是異位表達如早衰蛋白等誘導(dǎo)早衰的基因產(chǎn)物[85]。然而，細胞應(yīng)激源或早衰蛋白的表達是否能通過一種類似于正常衰老的機制誘導(dǎo)細胞衰老仍有待確定。

iPSCs還為研究散發(fā)性疾病提供了一種新的方法(其病因尚未在患者的家族史或基因突變中確定)，這一點十分重要，因為許多疾病的大多數(shù)患者都屬于散發(fā)性疾病。例如，在老年癡呆癥中，95%的病人屬于散發(fā)性疾病。研究人員通過對散發(fā)性阿爾茨海默病患者iPSCs衍生神經(jīng)細胞的分析發(fā)現(xiàn)，一些散發(fā)性病例表現(xiàn)出與特定基因突變的家族性阿爾茨海默病相同的表型[86]，這表明使用iPSCs也許可以對散發(fā)性疾病進行重新鑒定。然而，使用iPSCs對散發(fā)性疾病進行建模通常比單基因疾病更困難，因為這類疾病的表型變化是由多個小效應(yīng)遺傳風(fēng)險變異體和環(huán)境因素共同誘導(dǎo)的。雖然來源于此類疾病患者的iPSCs可能包含與疾病相關(guān)的風(fēng)險變異體，但使用iPSCs來模擬此類疾病由于遺傳和表觀遺傳背景的逐行變異而變得復(fù)雜，而且散發(fā)性疾病iPSCs的衍生細胞的表型預(yù)計比單基因疾病iPSCs的衍生細胞更為精細。因此，基于iPSCs的散發(fā)性疾病模型的一個關(guān)鍵問題是如何產(chǎn)生僅在相關(guān)風(fēng)險變異上存在差異的成對等基因細胞系[63]。利用CRISPR/ Cas9技術(shù)產(chǎn)生基因編輯的等基因iPS細胞系的功能可以創(chuàng)造一個良好的控制系統(tǒng)，確保與疾病相關(guān)的基因風(fēng)險變異體成為唯一的變量[87]。這種方法被用于產(chǎn)生帕金森病不同相關(guān)風(fēng)險變異體的等基因iPS細胞系，結(jié)合等位基因特異性分析能夠?qū)υ撨z傳風(fēng)險變異體進行強有力的分辨和基因定位[87]。這一實驗策略可用于研究與其他疾病相關(guān)的遺傳危險因素。

此外，基于iPSCs的疾病模型也成為研究腫瘤疾病的發(fā)病機制和篩選新的治療藥物的有用工具。在不改變細胞基因組序列的情況下，來源于腫瘤疾病患者的任何細胞都能重編程成iPSCs，再分化為與對應(yīng)腫瘤疾病相關(guān)的細胞類型，以此研究iPSCs向特異性腫瘤細胞轉(zhuǎn)化的過程。例如，青少年骨髓單核細胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia, JMML)是一種侵襲性骨髓增生性腫瘤，其發(fā)生的原因是突變導(dǎo)致細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。將兩名JMML患者的骨髓細胞和外周血細胞重編程成iPSCs，此iPSCs具有與患者體細胞相同的基因的p.E76K錯義突變，該突變體編碼SHP-2 (一種非受體酪氨酸磷酸酶)[88]。與正常iPSCs體外分化產(chǎn)生的髓系細胞相比，JMML-iPSCs衍生的髓系細胞增殖能力增強、粒細胞–巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)被激活且STAT5/ERK磷酸化增強，這些特征與JMML患者的原代髓系細胞相似，且MEK激酶的藥理抑制作用能降低JMML-iPSCs衍生的髓系細胞GM-CSF的活性[88]。這項研究表明iPSCs衍生細胞在人類原發(fā)性惡性腫瘤體外建模中的效用，為該疾病潛在的靶向治療提供理論依據(jù)?；趇PSCs的疾病建模在遺傳性腫瘤疾病的研究中也展示出巨大的前景。Li-Fraumeni綜合征(Li-Fraumeni syndrome, LFS)是一種常見的由基因突變引起的惡性腫瘤綜合征[89]。來源于LFS患者的iPSCs衍生的成骨細胞顯示出分化缺陷性和致瘤性,且基因的表達受阻，這些特征與骨肉瘤(osteosarcoma, OS)細胞一致?；謴?fù)LFS-iPSCs中的表達促進了成骨細胞的分化并抑制了其致瘤性[90]。該研究結(jié)果證明了用iPSCs研究遺傳性人類腫瘤疾病的可行性。

