鄒 亮，程 輝，張 婷，周 英，關(guān) 軍，程 平，王蘭蘭

(武漢市第一醫(yī)院血液內(nèi)科，武漢 430022)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，以骨髓內(nèi)惡性漿細(xì)胞的克隆增生為其主要特征[1]。目前，針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的治療手段雖多，且均能延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，但由于各種各樣的并發(fā)癥，導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量較差，因此，尋求新的治療方法迫在眉睫[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有腫瘤細(xì)胞均存在細(xì)胞周期異常；因此，腫瘤也被稱為細(xì)胞周期病。腫瘤細(xì)胞最明顯的特征為不依賴于細(xì)胞外生長(zhǎng)信號(hào)的刺激而能反復(fù)自發(fā)的進(jìn)行細(xì)胞周期循環(huán)，細(xì)胞增殖增加、凋亡細(xì)胞減少，最終誘發(fā)細(xì)胞不可控的異常增殖而導(dǎo)致腫瘤形成[4]。全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，DIS3基因具有較強(qiáng)的突變特性，DIS3基因突變是導(dǎo)致MM發(fā)生的原因之一[5]，但其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的周期變化及具體作用機(jī)制尚不明確。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)ERK1/2，是將信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子，磷酸化的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，介導(dǎo)ATF，Ap-1，c-fos和c-Jun等因子的活化，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)反應(yīng)[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過構(gòu)建DIS3過表達(dá)或干擾載體，觀察過表達(dá)或干擾DIS3對(duì)細(xì)胞周期及腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)影響，旨在為臨床治療MM提供潛在的策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929(貨號(hào)：CRL-9068)、RPMI 8226(貨號(hào)：CCL-155)和U266(貨號(hào)：TIB-196)購(gòu)自ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

人RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗及Lipofectamine 2000均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司；真核表達(dá)載體PEGFP-N1由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司分子實(shí)驗(yàn)室保存并提供；細(xì)胞RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；SYBR Green染料購(gòu)自Lumiprobe Corporation公司；CycletestTMPlus DNA Reagent Kit(細(xì)胞周期檢測(cè))購(gòu)自BD Biosciences；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗：Cyclin B1(貨號(hào)：ab2949)、P21(貨號(hào)：ab109199)、CDK2(貨號(hào)：ab32147)、MYC(貨號(hào)：ab32072)、RAS(貨號(hào)：ab52939)、TP53(貨號(hào)：ab131442)、BRAF(貨號(hào)：ab167415)、p-ERK1/2(貨號(hào)：ab201015)、GAPDH(貨號(hào)：ab9485)以及山羊抗兔二抗IgG(貨號(hào)：ab6734)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；倒置顯微鏡(Nikon，日本)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-RAD，美國(guó))；離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；流式細(xì)胞儀(Beckman，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人骨髓瘤細(xì)胞NCI-H929、RPMI 8226和U266分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，按照前期本課題組相應(yīng)轉(zhuǎn)染方案[8]進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)。

1.3.2 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期變化

3種細(xì)胞均分成5組：對(duì)照組、DIS3-siRNA陰性對(duì)照(NC)組、DIS3-過表達(dá)空載組、DIS3-過表達(dá)組、DIS3-siRNA組。按每孔104個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種，每孔加100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液后，置于5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后收集各組細(xì)胞，混勻后轉(zhuǎn)移至流式專用管中；離心棄上清沉淀后，用無(wú)水乙醇于-20℃冰箱內(nèi)固定細(xì)胞24 h，分別加入RNase A和碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，避光染核10 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)各指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平

根據(jù)NCBI上公布的各基因序列分別設(shè)計(jì)qRT-PCR用引物(表1)，并由上海生工代為合成。48 h后收集各組細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞樣本RNA，反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增后，以GAPDH為內(nèi)參基因，以2-△△CT計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.4 Western blot

