陳萬銀，顏一丹，欒曉瑾，王敏，方杰

研究報告

基因在果蠅睪丸生殖細胞中的功能分析

陳萬銀，顏一丹，欒曉瑾，王敏，方杰

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，鎮(zhèn)江 212001

生殖細胞的自我更新及分化過程對于男性不育及生殖細胞腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要，基因作為果蠅()睪丸生殖干細胞的調(diào)控因子之一，其功能機制尚不清楚。為了探討基因在果蠅睪丸生殖細胞中的生物學(xué)功能，本研究首先通過UAS-gal4系統(tǒng)介導(dǎo)的RNAi途徑，驅(qū)動果蠅睪丸生殖細胞和包囊細胞中UAS-RNAi的表達，觀察后代雄性果蠅的生育能力；其次，通過免疫熒光染色方法檢測對照組和RNAi雄性果蠅睪丸中Vasa、IBI、鋅指結(jié)構(gòu)域1蛋白(Zn finger homeodomain 1, Zfh1)、眼缺陷蛋白(eyes absent, Eya)、DE-cad、FasIII以及磷酸化組蛋白H3 (phospho-histone H3, PH3)、TUNEL等表達模式；最后，使用小干擾RNA (siRNA)在果蠅 S2 細胞中將基因表達沉默，用PH3檢測對照組和siRNA組中果蠅S2細胞增殖能力，TUNEL及流式凋亡檢測技術(shù)分析果蠅S2細胞凋亡情況；通過熒光定量PCR檢測剪接體亞基的mRNA水平，觀察剪接體的相對表達量。結(jié)果表明，與對照組果蠅比較，在生殖細胞和包囊細胞中缺失基因，雄性果蠅的生育能力降低甚至完全喪失；另外，nos-gal4驅(qū)動UAS-RNAi的雄性果蠅中生殖細胞及生殖融合體消失，并且生殖細胞增殖能力減弱，而tj-gal4驅(qū)動UAS-RNAi的果蠅睪丸中出現(xiàn)生殖細胞樣腫瘤；在果蠅S2細胞中敲減基因?qū)е录毎蛲鲈黾?，增殖受到抑制；基因在果蠅S2細胞中沉默引起剪接體亞基的信使RNA水平升高。可見，基因在果蠅睪丸生殖細胞的自我更新與分化過程中必不可少，其缺失可能導(dǎo)致生殖細胞存活受限甚至生殖細胞樣腫瘤的形成；并且基因可參與果蠅S2細胞的增殖和凋亡，對于細胞生命的維持至關(guān)重要，同時可競爭性調(diào)節(jié)剪接體亞基的mRNA水平。

基因；果蠅睪丸；生殖細胞；自我更新與分化；增殖與凋亡

通常認(rèn)為干細胞需要在特定的環(huán)境中才能保持自我更新及分化的性狀，對于組織穩(wěn)態(tài)及細胞生長至關(guān)重要[1,2]。果蠅()睪丸中存在有兩種干細胞類型，包括生殖干細胞(germline stem cells, GSCs)和體細胞干細胞(cyst stem cells, CySCs)[3,4]，它們均與睪丸頂端的中心(Hub)細胞相連，共同構(gòu)成生殖干細胞微環(huán)境(stem cell niche)[5~7]。GSCs產(chǎn)生的一個子代細胞經(jīng)過4輪有絲分裂分化為16個精原細胞，繼而經(jīng)過精母細胞、圓形精子、長形精子和成熟精子完成整個生精過程[8]。兩個由CySCs分化而來的包囊細胞包裹著生殖細胞并且支持著生殖細胞的生長[3]。而Hub細胞主要維持著GSCs和CySCs的自我更新及分化[9,10]。

干細胞微環(huán)境內(nèi)的多條重要信號通路調(diào)控著干細胞的自我更新及分化過程[8,11]，許多研究表明，Hub細胞通過分泌Upd因子在GSCs和CySCs激活JAK-STAT信號通路，維持這兩類細胞自我更新的能力[12,13]。另外，Hub細胞通過CySCs激活Hh信號通路來維持干細胞自我更新的性狀[14]。此外，大量研究證明多種細胞因子也參與調(diào)控干細胞微環(huán)境，其中，剪接體亞基與果蠅睪丸干細胞自我更新及分化之間存在密切關(guān)系。比如U2A剪接因子通過影響生殖細胞分化從而影響雄性果蠅生育能力[15]。PrP3作為PrP復(fù)合體中的關(guān)鍵剪接體成分，對于雄性果蠅生育及生殖系干細胞的自我更新及分化至關(guān)重要[16]。