2.3 類器官：培養(yǎng)皿里的復(fù)雜組織

iPSCs衍生產(chǎn)品的臨床應(yīng)用在很大程度上依賴于定向分化、細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換和組織工程的最新技術(shù)。早期利用iPSCs定向分化的研究經(jīng)常利用單基因疾病中的細胞水平表型，但轉(zhuǎn)化為組織水平和器官水平的疾病需要開發(fā)更復(fù)雜的3D多細胞系統(tǒng)。隨著iPSCs衍生類器官的發(fā)展，iPSCs在疾病建模方面取得了重要進展[91]。類器官是由干細胞分化而來的三維多細胞聚集體，能夠自我組織，可以表現(xiàn)成熟組織的結(jié)構(gòu)特征和細胞間的相互作用[92]。用于指導(dǎo)類器官與iPSCs分化的可溶性生物物理學(xué)方法已逐漸完善，以產(chǎn)生越來越復(fù)雜的“人造組織”[91]?；颊邅碓吹膇PSCs和基因糾正的iPSCs平行分化成類器官，可以將類器官水平的疾病表型歸因于特定的分子病變。一旦建立了清晰的類器官水平研究平臺，病變的類器官就可以用于藥物篩選和驗證研究。

早期的ESCs和iPSCs研究利用神經(jīng)分化方法來模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病[93]。從人iPSCs衍生的3D大腦類器官的創(chuàng)建就是建立在這些基本的神經(jīng)分化方法的基礎(chǔ)上，但隨后要在懸浮生物反應(yīng)器中生長長達70天，另外這些3D大腦類器官還給研究人員帶來形態(tài)建成的啟發(fā)線索[94]。這些器官包含腦皮層組織區(qū)域以及特定前腦和后腦區(qū)域的功能性神經(jīng)元，甚至包含未成熟視網(wǎng)膜和脈絡(luò)叢的分化結(jié)構(gòu)[94]。Quadrato和Sloan等[95,96]對3D大腦類器官培養(yǎng)方法的改進還能誘導(dǎo)3D類器官形成大腦中的海馬體和小腦等特定區(qū)域結(jié)構(gòu)，以及誘導(dǎo)形成皮層折疊結(jié)構(gòu)。神經(jīng)類器官因為顯著的復(fù)雜性而被用來模擬各種單基因和多基因神經(jīng)系統(tǒng)疾病，這些疾病的研究為神經(jīng)疾病的病理生物學(xué)提供了深厚的基礎(chǔ)。例如，編碼一種中心體蛋白，該蛋白在有絲分裂過程中定位于紡錘體極，而基因的復(fù)合雜合子突變將引起小頭畸形?；蛲蛔兓颊遡PSCs衍生的神經(jīng)類器官最初被用來模擬小頭畸形，由此發(fā)現(xiàn)患者特有的神經(jīng)類器官經(jīng)歷了神經(jīng)上皮早期分化，并顯示出異常的徑向膠質(zhì)取向和較小的分化神經(jīng)組織區(qū)域[94]。而另一種編碼中心體蛋白的基因在微管組裝和成核的調(diào)節(jié)中起重要作用，的突變將引起小頭綜合征，該病患者iPSCs衍生的神經(jīng)類器官中也觀察到類似的表型[97]。近年來，來源于人iPSCs的神經(jīng)類器官還被用作研究腦腫瘤的平臺，研究人員使用含有神經(jīng)干細胞和前體細胞的大腦類器官，通過載體轉(zhuǎn)化以引入常見于腦腫瘤的突變，然后研究突變后細胞的過度生長問題以模擬腦瘤的發(fā)生和發(fā)展[98]。因此，與2D系統(tǒng)相比，神經(jīng)類器官的研究讓人們增強了對神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理生物學(xué)的了解。

