鄧仲元，皮聞森，譚小青，賀星，楊樹忠，鄭甦

1 深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東深圳518104；2 宜昌市中心人民醫(yī)院；3 深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院

骨肉瘤是兒童和青少年時(shí)期最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，預(yù)后較差。近年隨著新輔助化療廣泛開展，骨肉瘤患者5年生存率已由單純截肢術(shù)時(shí)的不足20%提高至60%～70%。盡管化療和手術(shù)技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但仍有超過30%骨肉瘤患者最終死于該病[1]。目前，骨肉瘤的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來，信號(hào)傳導(dǎo)通路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到諸多學(xué)者關(guān)注[2-4]。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在信號(hào)傳導(dǎo)通路中扮演重要角色。miRNA通過作用于靶基因3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控靶基因表達(dá)。miR-133a-3p是當(dāng)前研究較多的miRNA家族成員之一。有研究證實(shí)，miR-133a-3p能夠參與鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-8]。含纈酪肽蛋白(VCP)是一種泛表達(dá)蛋白，在多種細(xì)胞活動(dòng)中具有類似分子伴侶的作用。有研究報(bào)道，VCP基因在骨肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)，抑制VCP基因表達(dá)能夠降低骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。作者前期通過在線預(yù)測(cè)軟件和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p可能通過直接調(diào)控VCP基因，參與骨肉瘤的惡性進(jìn)展。2017年7月—2019年7月，本研究觀察了miR-133a-3p靶向調(diào)控VCP基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞株MG63、U2OS(以下分別稱MG63、U2OS細(xì)胞)及人成骨細(xì)胞系hFOB1.19(以下稱hFOB1.19細(xì)胞)，購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。miR-133a-3p mimics、miRNA negative control(以下稱miRNA NC)，購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。所有引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。VCP基因相關(guān)的雙熒光素酶質(zhì)粒(野生型WT、突變型MT)，購自美國(guó)Invitrogen公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自西安天隆科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀，購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Transwell小室，由美國(guó)Promega公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒及雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，購自北京艾然生物科技有限公司。

1.2 人骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞miR-133a-3p表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取MG63、U2OS細(xì)胞和hFOB1.19細(xì)胞各1×105個(gè)，接種于含15% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，按1∶3傳代。取傳2代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)鑒定，提取的總RNA濃度、純度和完整性合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：miR-133a-3p上游引物5′-GATTATCCGATGACTCGTAG-3′，下游引物5′-AGTTGACATGATTATGCG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按照PCR擴(kuò)增試劑盒說明配制反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)。收集各樣本閾值循環(huán)數(shù)(CT)值。以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。選取miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量最低的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 miR-133a-3p過表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞構(gòu)建與鑒定 按上述方法傳代培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞，將傳2代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的骨肉瘤細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×105個(gè)。隨機(jī)將骨肉瘤細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。然后將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合60%～70%時(shí)，觀察組與對(duì)照組采用Lipofectamine3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別轉(zhuǎn)染miR-133a-3p mimics、miRNA NC。轉(zhuǎn)染24 h，將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。收集細(xì)胞，按上述方法檢測(cè)miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。收集兩組上述轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成密度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按3×103個(gè)/孔接種于96孔板。然后將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育1.5 h。采用多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D450值代表細(xì)胞增殖能力。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。收集兩組上述轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以500 μL/孔接種于6孔板，孵育至單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底。用200 μL移液器槍頭沿培養(yǎng)皿底部做“一”字形劃痕，鏡下觀察并拍照記錄。棄原培養(yǎng)液，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液，分別于繼續(xù)培養(yǎng)24、36 h，鏡下觀察并拍照記錄。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。收集兩組上述轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將Transwell小室底部膜的上表面用基質(zhì)膠覆膜并孵育過夜。次日，在無血清培養(yǎng)基的Transwell小室上室中加入制備的細(xì)胞懸液200 μL，下室加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液600 μL。然后將Transwell小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，輕輕拭去上室面基質(zhì)膠和未穿膜細(xì)胞，經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，于倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選取10個(gè)低倍不重疊視野(100×)進(jìn)行計(jì)數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。

1.7 miR-133a-3p靶向調(diào)控VCP基因預(yù)測(cè) 借助生物信息學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫TargetScanhuman7.2(http：//www.targetscan.org/)，確定miR-133a-3p和VCP的結(jié)合位點(diǎn)。

1.8 miR-133a-3p靶向調(diào)控VCP基因驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。根據(jù)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)野生型和突變型，以骨肉瘤細(xì)胞的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增分別獲得野生型和突變型序列，連接到野生型VCP 3′UTR(psi-VCP-WT)和預(yù)測(cè)位點(diǎn)突變型VCP 3′UTR(psi-VCP-MT)。將骨肉瘤細(xì)胞接種于12孔板，隨機(jī)分為psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-WT+miRNA NC組、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-MT+miRNA NC組，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組轉(zhuǎn)染psi-VCP-WT和miR-133a-3p mimics，psi-VCP-WT+miRNA NC組轉(zhuǎn)染psi-VCP-WT和miRNA NC；psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組轉(zhuǎn)染psi-VCP-MT和miR-133a-3p mimics，psi-VCP-MT+miRNA NC組轉(zhuǎn)染psi-VCP-MT和miRNA NC。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液充分裂解，離心留取上清液。按照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.9 VCP蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集兩組上述轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，加入上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴使蛋白充分變性。取變性蛋白，SDS-PAGE分離蛋白。將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別加入VCP、GAPDH蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min。發(fā)光液發(fā)光，暗室中曝光、顯影。采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 人骨肉瘤細(xì)胞MG63、U2OS和成骨細(xì)胞hFOB1.19 miR-133a-3p表達(dá)比較 MG63、U2OS細(xì)胞和hFOB1.19細(xì)胞miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量分別為0.57±0.17、0.28±0.14、1.09±0.18。MG63、U2OS細(xì)胞miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量均低于hFOB1.19細(xì)胞，且U2OS細(xì)胞miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量低于MG63細(xì)胞(P均<0.05)。

