劉芳林 路影 李飛飛 劉濤 (阜陽市第二人民醫(yī)院 婦科，安徽 阜陽 3605；病理科)

宮頸癌是世界第四大最常見的女性惡性腫瘤，而在經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)國家，宮頸癌的發(fā)病率與死亡率更高〔1〕。在我國宮頸癌發(fā)病位居女性惡性腫瘤第二位，且還在逐年攀升，其發(fā)病風(fēng)險與年齡相關(guān)，65歲以上患者占宮頸癌死亡患者的40%以上〔2，3〕。人乳頭瘤病毒(HPV)是與宮頸癌高度相關(guān)的病原體，其感染是宮頸癌的主要危險因素〔4〕。特別是高風(fēng)險HPV的基因型(16、18、30和31)與導(dǎo)致癌前病變和癌變的上皮細(xì)胞改變直接相關(guān)〔5〕。宮頸分泌物涂片檢查是一種簡便非侵入性HPV篩查方法，現(xiàn)在已和薄層液基層細(xì)胞檢測技術(shù)(TCT)一起作為婦科常規(guī)檢查技術(shù)〔6〕。目前關(guān)于宮頸分泌物HPV基因型與老年宮頸癌患者癌前病變的關(guān)系的研究仍很局限。本研究旨在評估宮頸分泌物檢測高危型HPV基因型對宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的篩查效果。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2017年2月1日至2019年2月29日在阜陽市第二人民醫(yī)院婦科行門診陰道鏡的65歲以上患者110例，均接受宮頸細(xì)胞學(xué)涂片及HPV基因型檢測。平均年齡(71.6±6.1)歲，平均體重指數(shù)(BMI)(22.7±3.8)kg/m2。排除既往宮頸癌病史、已接受全子宮切除術(shù)、精神疾病史者。所有患者簽署知情同意書并報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2宮頸細(xì)胞涂片檢查 置入陰道窺器完全暴露宮頸包括宮頸外口和鱗狀及柱狀上皮交界處。使用細(xì)胞刮刀在子宮頸上單向旋轉(zhuǎn)360°，再將細(xì)胞刷置于宮頸內(nèi)并單向旋轉(zhuǎn)180°。將宮頸分泌物樣品涂在載玻片上，并用噴霧固定劑固定。然后將樣品送到病理科進行細(xì)胞學(xué)檢查。發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果包括意義不明的非典型細(xì)胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)或高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)的患者進一步接受陰道鏡檢查和陰道鏡引導(dǎo)病理活檢〔7〕。

1.3HPV基因型檢測 首先使用AmpliLute液體培養(yǎng)基提取及HPV linear array分型試劑盒(購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)從宮頸分泌物中提取DNA。提取的DNA立即保存在-20℃環(huán)境下。然后使用正向(5′-ACACAA CTGTGTTCACTAGC-3′)和反向(5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′)引物對β-珠蛋白基因的268個堿基對片段進行PCR擴增評估DNA樣品的完整性。并使用正向(5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3′)和反向(5′-AAAAAT AAACTGTAAATCATATTC-3′)引物對β-珠蛋白陽性樣品HPV L1開放閱讀框的450個堿基對片段繼續(xù)進行PCR擴增。每次反應(yīng)均包括HPV陽性和HPV陰性對照。最后在含溴化乙錠(0.5 mg/ml)的2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察擴增的PCR產(chǎn)物〔8〕。HPV linear array用于對HPV進行基因分型，可分為與宮頸癌高度相關(guān)的高風(fēng)險型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82，HR-HPV )和與其他低風(fēng)險型(LR-HPV)〔9〕。

1.4統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1基線資料 患者宮頸涂片HSIL、LSIL、ASCUS及炎性細(xì)胞比例分別為13例(11.8%)、14例(12.7%)、20例(18.2%)、63例(57.3%)；HPV分型高危型、低危型及陰性比例分別為36例(32.7%)、21例(19.1%)、53例(48.2%)，其中高危型及低危型為本研究對象，納入后續(xù)研究；共47例接受了病理活檢，包括HPV高危型及低危型43例，其中CIN 3、CIN 2、CIN 1及慢性炎癥比例分別為25.5%、21.3%、12.8%、40.4%及HPV陰性4例(不計入后續(xù)研究)。