在從iPSCs生成肝細胞治療各種肝臟疾病方面的二維分化方案已被證明是有效的[99]。最近，在三維類器官系統(tǒng)中，從患有肝膽疾病的iPSCs中已經(jīng)衍生出膽管細胞。目前的分化方案是首先定向分化為內(nèi)皮細胞和肝母細胞，然后在三維培養(yǎng)中分化為膽管細胞樣細胞[100,101]。這些膽管細胞類器官可以流出膽汁酸并具有功能性分泌作用，從而可以模擬Alagille綜合征，這是一種由于Notch信號中斷而導(dǎo)致膽管形成受損的疾病[101]。在與多囊性肝病患者分化的膽管細胞類器官中，合成生長抑素類似物奧曲肽降低了類器官的大小，與該藥物在治療患者多囊性肝腫大中的作用一致[101]。攜帶突變的多囊性肝病和囊性纖維化(CF)患者的iPSCs衍生的膽管細胞類器官顯示出氯化物轉(zhuǎn)運受損和CFTR蛋白表達量降低，而CF校正藥物VX809能穩(wěn)定該類器官中CFTR蛋白的表達，與該藥物在囊性纖維化患者中的作用一致[100,101]。在每一個病例中，復(fù)雜疾病表型的建模都是通過三維類器官的發(fā)展而實現(xiàn)的。

近年來，心臟類器官的研究取得了極大的進展。iPSCs衍生的心臟類器官具有胎兒樣分化的特點，雖已被用于心肌細胞損傷后再生的模型研究，但是這一發(fā)現(xiàn)強化了一種觀點，即來源于iPSCs的心肌細胞和其他組織經(jīng)常表現(xiàn)出胎兒樣分化，這可能會妨礙成人疾病的建模[102,103]。最近有研究者產(chǎn)生了具有中心空腔的復(fù)雜心肌細胞類器官，這讓分化方案逐步完善[104]。此外，iPSCs已經(jīng)被用于構(gòu)建三維心肌組織，以評估機械力、代謝和細胞外基質(zhì)對心肌細胞成熟的影響，這些研究包括使用iPSCs的組織工程的各個方面[105]。研究人員還通過3D器官芯片技術(shù)將iPSCs用于模擬心肌病，這一策略被應(yīng)用在許多其他疾病系統(tǒng)中，為模擬血管灌注提供了額外的理論支持[106,107]。

最近的兩項研究強調(diào)了人iPSCs衍生的肺類器官在疾病建模中的作用[108,109]，方法是將人iPSCs定向分化為NKX2-1+的氣道祖細胞，該祖細胞能夠隨后形成近端或遠端氣道細胞[108]。在低Wnt激活的三維培養(yǎng)中，NKX2-1+祖細胞可重復(fù)形成包含各種近端氣道細胞的類器官，包括分泌細胞、杯狀細胞和基底細胞[108]。用forskolin同時處理來自囊性纖維化F508del-CFTR突變純合子患者和來自對照的健康人類的iPSCs衍生的近端氣道類器官，相比之下，患者衍生的類器官顯示forskolin誘導(dǎo)的腫脹受損[108]。研究人員將這一表型歸因于CFTR功能障礙，而后iPSCs中的基因糾正改善了forskolin誘導(dǎo)的腫脹[108]，進而揭示了基因編輯在iPSCs疾病模型中確認的基因型-表型關(guān)系。人iPSCs來源的NKX2-1+肺祖細胞在3D培養(yǎng)中也能分化為遠側(cè)肺泡類器官，這些肺泡類器官含有功能性的2型肺泡上皮細胞，這些細胞含有板層小體并分泌表面活性蛋白。而來自缺乏表面活性蛋白B (SFTPB)患者的iPSCs，其衍生的肺泡類器官雖然含有2型肺泡上皮細胞，但這些細胞缺少板層小體或不能合成SFTPB[109]。以上研究結(jié)果表明通過基因編輯來糾正SFTPB突變也許能改變該疾病患者iPSCs衍生細胞的表型。