果蠅遺傳學(xué)研究中常用UAS-gal4系統(tǒng)異位表達轉(zhuǎn)基因果蠅，用于激活UAS下游靶基因。Yu等[6]通過對2881個果蠅睪丸進行RNA干擾(RNAi)，共鑒定到221個參與生殖細胞自我更新過程的調(diào)控因子，其中基因的表達具有差異性?；蛟诩毎芷谶M程及信使RNA衰減等過程中發(fā)揮作用，通過Flybase數(shù)據(jù)庫(http://flybase.org/)顯示基因與維持細胞壁完整性有關(guān)，起到凋亡調(diào)節(jié)劑的作用，而其對果蠅睪丸生殖細胞凋亡的影響尚不明確。因此，本研究分析了基因在果蠅睪丸生殖細胞中的生物學(xué)功能及基因?qū)塖2細胞增殖及凋亡的影響，探索了基因沉默與剪接體亞基之間的潛在聯(lián)系，為研究基因的作用機制提供方向。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系及飼養(yǎng)

UAS-RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅購自清華果蠅中心(Tsinghua Fly Center, THFC)，該品系來源于TRiP RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫(Transgenic RNAi Project)。gal4轉(zhuǎn)基因果蠅品系信息如下：nos-gal4 (BDSC, #4937)，tj-gal4 (DGRC, #104055)。WT品系果蠅為野生型果蠅，作為對照組，來源于THFC果蠅庫。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

所有果蠅均在溫度25℃、相對濕度60%的條件下飼養(yǎng)。

1.2 果蠅雜交策略

分別挑選nos-gal4、tj-gal4品系雄性果蠅與UAS-RNAi的處女蠅進行雜交。在出生2 d內(nèi)的F1代中挑選特定基因型(nos>RNAi、tj>RNAi)的果蠅用于后續(xù)實驗。nos>RNAi和tj>RNAi基因型分別指的是在生殖細胞和包囊細胞中敲減基因。

1.3 生育率測試

在F1代果蠅中挑選單只特定基因型(UAS-RNAi)的成年雄蠅與3只野生型處女蠅雜交，觀察其是否可以獲得后代果蠅。通過統(tǒng)計F1代成年雄性果蠅生育比例判斷雄性果蠅的生育能力。

1.4 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

利用快凍慢融的原理復(fù)蘇果蠅S2細胞后，放入DMEM+10%胎牛血清(以色列Bioind公司)配制的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為28℃恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，根據(jù)細胞生長速度和狀態(tài)，及時進行細胞換液和細胞傳代，并以適當(dāng)密度重新接種至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)[17]。待細胞生長至80%~90%密度后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟如下：由蘇州吉瑪基因公司設(shè)計并合成siRNA序列，使用Lipo2000脂質(zhì)體(美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染S2細胞。使用250 μL Opti-MEM (美國Gibco公司)稀釋成15 μL的Lipo2000，輕輕混勻后室溫放置5 min，在250 μL opti-MEM中加入15 μL小干擾RNA (siRNA)，將兩管混合物充分混勻后，室溫放置20 min，使siRNA終濃度為150 nmol/L作為最終培養(yǎng)基加入細胞培養(yǎng)板中，6 ｈ后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。siRNA序列見表1。

1.5 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測

果蠅S2細胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(日本TaKaRa公司)進行。將目的DNA及相應(yīng)的引物與SYBRGreen染料配成10 μL反應(yīng)體系在反應(yīng)管中充分混勻，4℃短暫離心，置入熒光定量PCR儀(美國安捷倫公司)中進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)。溶解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。以作為內(nèi)參，以Folds=2–ΔΔCt表示目的基因在實驗組與對照組中表達的倍比關(guān)系。qRT-PCR引物序列見表2。

