杜秀鑾，戴欣，趙海峰，郭凌川，顧棟樺

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院，江蘇蘇州215153；2 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤之一，是女性主要的惡性腫瘤相關(guān)死亡原因之一[1]。早期宮頸癌往往不發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療效果較好。但宮頸癌早期發(fā)現(xiàn)率較低，大部分患者出現(xiàn)明顯癥狀就診時(shí)已進(jìn)入中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)[2]。目前，手術(shù)切除仍然是宮頸癌最主要的治療手段，但中晚期患者往往伴有局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[3]。分子靶向治療是近年新興的一種腫瘤治療手段，能夠高度選擇性地殺滅腫瘤細(xì)胞，安全性和耐受性均較好。但宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚，缺少相應(yīng)的分子治療靶點(diǎn)。因此，需要深入探索宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，從而尋找其分子治療靶點(diǎn)，以便更好地指導(dǎo)臨床治療。微小RNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度為18～22個(gè)核苷酸，在真核細(xì)胞中普遍存在。miRNA具有多種生物學(xué)功能，如沉默mRNA與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)結(jié)合進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)翻譯。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，可參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-769-5p是miRNA家族的重要成員，其基因定位于人染色體19q13.32，編碼蛋白具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的作用。有研究證實(shí)，miR-769-5p在多種惡性腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)現(xiàn)象，如非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌[4]。核仁紡綞體相關(guān)蛋白1(NUSAP1)基因定位于人染色體15q15.1，其編碼蛋白能夠參與細(xì)胞有絲分裂的紡錘體裝配[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中NUSAP1表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)NUSAP1能夠加速細(xì)胞周期G2/M期，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展。有研究認(rèn)為，miR-769-5p可通過負(fù)向調(diào)控NUSAP1表達(dá)參與腫瘤惡性進(jìn)展[6]。2016年8月—2019年8月，本研究檢測了miR-769-5p、NUSAP1 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)，并探討其表達(dá)與患者臨床病理特征以及二者之間的關(guān)系，旨在尋找宮頸癌潛在的分子治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以同期在南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院的，并經(jīng)組織病理檢查確診的106例宮頸癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②接受宮頸癌根治性切除術(shù)；③既往未接受手術(shù)、放化療或免疫治療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他宮頸良惡性疾病者；②合并其他全身感染性疾病者；③合并免疫功能缺陷性疾病者；④合并精神障礙性疾病者?；颊吣挲g33～74(50.4±2.2)歲，其中<50歲55例、≥50歲51例；腫瘤直徑：<2.5 cm 58例，≥2.5 cm 48例；病理類型：腺癌26例，鱗癌80例；組織分化程度：低中分化46例，高分化60例；FIGO分期：Ⅰ、Ⅱ期85例，Ⅲ、Ⅳ期21例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。取宮頸癌組織及其配對(duì)的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>2 cm并經(jīng)組織病理檢查證實(shí)為正常宮頸組織)各約50 mg，TRIzol法提取組織總RNA，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按PCR擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由北京睿博科技有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-769-5p上游引物5′-TTGAATGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3′、下游引物5′-TGGAGCTGGGTGAGACCTCTGGGTTCTG-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′、下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′；NUSAP1上游引物5′-ACCAGACGAGCACCAAGAAG-3′、下游引物5′-ATTGATGGGCTGCTGCTTCA-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′、下游引物5′-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3′。按PCR擴(kuò)增試劑盒說明配制反應(yīng)體系。miR-769-5p PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s共40個(gè)循環(huán)；NUSAP1 mRNA PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min，56 ℃ 1 min、72 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)。收集各樣本閾值循環(huán)數(shù)(CT)值。以GAPDH或U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達(dá)比較 宮頸癌組織miR-769-5p相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，NUSAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織(t分別為68.894、56.959，P均<0.01)。見表1。