2.4 人–動物嵌合體

盡管基于類器官的疾病模型在復(fù)雜性、成熟度和細胞多樣性方面有所拓展，但還是局限于組織培養(yǎng)，限制了與體內(nèi)循環(huán)、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)、激素以及其他代謝介質(zhì)相互作用的探索[110]。此外，類器官還缺少體內(nèi)存在的許多形態(tài)發(fā)生信號[92]。例如，在模擬血液疾病時，體外分化系統(tǒng)很少將微環(huán)境因子納入造血分化和造血干細胞(HSCs)的研究中[111,112]。近年來，細胞和類器官異種移植與人iPSCs的研究進展已經(jīng)克服了這些局限性。鑒于最近許多細胞治療的臨床研究案例呈爆炸性增長之勢，而基于iPSCs的異種移植嵌合體疾病模型已經(jīng)能夠更加忠實地模擬人類疾病并成為推動這些研究進展的可靠工具。

人類神經(jīng)組織的異種移植已經(jīng)用于研究人類疾病幾十年了，人胚胎干細胞的分離培養(yǎng)、iPSCs技術(shù)的發(fā)展、人胚胎干細胞的神經(jīng)分化傾向以及移植模型生物，都為細胞治療提供了一種新型的治療技術(shù)[113]。當(dāng)人類iPSCs分化的神經(jīng)元異種移植到發(fā)育中的小鼠腦中時可以整合、形成功能性突觸并整合到神經(jīng)回路中[114]。iPSCs分化的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(NSCs)在大鼠腦內(nèi)植入后可分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，并可促進缺血性腦卒模型的恢復(fù)[115]。從人類或非人類靈長類動物iPSCs中分化出來的多巴胺能神經(jīng)元可以植入大鼠的大腦，改善帕金森病模型的功能；非人類靈長類iPSCs的多巴胺能神經(jīng)元也可以自體移植，并在體內(nèi)長期植入[116]。這種令人信服的功能恢復(fù)的臨床前證據(jù)為人類帕金森病的臨床試驗提供了強有力的證明；而采用細胞療法修復(fù)海馬體內(nèi)的神經(jīng)連接，目前正在作為研究精神分裂癥的治療方法[117]。最近，宿主血管系統(tǒng)灌注和神經(jīng)活動的電生理學(xué)實驗描述了將人iPSCs衍生的神經(jīng)類器官成功植入到成年小鼠腦中，這為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的全方位建模提供了一個新平臺[118]?？傊?，這些實驗證明了嵌合模型在用iPSCs模擬人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的價值以及基于iPSCs的細胞治療在這些疾病中的可行性。

研究人員已經(jīng)將人iPSCs衍生的類器官移植到小鼠體內(nèi)，以整合血管系統(tǒng)來研究與正常宿主生理的相互作用[119]。來源于人iPSCs的肝內(nèi)胚層細胞可以與內(nèi)皮干細胞和間充質(zhì)干細胞聯(lián)合培養(yǎng)以形成原始的肝芽，這些肝芽異種移植后與小鼠血管系統(tǒng)形成功能聯(lián)系，然后將人白蛋白釋放到小鼠血清中并產(chǎn)生人類特有的藥物代謝產(chǎn)物[119]。研究結(jié)果還表明移植這些肝芽可以提高小鼠肝衰竭模型的存活率[119]。從家族性高膽固醇血癥患者的iPSCs中分化出的肝細胞已經(jīng)被異種移植來模擬這種疾病[120]。

將腫瘤異種移植到免疫缺陷小鼠模型中是近年來腫瘤研究的一項關(guān)鍵技術(shù)。在人類iPSCs惡性血液腫瘤模型中，已經(jīng)開發(fā)出形成造血嵌合體的案例[121]。急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia, AML)細胞在(也稱為)基因座上發(fā)生易位，可以通過阻斷異常的驅(qū)動的DNA甲基化并有效地將其重新編程為多能性細胞，并能再分化為非造血系細胞[121]。然而，在定向分化為造血祖細胞后，這些細胞在培養(yǎng)和移植過程中表現(xiàn)出異常的自我更新能力，因此該系統(tǒng)可用于模擬人AML的克隆結(jié)構(gòu)，并可用于區(qū)分這些iPSCs衍生亞克隆的藥物敏感的差異性[121]?；谌祟恑PSCs的嵌合體也被用來模擬實體腫瘤。人膠質(zhì)母細胞瘤細胞重編程成iPSCs可消除抑瘤基因啟動子的高甲基化功能，當(dāng)iPSCs定向分化為神經(jīng)祖細胞時，這些細胞保留了惡性潛能，在異種移植到小鼠紋狀體時形成侵襲性腫瘤[122]。從患有Li–Fraumeni綜合征的患者中獲得的iPSCs衍生的成骨細胞攜帶有種系突變，這些患者易患多種實體惡性腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在免疫缺陷小鼠皮下注射后形成骨肉瘤樣腫瘤[123]。今后利用來源于iPSCs的類器官和異種移植到小鼠體內(nèi)的研究可以為實體瘤的發(fā)生和發(fā)展提供新的視角。