1.6 免疫熒光檢測果蠅S2細胞的增殖與凋亡

將轉(zhuǎn)染24 h后的果蠅S2細胞放入六孔板中進行種板，孵育24 h后在培養(yǎng)皿中進行免疫染色。具體步驟如下：4%多聚甲醛固定30 min。在含有0.1%Triton X-100(PBST)的1×PBS中洗滌3次，并在5%牛血清白蛋白BSA (上海生工生物工程股份有限公司)中封閉30 min后，將樣品與一抗(Vasa購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，1B1、Zfh1、Eya、DE-cad、FasIII均購自美國Developmental Studies Hybridoma Bank公司，PH3購自美國Cell Signaling Technology公司)在室溫孵育1 h或4℃過夜。之后0.1%PBST中洗滌3次，每次10 min。然后將樣品在室溫下與二抗(包括488-兔二抗、cy3-小鼠二抗、647-大鼠二抗，均購自美國Molecular Probes and Jackson Immunologicals公司)一起孵育1 h，之后在0.1%PBST中洗滌3次。用Hoechst 33342(美國Invitrogen公司)染色10 min，加入20 μL 80%甘油，蓋上蓋玻片封片。在奧林巴斯BX51熒光正置顯微鏡上捕獲圖像并使用Adobe Photoshop CS5軟件處理。使用Image J軟件對熒光強度進行定量分析。

表1 本研究所用的siRNA序列

表2 本研究所用的qRT-PCR引物序列

1.7 流式細胞分析果蠅S2細胞凋亡

將siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的果蠅S2細胞，根據(jù)Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)的說明書進行操作。根據(jù)細胞計數(shù)取1×106個細胞進行離心，用250 μL結(jié)合換緩沖液重懸細胞沉淀，與2.5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647和5 μL PI混合，然后將其在黑暗室溫下孵育15 min，每個樣品加入200 μL PBS，使用FACScan流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)分析樣品。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad軟件(https://www.graphpad.com/)進行數(shù)據(jù)的處理和分析，Student-檢驗評估數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異，定量結(jié)果表示為平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。0.05，0.01，0.001，n.s 無統(tǒng)計學(xué)意義。所有的實驗生物學(xué)樣本重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 在生殖細胞與包囊細胞中敲減CG8005基因?qū)е滦坌怨壣氏陆?/h3>

為了探究基因與雄性果蠅生育能力的相關(guān)性，本研究分別在生殖細胞和包囊細胞中表達的gal4來驅(qū)動UAS-RNAi。生育率測試(表3)結(jié)果表明，生殖細胞中敲減基因(nos>RNAi)導(dǎo)致雄性果蠅完全不育，生育率為0.00% (=59,<0.001)；包囊細胞中敲減基因(tj>RNAi)，雄性果蠅生育率下降至19.67% (=61,<0.001)。

2.2 在生殖細胞中敲低CG8005基因?qū)е律臣毎笔?/h3>

本研究首先利用免疫熒光技術(shù)，并通過多種睪丸細胞相關(guān)抗體觀察基因在果蠅睪丸中的功能。其中，生殖細胞可以被Vasa抗體標(biāo)記，融合體(fusome)可用IBI蛋白標(biāo)記，其在睪丸頭部頂端呈點狀分布，隨著生殖細胞的分化，逐漸發(fā)展成樹杈狀；CySCs可被鋅指結(jié)構(gòu)域1蛋白(Zn finger homeodomain 1, Zfh1)標(biāo)記；成熟的包囊細胞被眼缺陷蛋白(eyes absent, Eya)標(biāo)記。通過共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，nos>RNAi組睪丸形態(tài)坍塌、內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，呈現(xiàn)小睪丸表型，此時生殖細胞及融合體均全部消失(圖1)。為了進一步探索被DNA標(biāo)記的細胞核來源，利用體細胞相關(guān)免疫抗體進行檢測，睪丸頂部的CySCs和包囊細胞的細胞數(shù)目明顯增多，Eya積累與Zfh1信號發(fā)生重合(圖1)。以上結(jié)果提示，基因在早期生殖細胞中導(dǎo)致生殖細胞缺失。

表3 敲減CG8005基因雄性果蠅生育率的測試結(jié)果

采用卡方檢驗計算統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 在生殖細胞中敲低CG8005基因生殖細胞增殖能力減弱

黏附蛋白DE-cad是中心細胞和體細胞的標(biāo)記物，生殖細胞中缺失基因，睪丸頭部頂端的中心細胞消失不可見，體細胞與增多的包囊細胞同步定位(圖2)，包囊細胞屬于種系而不是生殖系。磷酸化組蛋白 H3 (phospho-histone H3，PH3)作為增殖細胞的標(biāo)記物，在正常果蠅睪丸早期生殖細胞中僅存在1~3個。本研究進一步利用免疫熒光技術(shù)檢測生殖細胞消失后其增殖能力的改變，結(jié)果顯示在對照組果蠅睪丸頭部頂端可檢測到PH3信號，而nos>RNAi組中未檢測到PH3表達(圖2)，提示生殖細胞缺失可能與其增殖能力減弱有關(guān)。

