陳忠仁 歐宗興 王蕾 沈彬 梁海梅 楊緒莉 黃實(shí)仁

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570208)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限持續(xù)存在為主要臨床特征、異常的氣道炎癥為主要病理特征的慢性氣道炎癥性疾病。COPD特征之一就是系統(tǒng)性炎癥〔1〕。 隨著研究的深入，研究者不僅發(fā)現(xiàn)COPD患者在急性期存在系統(tǒng)性炎癥，在穩(wěn)定期系統(tǒng)性炎癥也持續(xù)的存在〔2，3〕。但COPD的氣道炎癥是如何啟動，通過何種途徑引起血液中細(xì)胞因子級聯(lián)瀑布反應(yīng)而損害肺外器官引起并發(fā)癥，目前尚無定論。本研究通過制備COPD大鼠模型，探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路在COPD大鼠氣道炎癥及系統(tǒng)性炎癥中的作用。

1 材料與方法

1.1.1動物 健康清潔級 wistar 大鼠 36只，體重 220～250 g，由斯萊克提供。

1.1.2主要試劑 內(nèi)毒素(Sigma)；LY294002(MCE)；轉(zhuǎn)錄試劑盒、預(yù)混液( TAKARA公司)；白細(xì)胞介素(IL)-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京建成)、IL-1β ELISA 試劑盒(南京建成)；紅梅牌香煙(紅塔集團(tuán))。

1.1.3主要儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀(MK3)THERMO；熒光定量PCR儀(LightCycler?96)羅氏；正置顯微鏡(BK-FL2)重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；煙熏染毒箱(自制)。

1.2動物模型的制備及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將 36 只 1 月齡健康清潔級Wistar 大鼠隨機(jī)平均分為COPD組、干預(yù)組、空白組。COPD組和干預(yù)組依據(jù)宋一平〔4〕的方法造模。方法如下：第1天和第14天經(jīng)氣管滴入2 000 μl(質(zhì)量濃度為 1 μg/μl)內(nèi)毒素后2～30 d(第14天除外)，將大鼠放入5%香煙煙霧中熏0.5 h/d。干預(yù)組在每次煙熏前1 h，均予腹腔注射LY294002，劑量為1.5 mg/kg〔LY294002溶于二甲基亞砜(DMSO)，0.9%氯化鈉注射液稀釋至50 μl〕。而COPD 組和空白組在煙熏前腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3ELISA檢測 采用雙抗體兩步夾心 ELISA 檢測 IL-18、IL-1β 的水平，按試劑盒說明書操作，最后通過酶標(biāo)儀和計算機(jī)得出細(xì)胞因子濃度 。

1.4Real-time PCR檢測氣道平滑肌細(xì)胞PI3K mRNA及血淋巴細(xì)胞NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3 mRNA 取大鼠肺組織和血中淋巴細(xì)胞，加入 TRIzol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。將獲得的 cDNA 按PCR試劑盒說明書方法擴(kuò)增目的基因。引物β-actin正義鏈GGAGAAGATTTGGCACCACAC，β-actin反義鏈ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段長度173 bp。PI3K正義鏈CTGGAATGTGTGGCTGGAGT，PI3K反義鏈AGGAGGAGCGGTGGTCTAT，片段長度198 bp。NLRP3正義鏈AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，NLRP3反義鏈GAGCGTCACCACACACAGAT，片段長度179 bp。反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s共40～45個循環(huán)。計算Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.5氣道平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 每組大鼠最后一次激發(fā)24 h內(nèi), 綁好大鼠，取肺放入燒杯，清洗肺部，用鑷子將肺的內(nèi)外膜除去，只剩下平滑肌。用眼科剪將肺部剪成 1～2 mm的小碎塊。將碎塊移入配好的消化液(含 1 mg/mlⅠ型膠原酶、1 mg/ml木瓜蛋白酶、10 mg/ml牛血清白蛋白的平衡鹽溶液)中，放入培養(yǎng)箱中，消化15 min。取出，加入無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，約10 ml，移入離心管中。980 r/min，離心10 min。倒掉上清，加入約1 ml含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。將碎塊用滴管加入25 ml的培養(yǎng)瓶里,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d換一次液,7 d左右細(xì)胞融合 80%后傳代培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)用2～5代細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)觀察并經(jīng)α-actin免疫熒光染色鑒定。

1.6蘇木素-伊紅染色顯微鏡下觀察肺組織病理 制大鼠肺組織石蠟切片，后予二甲苯脫蠟，續(xù)用酒精水化，后1%伊紅酒精染色，接著酒精梯度脫水，用二甲苯透明，最后封片，在顯微鏡下觀察肺組織病理。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism6.0 和SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析、Pearson分析法。

2 結(jié) 果

2.13 組基本情況比較 空白組進(jìn)食飲水正常，精神活躍，呼吸平順，毛發(fā)潔白光澤，活動靈敏，反應(yīng)迅速；而另外兩組在造模過程中逐漸出現(xiàn)營養(yǎng)差，呼吸急促，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少，皮毛枯槁發(fā)黃。