4 基于iPSCs的臨床研究

除了疾病建模之外，iPSCs最大的潛力之一是對許多遺傳和退行性疾病進行細胞和基因替代治療[124]。在這種方法中，病人的體細胞被分離和培養(yǎng)，再通過病毒或非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移被重新編程成iPSCs，接著使用基因編輯技術(shù)或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對患者來源的iPSCs進行基因糾正，基因糾正篩選出的iPSCs分化為受影響的細胞亞型。在進行細胞鑒定以及純度、活性和安全性的質(zhì)量控制試驗后，將基因匹配的健康細胞移植到患者體內(nèi)進行細胞治療。這種自體移植的方法可以防止嚴重的并發(fā)癥，如通常發(fā)生在同種異體移植后的移植物抗宿主病。iPSCs在疾病治療中的應(yīng)用如圖3所示。

然而，在常規(guī)的臨床應(yīng)用開始之前，基于iPSCs的治療有幾個障礙需要解決，其中一個是iPSCs的致瘤風(fēng)險[125]。由于iPSCs在培養(yǎng)基中培養(yǎng)了很長時間，它們會積累核型異常、拷貝數(shù)變異和雜合性喪失[126]。因此，在臨床使用之前，iPSCs衍生產(chǎn)品需要仔細篩選以確定是否存在潛在風(fēng)險的基因改變[126]，并進行嚴格測試以確保其純度、質(zhì)量和無菌性。另一個問題是生成可用于臨床的iPSCs的成本很高且耗時較長，解決這個問題需要建立能夠儲存大量人類白細胞抗原(HLA)純合超供體iPSCs的細胞庫[127]。其中一個例子是2013年日本成立了京都大學(xué)iPSCs研究與應(yīng)用中心(CiRA)。CiRA是一家異基因iPSCs庫，收集了50份來自健康志愿者的外周血T淋巴細胞和臍血HLA純合標本，在HLA的三個主要位點(HLA-A、HLA-B和DRB1)進行匹配[128]。2015年，Cellular Dynamic International, Inc.還成立了一家細胞治療庫，可以滿足19%的美國人口需求。人們相信，以可承受的成本為數(shù)百萬患者提供大量合適細胞的HLA單體型純合iPS細胞庫可能是一種有效的細胞治療的策略。第三個障礙是iPSCs衍生細胞的異質(zhì)性和不成熟性。通常，iPSCs衍生的細胞是異質(zhì)的。例如，在iPSCs衍生神經(jīng)元細胞的各種方案中，衍生細胞常常包含不同類型的神經(jīng)元和其他細胞(如膠質(zhì)細胞)[129]。在臨床使用前，必須嚴格控制這種異質(zhì)性，以確保植入細胞的一致性。因此，可以通過熒光活化細胞分選法(fluorescence-activated cell sorting, FACS)或磁激活細胞分選法(magnetic- activated cell sorting, MACS)對iPSCs衍生細胞進行分類[130]，僅選擇臨床研究需要的相關(guān)衍生細胞。從人類iPSCs分化出的各類細胞都顯示出類似胚胎或新生細胞的表型，這表明iPSCs衍生的細胞是不成熟的。添加甲狀腺激素[81]、長期培養(yǎng)[82]等方法都能促進iPSCs衍生細胞成熟，將iPSCs衍生的組織作為嵌合體植入動物體內(nèi)將進一步促進iPSCs衍生的組織成熟[131]，但iPSCs衍生細胞仍然與成熟細胞的狀態(tài)有一定差距。異種移植和類器官技術(shù)的進一步發(fā)展將有助于克服這個障礙，進而促進iPSCs臨床研究的發(fā)展。

