江婷婷，馬興華

(西安交通大學醫(yī)學院附屬三二〇一醫(yī)院麻醉科， 陜西 漢中 723000)

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

大鼠心肌細胞H9C2購自中田科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購于武漢普諾賽生命科技有限公司；咪唑安定(批號：20111005)購于徐州恩華藥業(yè)集團有限責任公司；細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)購于北京百奧萊博科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；miR-290-5p模擬物(miR-290-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-290-5p抑制物(anti-miR-290-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；兔源細胞周期素D1(cyclinD1)抗體、兔源活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase 3，C-caspase-3)抗體、兔源β-肌動蛋白(β-actin)、兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(p-PI3K)抗體和兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體購于美國CST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和模型構建

H9C2細胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液)培養(yǎng)，置于37℃缺氧培養(yǎng)箱(含1% O2、5% CO2、94% N2)內(nèi)培養(yǎng)48 h構建心肌細胞缺氧損傷模型[8]。

1.3.2 MID對缺氧誘導的心肌細胞存活、凋亡以及miR-290-5p表達的影響

(1)CCK-8法檢測細胞存活

將H9C2細胞(每孔5×103cells)接種到96孔板并分為正常(NC)組、缺氧(hypoxia)組、MID+hypoxia組(分別采用終濃度為8、16、32 μmol/L的MID處理心肌細胞后進行缺氧處理)。各組細胞進行相應處理后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值。確定用藥濃度為16 μmol/L。

(2)流式細胞術檢測細胞凋亡

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組H9C2細胞，PBS洗滌細胞2次，采用結合緩沖液調(diào)整為單細胞懸液。取100 μL細胞懸液(1×105cells/mL)加入流式管，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書檢測細胞凋亡情況。

(3)RT-qPCR檢測miR-290-5p的表達水平

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組H9C2細胞，PBS洗滌細胞2次，TRIzol法提取各組細胞的總RNA，隨后進行逆轉(zhuǎn)錄反應和RT-qPCR反應。miR-290-5p的表達以U6為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計算其表達水平。引物序列如下(5’-3’)：miR-290-5p上游引物：GCTGGGTTTCACGGGGGTATCAA，下游引物：TCAACTGAGTGCCGTAGGGTGCG；U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT，下游引物：ACGC TTCACGAATTTGCGTGTC。

(4)Western blot檢測Cleaved-caspase-3的表達水平

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組H9C2細胞，采用RIPA裂解液獲得各組細胞蛋白。將細胞蛋白與適量上樣緩沖液混合煮沸變性后，取適量樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。隨后利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%的脫脂牛奶封閉膜后，采用PBS液洗膜3次，將膜置于稀釋的一抗溶液中4℃孵育過夜，PBS液洗膜3次，將膜置于稀釋的二抗溶液中室溫孵育1 h，PBS液洗膜3次，進行化學發(fā)光顯色。以目標蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。

1.3.3 過表達miR-290-5p對心肌細胞存活和凋亡的影響

將H9C2細胞分為miR-NC+hypoxia組(轉(zhuǎn)染miR-NC 48 h后進行缺氧誘導)、miR-290-5p+hypoxia組(轉(zhuǎn)染miR-290-5p mimics 48 h后進行缺氧誘導)。按照上述步驟檢測各組細胞的存活、凋亡以及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達情況。

1.3.4 MID調(diào)控miR-290-5p表達對缺氧誘導心肌細胞損傷的影響

將H9C2細胞分為anti-miR-NC+MID+hypoxia組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 48 h后，進行MID干預和缺氧處理)、anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組(轉(zhuǎn)染anti-miR-290-5p 48 h后，進行MID干預和缺氧處理)，按照上述步驟檢測各組細胞的存活、凋亡以及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達情況。

1.3.5 MID調(diào)控miR-290-5p表達對缺氧誘導心肌細胞損傷PI3K/AKT信號通路的影響

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組、anti-miR-NC+MID+hypoxia組、anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組H9C2細胞，按照上述Western blot步驟檢測各組細胞PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白p-PI3K和p-AKT的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

表1 不同濃度MID對心肌細胞H9C2增殖的 影響Table 1 Effect of different concentrations of MID on the proliferation of cardiomyocyte H9C2

2 結果

2.1 不同濃度MID對心肌細胞H9C2增殖的影響

CCK-8實驗結果表明，見表1，與NC組比較，hypoxia組H9C2細胞存活率顯著降低；與hypoxia組比較，8 μmol/L MID+hypoxia組、16 μmol/L MID+hypoxia組、32 μmol/L MID+hypoxia組細胞存活率顯著升高(P<0.05)。隨著MID濃度增加，H9C2細胞存活率呈先升高再降低趨勢，選擇16 μmol/L的MID進行后續(xù)實驗。

2.2 MID對心肌細胞H9C2凋亡的影響

流式細胞術和Western blot實驗結果表明，見圖1和表2，與NC組比較，hypoxia組H9C2細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高；與hypoxia組比較，MID+hypoxia組細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

2.3 MID對miR-290-5p表達的影響

RT-qPCR實驗結果表明，見表3，與NC組比較，hypoxia組H9C2細胞miR-290-5p的表達顯著降低；與hypoxia組比較，MID+hypoxia組H9C2細胞中miR-290-5p的表達顯著升高(P<0.05)。

2.4 高表達miR-290-5p對心肌細胞H9C2增殖、凋亡的影響

結果見表4和圖2，與miR-NC+hypoxia組比較，miR-290-5p+hypoxia組H9C2細胞miR-290-5p和CyclinD1蛋白的表達水平、細胞存活率顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白的表達水平和細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