2.2氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)鑒定及肺組織病理 在顯微鏡下ASMCs有長突起，表現(xiàn)梭形，為典型“峰-谷狀”生長；α-actin免疫熒光染色后為細(xì)胞質(zhì)為棕黃色，呈陽性反應(yīng)，鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。光鏡下可見COPD組支氣管上皮增生增厚，管腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 ASMCs鑒定及肺組織病理

2.33組PI3K、NLRP3 mRNA及細(xì)胞因子水平分析 與空白組比較，COPD組IL-18、IL-1β及NLRP3、PI3K mRNA顯著升高(P<0.05)；與COPD組比較，干預(yù)組以上指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)。肺泡灌洗液中IL-18、IL-1β水平顯著低于血清(P<0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞因子及NLRP3、PI3K mRNA的表達(dá)

2.43組PI3K mRNA水平與細(xì)胞因子之間相關(guān)性分析 PI3K mRNA水平與血清IL-18(r=0.805)、 IL-1β(r=0.757)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

COPD最可能的機(jī)制就是氣道炎癥的外溢機(jī)制〔5〕。近來，隨著人們對炎性小體認(rèn)識的加深，它在COPD中發(fā)生、發(fā)展的作用逐漸被人認(rèn)識到。炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，分布于細(xì)胞質(zhì)中，可以被多種病原相關(guān)分子模式(PAMP)和危險相關(guān)分子模式(DAMP)激活〔6〕。COPD患者中的病原體相關(guān)分子及氧化應(yīng)激分子可以激活炎性小體，而激活的炎性小體可招募并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水平解酶(caspase)-1，剪切IL-1和IL-18前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)作用〔7〕。

PI3K屬于脂質(zhì)激酶的家族，可使肌醇環(huán)第3位羧基磷酸化為磷脂酰肌醇激酶，具有蛋白激酶和類脂激酶雙重活性。PI3K是caspase-1激活的最為公認(rèn)的上游機(jī)制〔8，9〕。有研究指出，可通過抑制PI3K磷酸化來減少NLRP3表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體及細(xì)胞因子IL-18和IL-1β參與了COPD的發(fā)病〔10〕。IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可發(fā)揮炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答的生物學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β能夠增加肺部多種細(xì)胞因子和細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1、E-選擇素的水平，致使嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞發(fā)生炎癥募集并浸潤到支氣管黏膜〔11〕。IL-18主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在促進(jìn)炎癥發(fā)生及對外來致病源免疫中起著重要的作用。陳慶蕓等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，IL-18可能跟COPD的氣道炎癥、系統(tǒng)炎癥和營養(yǎng)狀態(tài)的變化相關(guān)。

本研究表明LY294002能有效抑制PI3K的活性。通過制造COPD模型刺激了PI3K信號通路后，其下游的細(xì)胞因子如IL-1β、IL-18也得到激活、成熟、發(fā)揮生物作用，參與了肺組織的慢性炎癥過程。干預(yù)組的PI3K表達(dá)雖得到抑制，但肺泡灌洗液的細(xì)胞因子表達(dá)仍顯著高于空白組，說明細(xì)胞因子活化后，有自身的正反饋機(jī)制，不完全被上游信號抑制，這也可以解釋為何COPD穩(wěn)定期患者氣道炎癥仍持續(xù)存在〔13，14〕。

本研究結(jié)果表明NLRP3 mRNA在各組大鼠的表達(dá)與PI3K一致，提示NLRP3作為PI3K的下游信號因子，抑制PI3K的表達(dá)可有效抑制NLRP3的活化這與Qiao等〔15〕的研究相符合。與大多數(shù)的研究所指出的一樣〔16〕，NLRP3炎性小體的活化可以使無活性的細(xì)胞因子前體產(chǎn)生為有生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，在全身系統(tǒng)中持續(xù)產(chǎn)生炎癥作用。

研究表明 COPD 的炎癥反應(yīng)不僅僅局限于肺部，而且存在全身的系統(tǒng)性炎癥。COPD 穩(wěn)定期患者同樣存在著系統(tǒng)性炎癥，只是細(xì)胞因子的濃度較急性加重期低。因此系統(tǒng)性炎癥是 COPD 的主要特征之一〔1〕，這也是 COPD 呈進(jìn)行性發(fā)展及存在并發(fā)癥的原因之一。 本研究發(fā)現(xiàn)，COPD作為一個以慢性氣道炎癥為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，其血清的細(xì)胞因子表達(dá)，在3組大鼠中均高于肺泡灌洗液，提示氣道細(xì)胞因子外溢后，可能激活NLRP3及血清的細(xì)胞因子，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，誘發(fā)和維持肺外炎癥。本研究結(jié)果表明PI3K信號通路的激活，不僅可以活化肺部的炎癥，肺外炎癥一樣有促進(jìn)作用；PI3K信號通路對肺外細(xì)胞因子的激活，使其發(fā)揮生物學(xué)作用，也可能是系統(tǒng)性炎癥產(chǎn)生及持續(xù)存在的原因。

綜上所述，抑制PI3K的表達(dá)，可以有效減少NLPR3、IL-1β、IL-18的活化，減輕COPD氣道炎癥及肺外炎癥，為防治COPD及并發(fā)癥提供新思路及新的治療位點(diǎn)。