圖1 缺失CG8005基因生殖細胞的表達模式

Vasa抗體(紅色)標(biāo)記生殖細胞，IBI抗體(綠色)標(biāo)記生殖融合體。Zfh1抗體(紅色)標(biāo)記體細胞干細胞，Eya抗體(綠色)標(biāo)記包囊細胞，DNA標(biāo)記細胞核(灰色)。標(biāo)尺：20 μm。

圖2 生殖細胞中敲低CG8005基因?qū)ι臣毎鲋衬芰Φ挠绊?/p>

體細胞被DE-cad抗體(紫色)識別，Eya抗體(綠色)標(biāo)記包囊細胞。PH3抗體(紅色)檢測細胞增殖能力，F(xiàn)asIII抗體(綠色)標(biāo)記中心細胞，DNA標(biāo)記細胞核(灰色)。標(biāo)尺：20 μm。

2.4 在包囊細胞中敲低CG8005基因影響生殖細胞分化

為了探索果蠅睪丸中基因在包囊細胞中的功能，本研究利用tj-gal4在包囊細胞中敲低基因。免疫熒光結(jié)果顯示，對照組睪丸頂部的中心細胞被FasIII抗體識別，而實驗組中FasIII信號消失，Zfh1和Eya染色結(jié)果顯示不存在CySCs和包囊細胞(圖3)。有研究表明，中心細胞參與調(diào)控生殖干細胞自我更新與分化過程，本研究結(jié)果顯示，tj>RNAi組睪丸失去了正常的形態(tài)，中心細胞缺失，并在果蠅睪丸中出現(xiàn)被Vasa抗體標(biāo)記的異常細胞團塊，此時樹杈狀的融合體變成點狀(圖4)，最終導(dǎo)致細胞過度增殖，形成生殖細胞樣腫瘤。這些未分化的生殖細胞團塊被TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端)標(biāo)記，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示凋亡細胞比率近30% (圖4)，提示這些細胞具有凋亡能力，表明基因是生殖細胞形成所必需的。以上結(jié)果揭示了基因在包囊細胞中影響生殖細胞的分化過程。

圖3 在包囊細胞中敲低CG8005基因?qū)ι臣毎绑w細胞的影響

Vasa抗體(紅色)標(biāo)記生殖細胞，F(xiàn)asIII抗體(綠色，放大)標(biāo)記中心細胞。Zfh1抗體(紅色，放大)標(biāo)記體細胞干細胞，包囊細胞被Eya抗體(綠色)識別。DNA標(biāo)記細胞核(藍色)。標(biāo)尺：20 μm。

2.5 CG8005基因缺失抑制果蠅S2細胞增殖

為了進一步探究基因的體外功能，本研究使用兩個siRNA (si-1和si-2)將基因在果蠅S2細胞中表達沉默。通過熒光定量PCR檢測對照組、si-1組和si-2組中信使RNA (mRNA)表達水平，結(jié)果顯示片段si-1敲減效率52%，而si-2敲減效率達70%，因此選用片段si-2進行后續(xù)實驗(圖5A)。在果蠅S2細胞中敲減基因，用檢測細胞增殖能力標(biāo)記物PH3進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，與對照組相比，si-2組PH3陽性細胞減少(圖5B)，對照組PH3陽性信號百分比為5.8%，實驗組下降至4.3%，具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖5C)。以上結(jié)果表明，在果蠅S2 細胞中敲減基因抑制細胞的增殖。

2.6 CG8005基因缺失導(dǎo)致果蠅S2細胞凋亡

運用UAS-gal4系統(tǒng)實現(xiàn)基因在睪丸中缺失，導(dǎo)致生殖細胞自我更新和分化異常。本研究進一步分析基因?qū)塖2細胞存活的影響，利用TUNEL免疫熒光技術(shù)檢測凋亡細胞，結(jié)果顯示，與對照組相比，si-2組果蠅S2細胞中TUNEL陽性細胞增加(圖6A)，實驗組中TUNEL陽性細胞百分比從2%上升至7% (圖6B)。流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果與TUNEL免疫熒光結(jié)果一致(圖6C)，凋亡細胞增加存在統(tǒng)計學(xué)意義(圖6D)。反映基因敲減后，果蠅S2細胞凋亡增加。