48 h后收集各組細(xì)胞，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)所提蛋白進(jìn)行濃度檢測(cè)；上樣、電泳、封閉后，分別加入兔抗人一抗(Cyclin B1，1∶500、P21， 1∶1000、CDK2，1∶500、MYC，1∶500、RAS，1∶500、TP53，1∶800、BRAF，1∶1000、p-ERK1/2，1∶1000和GAPDH，1∶2000)，4℃過夜；加入相應(yīng)的二抗IgG(羊抗兔，1∶5000)，室溫孵育30 min后，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)細(xì)胞周期的影響

3種細(xì)胞的細(xì)胞周期變化檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1)，與空載體組比較，DIS3過表達(dá)組細(xì)胞發(fā)生了明顯G0/G1期阻滯現(xiàn)象，表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞占比顯著增加(P<0.01)；與NC組比較，DIS3-siRNA明顯促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)程，表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞占比的顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

2.2 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)指標(biāo)Cyclin B1、P21、CDK2表達(dá)的影響

3種細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin B1、P21、CDK2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2A)，與空載體組比較，DIS3過表達(dá)組Cyclin B1、CDK2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，P21表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與NC組比較，DIS3-siRNA明顯促進(jìn)了Cyclin B1、CDK2的表達(dá)而抑制了P21的表達(dá)(P<0.01)。而三指標(biāo)在蛋白水平上的表達(dá)與mRNA水平表達(dá)趨勢(shì)基本一致(圖2B)。

2.3 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)腫瘤相關(guān)指標(biāo)MYC、RAS、TP53及BRAF表達(dá)的影響

3種細(xì)胞的腫瘤相關(guān)基因MYC、RAS、TP53及BRAF表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3A)，與空載體組比較，DIS3過表達(dá)組MYC、RAS、TP53及BRAF表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與NC組比較，DIS3-siRNA明顯促進(jìn)了MYC、RAS、TP53及BRAF的表達(dá)(P<0.01)。MYC、RAS、TP53及BRAF在蛋白水平上的表達(dá)與mRNA水平表達(dá)趨勢(shì)基本一致(圖3B)。

2.4 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的影響

3種細(xì)胞的ERK1/2信號(hào)通路活化檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)，與空載體組比較，DIS3過表達(dá)能顯著抑制ERK1/2信號(hào)通路的激活，表現(xiàn)在p-ERK1/2的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與NC組相比，DIS3沉默則顯著增加了ERK1/2信號(hào)通路的活性，表現(xiàn)為p-ERK1/2的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

3 討論

注：與空載組比較，**P<0.01；與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化Note. Compared with the empty vector group,**P<0.01. Compared with the NC group,#P<0.05，##P<0.01.Figure 1 Cell cycle changes were detected by flow cytometry

注：A：各指標(biāo)mRNA水平的表達(dá)；B：各指標(biāo)蛋白水平的表達(dá)；與空載組比較，*P<0.05，**P<0.01；與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 細(xì)胞周期相關(guān)指標(biāo)Cyclin B1、P21、CDK2的表達(dá)變化Note. A, mRNA expression. B, Protein expression. Compared with the empty vector group,**P<0.01. Compared with the NC group,#P<0.05,##P<0.01.Figure 2 Changes in the expression of cell cycle-related indicators Cyclin B1, P21 and CDK2

注：A：各指標(biāo)mRNA水平的表達(dá)；B：各指標(biāo)蛋白水平的表達(dá)；與空載組比較，*P<0.05，**P<0.01；與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖3 腫瘤相關(guān)指標(biāo)MYC、RAS、TP53及BRAF的表達(dá)變化Note. A, mRNA expression. B, Protein expression. Compared with the empty vector group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the NC group,#P<0.05，##P<0.01.Figure 3 Changes in the expression of tumor-related indicators MYC, RAS, TP53 and BRAF

注：與空載組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05。圖4 p-ERK1/2的表達(dá)變化Note. Compared with the empty vector group,*P<0.05. Compared with the NC group,#P<0.05.Figure 4 Changes of p-ERK1/2 expression

