張雙 鄧華江 張麗云 劉洛同 唐興江 梁雪梅

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1老年病科，四川 瀘州 646000；2神經(jīng)外科；3健康體檢中心；4神經(jīng)內(nèi)科)

目前，不論是顯微手術(shù)的運用，還是臨床藥物、高壓氧等的綜合治療，雖然一定程度上使腦出血病情得到改善，但是其神經(jīng)功能的恢復(fù)效果仍不盡人意。如何更好地促進腦出血導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙恢復(fù)仍是研究的重點及難點。研究證實，細胞凋亡程序的啟動也參與了腦出血后的繼發(fā)性損傷〔1,2〕。同時，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1/凋亡誘導(dǎo)因子(PARP-1/AIF)介導(dǎo)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)非依賴性的細胞凋亡通路在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用〔3～5〕。單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)中，其參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程，具有神經(jīng)保護作用。當中樞、外周神經(jīng)受損或內(nèi)源性GM1不足時，通過補充外源性GM1可起到明顯的早期腦保護作用〔6〕。當腦組織缺血再灌注損傷后，外源性GM1可起到抗凋亡作用〔7〕。但目前GM1抗凋亡作用機制尚不明確，同時其在腦出血損傷中的應(yīng)用也未見報道。本研究探討GM1對大鼠腦出血后神經(jīng)功能障礙的影響及可能機制，為更好地治療腦出血提供一定的實驗依據(jù)，也為腦出血治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組、藥物及器材 80只健康SD大鼠(300～350 g)由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，隨機分為4個組：假手術(shù)組(n=5)，腦出血組(n=25)，小劑量組(n=25)，大劑量組(n=25)；單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(山東齊魯制藥廠)；WDT-V型大鼠腦立體定位儀(西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室)，50 μl微量注射器(上海市安亭微量進樣器廠)；Leica DM2500顯微鏡(德國Leica公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；一抗兔抗鼠凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)多克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)；一抗兔抗鼠PARP-1、Bax,Bcl-2抗體多克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)；二抗快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；抗體稀釋液(上?；蚬?。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠腦出血模型的建立 將大鼠麻醉后，置于36.5～37.5℃溫臺上，取俯臥固定于立體定位儀上，調(diào)整立體定位儀的水平定位針，大鼠頭部至正中位，于頭頂部正中切開長約8 mm縱行切口，分離頭皮暴露顱骨，將微量注射針固定于立體定位儀上，調(diào)整位置，使針尖移動至大鼠顱骨中線右旁3 mm，前囟前方0.2 mm，骨鉆開顱骨，斷尾取血50 μl于微量注射針內(nèi)，將針尖移動至已鉆好的顱孔內(nèi)，并向顱內(nèi)進針6 mm，將血勻速注入大鼠腦尾狀核，注血速度約10 μl/min，完成后留針5 min，之后緩慢退針(約1 min)，封閉顱骨并縫合皮膚，手術(shù)整個過程均為無菌操作。假手術(shù)組：除不斷尾取血注入腦組織外，其余步驟均一致。除假手術(shù)組外，其他各組又分別按處死時間分為6 h、1 d、3 d、5 d、7 d共5個亞組，小劑量及大劑量組大鼠于腦出血手術(shù)后即刻按體重分別經(jīng)腹腔注射小劑量(15 mg/kg)和大劑量(30 mg/kg)GM1各一次，之后每天同一時間按相同劑量給藥直至處死，假手術(shù)組和腦出血組大鼠于每天相同時間點腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2神經(jīng)功能評分 依照Garcia等評分方法進行神經(jīng)功能評分，分數(shù)越低則神經(jīng)功能障礙越重〔8〕。

1.2.3腦組織細胞凋亡程度定量分析 采用TUNEL染色法對大鼠腦組織細胞凋亡情況進行檢測，從每只大鼠中選取5張染色切片，然后置于400倍光學(xué)顯微鏡下，選取連續(xù)6個無重疊血腫周圍組織的視野區(qū)進行觀察，并對TUNEL染色陽性表達的細胞采用Image-Pro-Plus圖像進行分析系統(tǒng)計數(shù)。

1.2.4Western印跡檢測 大鼠在造模后72 h處死，并置于低溫條件下快速提取大鼠腦組織蛋白，測定蛋白濃度，隨后提取蛋白樣品50 μg進行上樣、電泳之后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；以3%牛血清白蛋白(BSA)液封閉1 h，然后加入相關(guān)一抗于4℃孵育過夜；用PBST洗膜3次，每次洗膜約5 min；隨后加入與一抗相對應(yīng)的二抗，并在室溫下輕搖孵育2 h；再次洗膜3次，以電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液將膜在ChemiDocXR+凝膠成像儀中予以曝光顯影，采集相關(guān)信息，用Image Lab程序進行條帶分析，檢測PARP-1，AIF，Bcl-2 和Bax蛋白表達變化情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行重復(fù)測量方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1GM1對大鼠腦出血后神經(jīng)功能障礙的影響 除假手術(shù)組外，其余各組均在術(shù)后出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷癥狀，如：血腫對側(cè)肢體癱瘓、“追尾征”等行為學(xué)改變，且在術(shù)后神經(jīng)功能評分逐漸下降，于術(shù)后第2～3天降至最低。與腦出血組相比較，治療組在對應(yīng)的各時間點大鼠神經(jīng)功能障礙均得到顯著緩解(P<0.05)，且大劑量組顯著優(yōu)于小劑量組(P<0.05)。見表1。