圖4 在包囊細胞中敲低CG8005基因?qū)ι橙诤象w和細胞凋亡影響

IBI抗體(綠色)標(biāo)記生殖細胞間融合體，黃色箭頭表示點狀融合體，白色箭頭表示樹杈狀融合體。TUNEL末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端。柱狀圖表示TUNEL陽性細胞百分比。DNA標(biāo)記細胞核(藍色)。標(biāo)尺：20 μm。

2.7 CG8005基因沉默影響剪接體亞基的表達

剪接體在疾病的發(fā)生中具有重要的意義，主要的剪接體對于mRNA加工和細胞存活至關(guān)重要，剪接體亞基U2A的突變會損害精原細胞的分化，阻礙生殖細胞成熟為精子。為了初步探索基因與剪接體亞基之間的聯(lián)系，本研究主要利用qRT-PCR方法，對主要剪接體的相對表達量進行分析。結(jié)果表明，剪接體亞基(、、、S、、和)的mRNA水平均在敲減基因的果蠅S2細胞中表達上調(diào)(圖7)，提示基因沉默可能促進了剪接體亞基的表達，從而影響它們的功能。

3 討論

精子發(fā)生過程中任何障礙最終可能導(dǎo)致男性不育，其中生殖細胞的功能異常對于男性生育能力尤為重要。并且有證據(jù)顯示，生殖細胞腫瘤患者在年輕的時候存在生育相關(guān)問題，提示不育癥可能是生殖細胞腫瘤發(fā)病的高危因素[17]。

圖5 在果蠅S2細胞中缺失CG8005基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?/p>

A：qRT-PCR法檢測在果蠅S2細胞中轉(zhuǎn)染si1、si-2驗證干涉效率；B：免疫熒光檢測在果蠅S2細胞中轉(zhuǎn)染si-2細胞的增殖能力；C： PH3陽性細胞百分比。*<0.05；***<0.001。標(biāo)尺：30 μm。

圖6 在果蠅S2細胞中缺失CG8005基因?qū)毎蛲鏊降挠绊?/p>

A：免疫熒光檢測在果蠅S2細胞中轉(zhuǎn)染si-2細胞的凋亡情況；B：TUNEL陽性細胞百分比；C：流式檢測細胞凋亡情況；D：流式各組細胞百分比。***<0.001；n.s 無統(tǒng)計學(xué)差異。標(biāo)尺：30 μm。

圖7 CG8005基因沉默對剪接體亞基表達水平的影響

**<0.01；***<0.001)。

果蠅具有繁殖時間短、遺傳操作性強、靶基因的RNAi品系資源豐富等優(yōu)勢，在雄性生殖系統(tǒng)(特別是生殖細胞)的研究中具有優(yōu)勢。果蠅睪丸中GSCs是果蠅精子產(chǎn)生的源頭，CySCs為生殖細胞的增殖、生長及分化提供環(huán)境，它們的自我更新與分化過程均需要Hub細胞的維持[18]。Yu等[6]運用果蠅模型在睪丸中篩選到221個生殖干細胞調(diào)控因子，并進一步對這些調(diào)控因子進行深入研究，發(fā)現(xiàn)一些調(diào)控因子可以通過包囊細胞影響生殖細胞的分化過程，最終形成生殖細胞樣腫瘤[6,19]。

CG8005蛋白是一種可能的脫氧蘇氨酸合酶，Bing在線工具分析基因參與細胞周期進程、信使RNA衰減等過程，可催化亞精胺的NAD依賴性氧化裂解，與真核翻譯起始因子5A(elf-5A)的相互作用蛋白，它可能參與應(yīng)激反應(yīng)并維持細胞壁的完整性，充當(dāng)細胞凋亡的調(diào)節(jié)劑。然而，基因在果蠅睪丸生殖細胞中的研究報道十分少見。