2.2 兩組轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 觀察組與對(duì)照組miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量分別為4.281±0.204、1.224±0.801，觀察組miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 兩組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較

2.4 兩組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞遷移能力比較 見表2。

表2 兩組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間細(xì)胞遷移能力比較

2.5 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)為(79.2±10.4)個(gè)，對(duì)照組為(147.5±9.8)個(gè)，觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.6 miR-133a-3p靶向調(diào)控VCP基因預(yù)測(cè)結(jié)果 在TargetScanhuman7.2數(shù)據(jù)庫中搜索VCP潛在的目標(biāo)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p在VCP基因3′UTR 77～83 bp處有且僅有1個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)。見圖1。

圖1 miR-133a-3p與VCP的結(jié)合位點(diǎn)示意圖

2.7 各組熒光素酶活性比較 psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組熒光素酶活性為0.418±0.042，psi-VCP-WT+miRNA NC組為0.968±0.023，psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組為0.812±0.054，psi-VCP-MT+miRNA NC組為0.981±0.031。psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組熒光素酶活性低于其他三組(P均<0.05)，而其他三組熒光素酶活性兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.8 兩組VCP蛋白表達(dá)比較 觀察組與對(duì)照組VCP蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.324±0.023、3.231±0.031，觀察組VCP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。近年來，隨著手術(shù)技術(shù)和放化療水平不斷提高，骨肉瘤患者預(yù)后得到明顯改善，但其高復(fù)發(fā)率和高肺部轉(zhuǎn)移率仍是患者死亡的主要原因[9-12]。目前，骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。因此，進(jìn)一步研究骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)尋找骨肉瘤潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

信號(hào)傳導(dǎo)通路中某些分子的基因經(jīng)常發(fā)生突變，從而使活化的腫瘤干細(xì)胞異常增殖。近年來，信號(hào)傳導(dǎo)通路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到諸多學(xué)者關(guān)注[2-4]。自2002年CALIN等[13]首次報(bào)道m(xù)iRNA失調(diào)與惡性腫瘤有關(guān)以來，大量研究證實(shí)miRNA失調(diào)能夠參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。同樣，miRNA失調(diào)在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中亦扮演重要角色。miR-133a-3p是當(dāng)前研究較多的miRNA家族成員之一。有研究報(bào)道，上調(diào)miR-133a-3p表達(dá)能夠明顯抑制急性髓細(xì)胞性白血病、胰腺癌和腎癌細(xì)胞增殖活性[14-16]。為了證實(shí)miR-133a-3p與骨肉瘤的關(guān)系，本研究比較了MG63、U2OS細(xì)胞和hFOB1.19細(xì)胞miR-133a-3p的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示MG63、U2OS細(xì)胞miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量明顯低于hFOB1.19細(xì)胞，并且U2OS細(xì)胞miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量低于MG63細(xì)胞，故選擇U2OS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，表明該技術(shù)能夠明顯上調(diào)miR-133a-3p表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-133a-3p表達(dá)能夠明顯抑制U2OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。證實(shí)miR-133a-3p能夠參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

VCP是一種泛表達(dá)蛋白，在多種細(xì)胞活動(dòng)中具有類似分子伴侶的作用[17]，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解、核酸重建、細(xì)胞周期調(diào)控等過程中具有重要作用，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖、侵襲和遷移等作用[16]。研究表明，在惡性膠質(zhì)瘤、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、惡性淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病等疾病中VCP基因異常表達(dá)，其異常表達(dá)與疾病病情進(jìn)展和患者預(yù)后密切相關(guān)[18-20]。近年研究發(fā)現(xiàn)，VCP基因與骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移有關(guān)，通過RNAi沉默VCP基因能有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲[18]。但目前對(duì)VCP基因的上游調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫TargetScanhuman7.2確定miR-133a-3p與VCP的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p在VCP基因3′UTR 77～83 bp處有且僅有1個(gè)保守結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-133a-3p與VCP存在靶向關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，psi-VCP-WT+miR-133a-3p mimics組熒光素酶活性明顯低于psi-VCP-WT+miRNA NC組、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-MT+miRNA NC組。而psi-VCP-WT+miRNA NC組、psi-VCP-MT+miR-133a-3p mimics組、psi-VCP-MT+miRNA NC組熒光素酶活性兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miR-133a-3p是VCP的下游靶分子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，觀察組VCP蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，提示過表達(dá)miR-133a-3p能夠抑制VCP蛋白表達(dá)，即miR-133a-3p通過負(fù)向調(diào)控VCP基因，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-133a-3p可能通過負(fù)向調(diào)控VCP基因，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。這為探索骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了依據(jù)，也為骨肉瘤防治提供了新的作用靶點(diǎn)。