生理?xiàng)l件下，細(xì)胞的增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，細(xì)胞周期的異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡的失衡，是誘發(fā)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。多發(fā)性骨髓瘤(MM)主要表現(xiàn)為惡性漿細(xì)胞無(wú)節(jié)制地增生、廣泛浸潤(rùn)和大量單克隆免疫球蛋白的出現(xiàn)及沉積導(dǎo)致正常多克隆漿細(xì)胞增生和多克隆免疫球蛋白分泌受到抑制，從而出現(xiàn)臨床上的異質(zhì)性癥狀及相應(yīng)并發(fā)癥[10]。DIS3是一種新型的MM抑制基因，其編碼蛋白DIS3能夠?qū)λ械腞NA進(jìn)行修飾[11-12]。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，DIS3突變的MM患者總體中位生存期大大縮短[12-13]。因此，研究DIS3的表達(dá)調(diào)控對(duì)MM細(xì)胞周期的影響具有重要的意義。在本實(shí)驗(yàn)中，DIS3過表達(dá)能顯著抑制3種人骨髓瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程，表現(xiàn)為顯著的G0/G1期細(xì)胞阻滯、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1、CDK2的表達(dá)減少及P21的表達(dá)升高。反之，通過siRNA技術(shù)抑制DIS3的表達(dá)則從一定程度上促進(jìn)了癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞占比減少、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1、CDK2的表達(dá)增加、P21表達(dá)減少，提示對(duì)DIS3進(jìn)行表達(dá)調(diào)控能顯著影響骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。在以果蠅為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DIS3的缺失會(huì)抑制細(xì)胞的有絲分裂，進(jìn)而導(dǎo)致幼蟲的生長(zhǎng)阻滯及某些組織器官的發(fā)育減緩，提示DIS3的外切酶功能對(duì)于細(xì)胞有絲分裂是不可或缺的，DIS3的異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的有絲分裂的延遲，表現(xiàn)出非整倍性和過濃縮的染色體[14]。DIS3是結(jié)腸癌的新型候選癌基因，沉默DIS3可影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[15]。因此，恢復(fù)DIS3的表達(dá)水平進(jìn)而維持其功能的穩(wěn)定性對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的惡性增殖可能具有抑制作用，在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)DIS3的抑制作用可能與改變骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)DIS3過表達(dá)抑制了3種骨髓瘤細(xì)胞中癌基因MYC、RAS、TP53及BRAF蛋白水平的表達(dá)，提示癌細(xì)胞潛在的惡性生物學(xué)特征得到了抑制。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)成員之一[16]。在細(xì)胞增殖、分裂、凋亡及惡性轉(zhuǎn)化等過程中均具有重要的作用，尤其在多種癌細(xì)胞中，ERK1/2常處于異常高表達(dá)或激活狀態(tài)，且被認(rèn)為是多種藥物的潛在作用靶點(diǎn)[17-19]。例如，在膽囊癌細(xì)胞中，青蒿素抑制細(xì)胞增殖、抑制CDK4和Cyclin D1表達(dá)以及誘導(dǎo)p16表達(dá)所造成的細(xì)胞G1期阻滯被認(rèn)為與ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制相關(guān)[20]。在乳腺癌的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦影響MCF-7細(xì)胞的周期，使得細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例增多，而S期細(xì)胞比例下降，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一作用被證明與p-ERK1/2蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[21]。而作為抗腫瘤的化療藥物，卡鉑主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其對(duì)卵巢癌HO-8910細(xì)胞作用研究表明，其通過抑制ERK1/2激活，誘導(dǎo)細(xì)胞S和G1期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[22]。而本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)，DIS3過表達(dá)同樣抑制了ERK1/2的激活，而DIS3沉默促進(jìn)了ERK1/2的活化。

綜上所述，過表達(dá)DIS3能通過抑制ERK1/2通路的活性進(jìn)而抑制骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，降低癌基因的表達(dá)水平。后期我們將在體內(nèi)水平進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期為臨床治療MM提供潛在的靶點(diǎn)。