注：A：流式細胞儀檢測細胞凋亡；B：Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達。圖1 MID對心肌細胞H9C2凋亡的影響Note. A, Flow cytometry to detect apoptosis. B, Western blot detection of Cleaved-caspase-3 protein expression.Figure 1 Effect of MID on apoptosis of cardiomyocyte H9C2

表2 MID對心肌細胞H9C2凋亡的影響

表4 高表達miR-290-5p對心肌細胞H9C2增殖、凋亡的影響Table 4 Effect of high expression of miR-290-5p on proliferation and apoptosis of cardiomyocyte H9C2

2.5 低表達miR-290-5p可以部分逆轉(zhuǎn)MID對心肌細胞H9C2增殖和凋亡的影響

見圖3和表5，與anti-miR-NC+MID+hypoxia組比較，anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組H9C2細胞miR-290-5p和CyclinD1蛋白的表達水平、細胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白的表達水平和細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.6 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

見圖4和表6，與NC組比較，hypoxia組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT的表達水平顯著降低；與hypoxia組比較，MID+hypoxia組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT的表達水平顯著升高；與anti-miR-NC+MID+hypoxia組比較，anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組H9C2細胞p-PI3K和p-AKT的表達水平顯著降低(P<0.05)。

3 討論

缺氧是心肌梗死的主要危險之一。缺氧狀態(tài)下，心肌細胞線粒體功能異常，能量代謝紊亂，同時引起大量的生理和病理反應，引起心肌細胞損傷和凋亡[9]。因此，如何減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷和凋亡對防治心肌梗死具有重要意義。

表3 MID對miR-290-5p表達的影響Table 3 Effect of MID on miR-290-5p expression

圖2 Western blot檢測CyclinD1、 Cleaved-caspase-3蛋白的表達Figure 2 Western blot detects expression of CyclinD1, Cleaved-caspase-3 protein

圖3 低表達miR-290-5p可以部分逆轉(zhuǎn)MID對H9C2心肌細胞 CylinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達的影響Figure 3 Low expression of miR-290-5p can partially reverse the effect of MID on the expression of CylinD1 and Cleaved-caspase-3 in cardiomyocytes H9C2

表5 低表達miR-290-5p可以部分逆轉(zhuǎn)MID對心肌細胞H9C2增殖、凋亡的影響Table 5 Low expression of miR-290-5p can partially reverse the effect of MID on the proliferation and apoptosis of cardiomyocyte H9C2

圖4 Western blot檢測p-PI3K、p-AKT蛋白的表達Figure 4 Western blot detects p-PI3K, p-AKT protein expression

長期以來，MID被認為對心肌細胞損傷具有保護作用。劉保江等[10]研究發(fā)現(xiàn)MID預處理可改善心臟收縮和舒張功能，減輕再灌注心律失常發(fā)生頻率，提高心肌細胞抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化反應，減輕心肌細胞損傷程度。覃軍等[11]指出MID缺氧前預處理可明顯增高心肌組織及血漿中血管

表6 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達Table 6 Expression of PI3K/AKT signaling pathway related proteins

內(nèi)皮生長因子的表達量，對改善缺血心肌功能具有積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導后心肌細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率和促凋亡蛋白表達水平均顯著升高，說明缺氧誘導的心肌細胞損傷模型建立成功。進一步研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的MID預處理可改善缺氧誘導對心肌細胞的存活抑制作用，并減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡，與前人研究結論相吻合[5, 10-11]。以上研究說明，MID預處理通過抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡，提高心肌細胞存活率，對缺氧誘導的心肌細胞損傷發(fā)揮保護作用。

miR-290-5p是miR-290-295簇的成員之一，研究顯示miR-290-295在小鼠胚胎干細胞中具有潛在的促生存功能，其表達缺失可導致小鼠部分胚胎致死和生殖細胞缺陷[12]。此外，miR-290-295簇還可促進細胞G1期向S轉(zhuǎn)換，加速細胞增殖，在防止小鼠胚胎干細胞凋亡中發(fā)揮保護作用[13]。然而，miR-290-5p在缺氧誘導的心肌細胞損傷中的作用尚未可知。本研究顯示缺氧誘導后心肌細胞miR-290-5p的表達顯著降低，而咪唑安定預處理可提高缺氧誘導下心肌細胞miR-290-5p表達水平。進一步功能分析顯示，過表達miR-290-5p可提高缺氧誘導下心肌細胞存活率，降低缺氧誘導的心肌細胞凋亡，并升高促增殖蛋白CyclinD1、降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達水平，與MID預處理對缺氧誘導的心肌細胞損傷的保護作用相同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-290-5p表達還可部分逆轉(zhuǎn)MID對缺氧誘導的心肌細胞和存活抑制的影響。以上研究說明上調(diào)miR-290-5p是MID對缺氧誘導的心肌細胞損傷發(fā)揮保護作用的重要機制。

PI3K/AKT信號通路的激活在缺氧缺血損傷后心臟保護中起著關鍵作用[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c、miR-335等多種miRNA通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路改善心肌缺血復氧損傷[16-17]。本研究顯示MID預處理可減輕缺氧誘導對PI3K/AKT信號通路的抑制作用，而抑制miR-290-5p表達則部分逆轉(zhuǎn)MID對缺氧誘導的心肌細胞PI3K/AKT信號通路活化的影響。提示MID通過上調(diào)miR-290-5p激活I3K/AKT信號通路進而對缺氧誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。

綜上所述，本研究證實MID通過上調(diào)miR-290-5p可減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡，促進心肌細胞存活，對缺氧誘導的心肌細胞損傷具有保護作用，其機制與激活PI3K/AKT信號通路有關，這為MID在臨床預防缺氧誘導的心肌細胞損傷中應用奠定理論基礎。