竇萱，劉靜，賈守寧，王雙璽

(青海省中醫(yī)院，青海 西寧)

0 引言

《中國藥典》2015 版收載的秦艽為龍膽科植物秦艽、粗莖秦艽、麻花秦艽、或小秦艽的干燥根[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2-7]，主要含有環(huán)烯醚萜苷類化合物，其中的主要成分就是以龍膽苦苷。從藥理作用的角度來講，龍膽苦苷在抗炎、升高血糖、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜降壓、抗組織胺、抗過敏性休克有顯著作用，是臨床上治療腦脊髓膜炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要手段。

管花秦艽Ex Kusnuz.(藏語名稱譯音為解吉那寶)。生長在海拔3500—4500 米的高山潮濕地帶、陰坡草地，青海省均有分布。本研究參考2015 版《中國藥典》一部秦艽中龍膽苦苷測定方法，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)文獻(xiàn)，所使用的方法主要為HPLC 法，考察了青海正品小秦艽與代用品管花秦艽中龍膽苦苷的含量，為新資源的開發(fā)提供資料。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LD-20AT 高效液相色譜儀，PDA 檢測器，日本島津公司開發(fā)的Labsolutions LC/GC Version 5.73 色譜數(shù)據(jù)工作站；昆山市超生儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器；METTLER TOLEDO MS105 電子天平；重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的AXLF1830-2 超純水機(jī)。

1.2 材料

龍膽苦苷對照品(批號110770-201515，含量99.1%)購自中國食品藥品檢定研究院。小秦艽和管花秦艽，采自2019年9 月下旬青海省共和縣。所有樣品經(jīng)青海省中醫(yī)院中醫(yī)藥研究所鑒定為小秦艽和管花秦艽。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Reprosil 100 C18(5μm，150×4,6mm)；流動相：乙腈-0.%醋酸溶液(9:91)；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1。

2.2 制備對照品溶液的方法

提取適量的龍膽苦苷對照品，將甲醇加入到溶液中，分別制成每1mL 含龍膽苦苷0.5mg 的溶液，即得。

2.3 制備供試品溶液的方法

取本品粉末，提取的粉末需要過三號篩，重量在約0. 5g左右，稱定過程中保證精確，置具塞錐形瓶中，在其中加入20mL 甲醇，對樣品進(jìn)行超聲處理，處理過程中頻率設(shè)定為頻率40kHz，功率設(shè)定為500W，處置時(shí)間為30 分鐘，二次稱定重量需要放冷，對于缺失的重量需要用甲醇補(bǔ)足，搖勻，濾過，將續(xù)濾液提取出來，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

龍膽苦苷與樣品中其他組分色譜峰基線分離無干擾。按龍膽苦苷峰計(jì)算理論板數(shù)需要控制在3000 以上。圖1 為具體研究結(jié)果。

2.4.2 線性關(guān)系的考察

進(jìn)行龍膽苦苷對照品溶液精密提取，數(shù)量分別為2.5、4、7.5、14、20.5μl，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，橫坐標(biāo)設(shè)置為進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)設(shè)置為峰面積，計(jì)算回歸方程，龍膽苦苷Y=1482.5X-5.9×105，r2=0.9999。說明在1.219～9.999μg 范圍內(nèi)龍膽苦苷與峰面積之間的線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

提取龍膽苦苷對照品10μl，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算龍膽苦苷對照品峰面積RSD 的相關(guān)指標(biāo)為0.23%(n=6)，說明儀器自身具有較高的精密度。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批小秦艽供試品溶液，分別于0,2，4,8，12,24h 進(jìn)樣10μl 測定，通過對測定結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷峰面積RSD 的測定指標(biāo)為0.20%(n=6)，這也在一定程度上說明了24h 供試品溶液能夠維持穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批小秦艽6 份，每份的重量控制在0.5g 左右，保證稱定結(jié)果的精密性，制備供試液，制備過程中主要按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，研究發(fā)現(xiàn)樣品中龍膽苦苷的平均含油量為2.365%，RSD 為1.64%，說明這種方法具有較好的重復(fù)性。

2.4.6 回收率試驗(yàn)

取同一批已知龍膽苦苷含量的小秦艽樣品6 份，每份0.05g，需要保證稱定結(jié)果的精密性，將稱取好的樣品放置于具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入對照品溶液( 龍膽苦苷0.4878mg·mL-1)5mL，需要制備供試品溶液6 份，制備過程中所使用的方法主要為供試品溶液制備方法。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果樣品中龍膽苦苷平均回收率為100.57%，RSD 為2.7%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=6

2.5 樣品測定

分別取小秦艽、管花秦艽0.5g，對供試品溶液進(jìn)行制備，所采用的方法主要為“2.3” 項(xiàng)下方法。分別稱取二者10μl 對照品溶液和10μl 供試品溶液，將高效液相色譜儀注入其中，按測定過程中需要依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，計(jì)算樣品中龍膽苦苷的含量。結(jié)果見表2、3。

表2 小秦艽中含有的龍膽苦苷濃度測定結(jié)果n=2

表3 管花秦艽中含有的龍膽苦苷濃度測定結(jié)果n=2

圖1 高效液相色譜圖

3 討論

3.1 本次研究工作的展開過程中，所采用的主要為HPLC法來對正品小秦艽與代用品管花秦艽中的龍膽苦苷的含量進(jìn)行測定，以Reprosil 100 C18(150×4,6mm，5μm) 反向色譜柱，乙腈-0.%醋酸溶液(9:91)為流動相；檢測波長為254nm；柱溫為35℃；流速為1.0mL·min-1。所分離峰形良好。

3.2 從龍膽苦苷的含量的角度來進(jìn)行分析，小秦艽和管花秦艽均能夠滿足中國藥典中的相關(guān)規(guī)定，通過對其平均含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：管花秦艽(6.22%)＞小秦艽(2.37%)，說明代用品管花秦艽具有較高的使用價(jià)值。

3.3 通過對相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，管花秦艽的HPLC圖譜與小秦艽的HPLC 圖譜在很多方面具有一致性，由此能夠初步得出結(jié)論，管花秦艽能夠被當(dāng)作是中藥秦艽的替代性藥品。曹曉燕等，王茹之[7]曾研究了管花秦艽藥物不同部分含有龍膽苦苷量進(jìn)行，研究發(fā)現(xiàn)管花秦艽藥物的根莖部分以及葉子、花的部分龍膽苦苷含量均高于2%。管花秦艽雖未被藥典收錄，但由于在高海拔地區(qū)，有巨大的貯量，加之采挖較少，所以有良好的開發(fā)價(jià)值。