本研究結(jié)果提示，缺失基因雄性果蠅盡管可以存活，但其生育能力明顯下降。更重要的是，nos-gal4主要在生殖干細胞和精原細胞中表達，并在生精過程中逐漸下降，RNAi組中睪丸形態(tài)縮小，生殖細胞及融合體消失，包囊細胞及CySCs代償性增加，盡管這些細胞具有一定的增殖能力，最終依然導(dǎo)致生殖細胞死亡。而tj-gal4主要在體細胞的包囊細胞中表達，有研究報道GSCs正常分化過程受到CySCs的調(diào)控，CySCs缺陷可以介導(dǎo)生殖細胞分化阻滯最終發(fā)展為生殖細胞腫瘤[1]。本研究運用tj-gal4介導(dǎo)RNAi使用Vasa抗體觀察這些過度增殖細胞的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異常的細胞團塊被生殖細胞信號捕捉，通過FasIII的表達模式中心細胞缺失，連接生殖細胞之間的融合體逐漸由樹杈狀變?yōu)辄c狀，CySCs和包囊細胞消失更進一步的說明細胞不受調(diào)控的增長，形成生殖細胞腫瘤。S2細胞是果蠅中經(jīng)典的細胞模型，在果蠅S2細胞中敲減基因?qū)е录毎麛?shù)目減少，抑制細胞增殖并加重細胞凋亡。最后，基因可能競爭性地影響剪接體亞基的表達，已有證據(jù)表明剪接體復(fù)合物可能在無精癥和生殖細胞腫瘤中起關(guān)鍵作用[16]，使用種系干細胞模型將在未來的研究中進一步評估。

綜上所述，本研究初步揭示了基因在果蠅睪丸生殖細胞中的生物學(xué)功能，基因是一個果蠅睪丸優(yōu)勢表達的生殖細胞作用因子，在生殖干細胞微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用，主要影響生殖細胞的自我更新和分化過程。干涉效率驗證篩選到siRNA片段，為制備RNAi果蠅提供靶向序列。而基因與剪接體亞基之間的競爭性關(guān)系為未來的研究提供方向，為理解男性不育及睪丸生殖細胞腫瘤的發(fā)病機理提供實驗基礎(chǔ)。

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Functional analysis ofgene intestis

Wanyin Chen, Yidan Yan, Xiaojin Luan, Min Wang, Jie Fang

The processes of self-renewal and differentiation of germ cells are crucial to the development of male infertility and germ cell tumors.gene is one of the regulatory factors of the testicular germ stem cells in, and its functional mechanism is still unknown. To explore the biological function(s) ofgene in the germ cell niche oftestis, first, the UAS-gal4 system was used to drive the expression of UAS-RNAi intesticular germ cells and cyst cells. Fertility tests were then performed to determine the fertility rate of male flies. Second, the expression patterns of Vasa, IBI, Zn finger homeodomain 1 (Zfh1), eyes absent (Eya), DE-cad, FasIII and Phospho-Histone H3(PH3), and TUNEL were analyzed by immunofluorescence staining in both control andRNAi testes. Lastly, small interfering RNA (siRNA) was used to silence thegene expression inS2 cells; and PH3 was used to detect the proliferation ability ofS2 cells in the control group andsiRNA group. Apoptosis ofS2 cells was analyzed with TUNEL and flow cytometry. To observe the relative expression of the spliceosome, the mRNA levels of the spliceosome subunits were detected by fluorescence quantitative RT-PCR. As compared with the control group, the results showed that deletion of thegene in the germ cells and cyst cells of the testis reduced or even completely abolished the fertility of male fruit flies. In addition, nos-gal4 driven UAS-RNAi led to loss of fusomes and reduce the proliferative ability of germ cells. Noticeably, tj-gal4-directed UAS-RNAi knockdown ofgene in the testis led to germ cell tumor development. Knockdown ofgene inS2 cells resulted in increase in apoptosis and inhibition of proliferation. Further, the silencing of thegene inS2 cells caused increases in the mRNA levels of the spliceosome subunits. Hence,gene is essential for the self-renewal and differentiation of germ cells intestis. Its deletion may lead to restricted germ cell survival and the formation of germ cell-like tumors.gene can participate in the regulation of proliferation and apoptosis ofS2 cells, which is essential for the maintenance of cell life, and might competitively regulate the mRNA levels of spliceosome subunits.

;testis; germ cells; self-renewal and differentiation; proliferation and apoptosis

2020-06-01;

2020-08-11

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目(編號：SH2018065)資助[Supported by the Zhenjiang Social Development Project(No.SH2018065)]

陳萬銀，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：婦科腫瘤。E-mail: 1031693689@qq.com

方杰，博士，副教授，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤。E-mail: fangjie070@163.com

10.16288/j.yczz.20-163

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201106.0928.002.html

URI: 2020/11/9 10:25:56

(責(zé)任編委: 史慶華)