圖3 iPSCs在疾病治療中的應(yīng)用

第一次iPSCs臨床試驗(第一階段)于2014年9月在日本進行。來自RIKEN發(fā)展生物學(xué)中心的高橋雅代證明了基于iPSCs的視網(wǎng)膜色素變性(RP)治療的安全性，RP的主要特征是眼睛內(nèi)額外的血管形成導(dǎo)致視力完全喪失?；颊咴诮邮茏泽wiPSCs衍生的視網(wǎng)膜色素上皮細胞移植治療后,視力有所改善[132]。與此相反的是，Kuriyan等[133]報告了使用自體脂肪干細胞治療老年性黃斑變性(AMD)的災(zāi)難性結(jié)果，即患者視力迅速喪失，需要緊急護理。因為不需要大量的制備細胞，使用自體iPSCs產(chǎn)品進行個性化藥物治療似乎是單基因疾病的理想選擇，但對于更常見的疾病，特別是如心肌梗死等急性常見疾病，自體iPSCs療法可能不適用于大部分患者，因為仔細檢驗每個細胞系需要高昂的成本和大量的時間。也因為這些原因，日本iPSC-RPE實驗的第二階段將使用異基因產(chǎn)品[134]。這些事件表明了基于iPSCs的細胞治療還有很長的一段路要走。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)T細胞治療策略已被證明能成功地介導(dǎo)血液惡性腫瘤的消退。但大量制備自體T細胞可能成為負擔(dān)，特別是由于免疫抑制或細胞毒性治療、體外低淋巴細胞計數(shù)和健康T淋巴細胞的無效擴增[135]。解決方案是對患者衍生的iPSCs進行改造，從而生成和HLA無關(guān)的可定制抗原識別的抗原特異性的CART細胞。經(jīng)基因組編輯的完全相同的人類iPSCs (不論其HLA單倍型如何)可以進一步分化為全功能的組織相容性腫瘤靶向T細胞[136]。迄今為止，動物模型的臨床前研究表明，iPSCs衍生的工程CART細胞(iCART)細胞具有抗腫瘤活性[137]。2019年，CiRA和Takeda合作宣布，第一個iCART細胞治療計劃將于2021年開始臨床試驗第一階段。iCART治療可以根據(jù)需要為患者量身定制現(xiàn)成的免疫療法[138]。iCART殺死癌細胞的潛在益處，凸顯了臨床進化和治療應(yīng)用的一個重要里程碑。

與T細胞相比，自然殺傷細胞(NK細胞)是一種淋巴細胞，在天然免疫系統(tǒng)介導(dǎo)抗腫瘤和抗病毒活性的能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用而無需MHC限制。應(yīng)用NK細胞免疫療法治療急性髓系白血病的臨床試驗已顯示出顯著的療效，而對其他惡性腫瘤的療效則較低[139]。但NK細胞與T細胞的健康細胞群都很難獲得，通常由單核細胞和其他血細胞的異質(zhì)混合物組成。iPSCs的出現(xiàn)提供了一種獨特的解決方案：可以生產(chǎn)同質(zhì)和明確的NK細胞群，這些NK細胞很容易通過基因改造來提高抗腫瘤活性，用于臨床大規(guī)模生產(chǎn)“現(xiàn)成”細胞[140]。修飾后的NK細胞可以表達多種受體，如高親和力DC16-Fc受體或CAR受體，也可以與其他療法聯(lián)合應(yīng)用來提高其抗實體瘤的能力[141]。到目前為止，第一項研究顯示iPSCs作為一個平臺生產(chǎn)帶有靶向腫瘤的CAR受體的NK細胞的可行性和有效性，在卵巢癌異種移植模型中顯示出令人印象深刻的抗腫瘤活性，且該細胞在體內(nèi)的存活擴展毒性較小[142]。2018年11月，人類臨床試驗(NCT0384110)獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準，首次使用克隆iPSCs產(chǎn)生的現(xiàn)成NK細胞(命名為FT500)與T細胞協(xié)同作用，以更好地治療實體惡性腫瘤。向三名患者給藥(每次給藥含1×108細胞，并結(jié)合檢查點抑制劑和單克隆抗體)，初步安全性評估顯示在最初28天的觀察期內(nèi)沒有嚴重不良事件。2019年2月，F(xiàn)T500治療方案在64名不同惡性腫瘤患者中進行了進一步的安全性測試，臨床試驗?zāi)壳罢谶M行中(NCT0384110)。日本京都大學(xué)已授權(quán)武田制藥(Takeda Pharmaceuticals)開發(fā)基于iPSCs的現(xiàn)成CART細胞平臺并將其商業(yè)化，第一次臨床試驗的目標日期為2021年。將這些臨床前研究轉(zhuǎn)化為臨床試驗的潛力是令人期待的。