表1 宮頸癌組織與癌旁正常組織miR-769-5p和NUSAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 宮頸癌組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 宮頸癌組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NUSAP1 mRNA表達(dá)與miR-769-5p表達(dá)在宮頸癌組織中的關(guān)系 相關(guān)分析顯示，宮頸癌組織miR-769-5p表達(dá)與NUSAP1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.529，P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，全球每年新增病例超過50萬例，死亡約30萬例[7]。迄今為止，宮頸癌發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。目前，手術(shù)切除仍是宮頸癌首選的治療手段，尤其是宮頸癌早期，手術(shù)治療效果較好，5年生存率較高[8]。但宮頸癌早期癥狀不典型，部分患者就診時(shí)已出現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，單純手術(shù)治療效果較差，需要聯(lián)合放化療或分子靶向治療等。因此，進(jìn)一步研究與宮頸癌發(fā)病相關(guān)的分子，才能更好地指導(dǎo)臨床防治。

miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度為18～22個(gè)核苷酸，可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤細(xì)胞中存在多種miRNA使特定的基因激活或失活，或通過分子支架結(jié)合細(xì)胞內(nèi)其他分子，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。miR-769-5p是miRNA家族成員之一，其基因定位于人染色體19q13.32。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-769-5p可作為一種抑癌基因，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控作用。有研究報(bào)道，miR-769-5p可通過靶向抑制轉(zhuǎn)化生長因子受體1表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。但miR-769-5p在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中miR-769-5p低表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期密切相關(guān)，提示miR-769-5p可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，miR-769-5p過表達(dá)不僅能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，從而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長的作用[13]。腫瘤組織miR-769-5p表達(dá)降低能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、增殖和遷移等，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。CHEN等[6]研究證實(shí)，miR-769-5p在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起抑癌基因作用；miR-769-5p可下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)，通過抑制癌基因c-Myc表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制腫瘤惡性進(jìn)展。

NUSAP1基因定位于人染色體15q15.1，其編碼蛋白屬于核仁紡錘體相關(guān)蛋白家族成員之一。NUSAP1是2003年首次發(fā)現(xiàn)的一種微管結(jié)合蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為5.5 kD，通常定位于核仁中[14]。在功能上，NUSAP1可促進(jìn)微管聚集、紡錘體和染色體連接，并維持血管束的穩(wěn)定性[15]。NUSAP1在增殖細(xì)胞中表達(dá)豐富，而在不可再生組織細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。有研究報(bào)道，NUSAP1表達(dá)上調(diào)能夠加速正常細(xì)胞增殖，并促進(jìn)增殖細(xì)胞的有絲分裂。近年研究發(fā)現(xiàn)，NUSAP1在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，如胰腺癌、黑素瘤、白血病等，且其過表達(dá)通常與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)有關(guān)[16]。但目前NUSAP1在宮頸癌中的作用機(jī)制研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中NUSAP1 mRNA高表達(dá)，提示NUSAP1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用。NUSAP1表達(dá)上調(diào)能夠激活宮頸癌細(xì)胞中BTG2/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)PI3K、p-AKT表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[16]。有研究報(bào)道，NUSAP1高表達(dá)可促進(jìn)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的激活因子FAM101B表達(dá)，F(xiàn)AM101B能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中miR-769-5p表達(dá)與NUSAP1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。目前，二者在宮頸癌中確切的相互作用機(jī)制尚不清楚。CHEN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-769-5p通過與NUSAP1的受體結(jié)合區(qū)域結(jié)合，從而抑制NUSAP1表達(dá)，繼而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖。此外，NUSAP1可能亦受miR-769-5p的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，當(dāng)miR-769-5p表達(dá)降低時(shí)，其對(duì)NUSAP1的抑制作用減弱，而NUSAP1表達(dá)升高則可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖。但在宮頸癌中miR-769-5p與NUSAP1具體的相互作用機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織miR-769-5p低表達(dá)，NUSAP1 mRNA高表達(dá)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，并與腫瘤組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但二者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中具體的作用機(jī)制還需要大樣本、多中心的隨機(jī)對(duì)照研究進(jìn)一步證實(shí)。