2.2HR-HPV及LR-HPV組臨床資料比較 兩組年齡、BMI及宮頸涂片結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，HR-HPV組高級別CIN(CIN 2+CIN 3)患者比例高于LR-HPV組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3HPV分型對病理活檢CIN的診斷價值 HPV分型對診斷CIN的靈敏度、特異度、符合率、kappa值及正確指數(shù)分別為82.1%、92.7%、90.0%、74.0%、0.75；HPV分型對診斷高級別CIN的靈敏度、特異度、符合率、kappa值及正確指數(shù)分別為81.8%、87.5%、86.4%、61.9%、0.69。

2.4HPV分型與細(xì)胞學(xué)檢測并聯(lián)試驗對病理活檢CIN的診斷價值 并聯(lián)試驗對診斷CIN的靈敏度、特異度、符合率、kappa值及正確指數(shù)分別為100.0%、76.8%、82.7%、62.8%、0.77；對診斷高級別CIN分別為100.0%、77.3%、77.3%、50.2%、0.72。見表1。

表1 HR-HPV與LR-HPV組臨床資料比較〔n(%)〕

3 討 論

全球83%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家，2015年我國有近10萬宮頸癌新發(fā)病例與3萬死亡病例〔10〕。早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療是降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。宮頸癌的發(fā)展是一個漸進過程，需要10年以上才能從不典型增生發(fā)展成浸潤性宮頸癌，老年患者無論宮頸癌或其癌前病變的患病率及其進展速度都要高于年輕患者〔11，12〕。HPV持續(xù)感染是宮頸癌最重要的危險因素，高危型HPV與宮頸癌密切相關(guān)，老年婦女的HPV感染率也高于年輕婦女〔13,14〕，因此對HPV進行分型對于老年宮頸癌的預(yù)防有重大意義。根據(jù)2010年進行的一項全球回顧性橫斷面研究，浸潤性宮頸癌HPV基因型前8位分別是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52和HPV58〔15〕。本研究總HPV感染率為51.8%，最常見的基因型為HPV16、HPV18和HPV58。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查也是宮頸癌篩查的主要手段，細(xì)胞學(xué)陽性患者應(yīng)接受陰道鏡檢查〔16〕，本研究結(jié)果顯示對HPV基因分型由此指導(dǎo)患者病理活檢的重要性與日俱增。

在病理活檢CIN 2級以上患者中，HR-HPV比例為81.8%，可見HPV分型與病理活檢陽性有較好的相關(guān)性，此外，HSIL、LSIL及ASCUS細(xì)胞中各有患者HPV檢測呈陰性，病理活檢提示均為慢性炎癥，說明HPV分型可能更有助于提高細(xì)胞學(xué)檢測的特異度，本研究發(fā)現(xiàn)HPV分型對于CIN的靈敏度與特異度較好，符合率達(dá)90%，說明HPV高危型與病理活檢CIN之間有較高的一致性，與前人研究一致〔17,18〕。kappa值及正確指數(shù)為74%和0.75，這可能是由于高危HPV也分為多種基因型造成的診斷結(jié)果可重復(fù)性不佳的緣故，后續(xù)研究需要進一步對高危HPV進行細(xì)分以提高kappa值及正確指數(shù)。當(dāng)下CIN 1級患者可以保守觀察，約60%的患者可自行消退，但CIN 2級以上病變屬于宮頸癌癌前病變，需要積極處理〔19〕，本研究顯示HPV分型對CIN 2級以上病變的診斷價值，其靈敏度及特異度也在80%以上。鑒于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查現(xiàn)已廣泛用于宮頸癌篩查，我們將HPV分型與細(xì)胞學(xué)檢查進行并聯(lián)診斷〔20〕，合并后對于診斷CIN及高級別CIN的靈敏度達(dá)到了100%，顯著增加了宮頸癌癌前病變的篩查效能。

本研究尚存在一些不足：(1)本研究未對高危HPV基因型進行進一步分型，導(dǎo)致診斷試驗可重復(fù)性及正確指數(shù)稍顯不足，需要后續(xù)研究加以補充；(2)本研究樣本量還需進一步擴大以明確HPV分型及細(xì)胞學(xué)試驗的篩查效能；(3)后續(xù)還應(yīng)進一步觀察高危型HPV在宮頸癌前病變基礎(chǔ)上與宮頸癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)，已明確其危險程度及其與年輕患者的對比，以便在臨床工作中深化對于老年患者的HPV篩查及宮頸癌防治。

綜上，宮頸分泌物檢測HPV基因型對于發(fā)現(xiàn)高危HPV基因型感染并聯(lián)合細(xì)胞學(xué)試驗篩查老年宮頸癌癌前病變有較好的診斷效能。