5 結(jié)語與展望

自iPSCs技術(shù)建立以來，盡管人們在研究疾病機制和潛在治療方面通過將人類iPSCs與其他新技術(shù)相結(jié)合而取得了很大進展，但仍有幾個重要問題有待解決。除iPSCs衍生的如心肌細胞、腎細胞等各類細胞都顯示出成熟度的不足外，iPSCs在重編程過程中與細胞特性、年齡、代謝相關(guān)的體細胞記憶的存在也格外引人注目?？紤]到iPSCs可能保留與腫瘤細胞部分相關(guān)的體細胞記憶(癌基因表達、Warburg代謝譜)[143,144]，篩選和消除這些記憶以減少移植時腫瘤形成的風(fēng)險，此類研究更為急迫且意義重大，但是目前還缺乏有效的方法來避免或消除這些體細胞記憶。

綜上所述，iPSCs技術(shù)的發(fā)展為定義和治療疾病提供了一種強有力的新方法，因為iPSCs代表了一種范式的轉(zhuǎn)變：允許人們直接觀察和治療相關(guān)的病人細胞，揭示了基因表達的新關(guān)系，拓寬和加深了人們對各種疾病發(fā)展的理解。以CRISPR/Cas9、3D類器官、動物嵌合體和microRNA分子開關(guān)等為代表的新技術(shù)的出現(xiàn)和不斷革新，將進一步推動基于iPSCs的疾病建模和治療發(fā)展。雖然iPSCs的應(yīng)用尚處于起步階段，應(yīng)用風(fēng)險較大，但相信在下一個15年，iPSCs的應(yīng)用會在個體化再生醫(yī)學(xué)和腫瘤免疫治療方面展現(xiàn)出廣闊的前景。

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Induced pluripotent stem cell technology and its application in disease research

Chenyi Cai, Feilong Meng, Lin Rao, Yunyue Liu, Xiaoli Zhao

Since Takahashi and Yamanaka reported the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) in 2006, the field of pluripotent stem cells has entered an unprecedented state of development. It plays an important role in disease modeling, drug discovery and cell therapy, and promotes the development of cell biology and regenerative medicine. At present, iPSC technology has become an important tool for studying of pathological mechanisms. New drugs screened by iPSC technology are being developed, and the number of clinical trials using iPSC-derived cells is gradually increasing. The latest research progress of iPSCs, combined with gene editing technology and 3D organoid methodology, promotes the further applications of iPSCs in disease research. In this review, we introduce the innovation of reprogramming methods in recent years, analyze the advantages and disadvantages of four reprogramming methods: integrated virus vector system, integrated non-viral vector system, non-integrated virus vector system and non-integrated non virus vector system. At the same time, we summarize the latest research progress on iPSCs in disease modeling and clinical treatment strategies, so as to provide a reference for further in-depth research in various fields of iPSCs.

iPSCs; reprogramming; disease modeling; cell therapy

2020-08-12;

2020-10-19

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目(973計劃)(編號：2012CB967900)資助[Supported by the National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2012CB967900)]

蔡晨依，碩士研究生，專業(yè)方向：干細胞分化。E-mail: caichenyii@163.com

趙小立，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：干細胞分化。E-mail: zhaoxiaoli@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-235

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201103.1422.004.html

URI: 2020/11/4 16:41:52

(責(zé)任編委: 李大力)