2.2GM1對大鼠腦出血后細胞凋亡的影響 腦出血組及GM1治療組鏡下均可見明顯的TUNEL陽性表達，凋亡細胞明顯多于假手術(shù)組，且在術(shù)后第2～3天達到高峰，隨后逐漸下降。經(jīng)GM1治療后細胞凋亡數(shù)量相對腦出血組減少，且存在量效關(guān)系(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組腦出血術(shù)后細胞凋亡數(shù)量及各時間點神經(jīng)功能評分

圖1 各組腦組織TUNEL染色(×400)

2.3GM1對PARP-1及AIF表達的影響 假手術(shù)組腦組織中PARP-1及AIF蛋白表達量均較低。當腦出血后PARP-1、AIF蛋白表達量明顯增加(P<0.05)，且于術(shù)后第3天達到峰值，小劑量組和大劑量組中PARP-1、AIF的表達均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，且大劑量組下調(diào)程度大于小劑量組(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 腦出血后3 d PARP-1及AIF表達比較

圖2 Western印跡檢測PARP-1、AIF蛋白表達

2.4GM1對Bcl-2及Bax表達的影響 假手術(shù)組腦組織中Bcl-2蛋白高表達，而Bax低表達，Bax/Bcl-2比值(0.15±0.06)較低。當腦出血后Bax蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.005)，且于術(shù)后第3天達到峰值，而Bcl-2表達趨勢與之相反，Bax/Bcl-2比值(3.07±0.16)增高。但經(jīng)GM1干預(yù)后大、小劑量組Bax蛋白表達出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，而Bcl-2出現(xiàn)上調(diào)，Bax/Bcl-2比值(0.75±0.10、1.36±0.15)下降，且大劑量組變化程度大于小劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

腦出血后廣泛存在著細胞凋亡現(xiàn)象〔9〕,細胞凋亡程序的啟動參與了腦出血后的繼發(fā)性損傷，加重腦出血后神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，除了經(jīng)典的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)介導(dǎo)的死亡受體途徑外，非半胱天冬酶介導(dǎo)的凋亡途徑也是一條重要的細胞凋亡途徑，其中包括經(jīng)典的聚PARP-1/AIF介導(dǎo)的凋亡途徑〔10〕。

PARP-1是一種含量豐富的核蛋白，廣泛存在于細胞核內(nèi)，在生理條件下具有調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)定和保護基因穩(wěn)態(tài)性的作用，而當腦組織損傷、細胞缺血缺氧情況下，DNA大量損傷可促使PARP-1過度激活，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及凋亡，最終導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能障礙。因此PARP-1的激活程度可能是調(diào)節(jié)DNA損傷后細胞死亡或存活的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1過度激活可加重腦缺血缺氧性損害，PARP-1抑制劑或PARP-1基因敲除均可顯著減輕神經(jīng)元死亡〔11,12〕。AIF是PARP-1重要的下游因子，當神經(jīng)元缺血缺氧后，PARP-1被大量激活，使細胞質(zhì)內(nèi)PAR聚集，并向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)位，促進線粒體內(nèi)AIF釋放，進入細胞核中，導(dǎo)致染色質(zhì)凝集和DNA大片段斷裂，導(dǎo)致細胞凋亡〔13，14〕。Bcl-2及Bax是bcl-2基因家族中具有代表性的凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax則為促凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比值對細胞的凋亡進行調(diào)控，比值越小，則抑制細胞凋亡，比值越大，則促進細胞凋亡〔15〕。

本研究證實了腦出血后PARP-1/AIF介導(dǎo)的細胞凋亡途徑被激活并在此病理生理過程中起到重要的作用。

神經(jīng)節(jié)苷脂具有促進神經(jīng)元再生和神經(jīng)功能恢復(fù)作用，同時對受損細胞分化功能的維持和生存起重要作用。GM1是最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂之一。當腦組織缺血缺氧，GM1含量明顯下降，而外源性GM1可透過血腦屏障，嵌入受損的神經(jīng)細胞膜上，進而啟動其神經(jīng)保護作用〔16〕。本研究提示GM1對腦出血后PARP-1、AIF表達及Bax/Bcl-2具有一定的調(diào)節(jié)作用，且存在量效關(guān)系。

綜上所述，GMI對大鼠腦出血后神經(jīng)功能具有保護作用，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)PARP-1/AIF通路進而抑制腦出血后細胞凋亡途徑。但關(guān)于GM1如何作用于PARP-1發(fā)揮神經(jīng)保護作用，仍有待進一步研究。