方學蘭，李粵豐，國朝勝，陳松，譚廷鴻

（銅仁學院，貴州銅仁 554300）

牛耳草，是苦苣苔科旋蒴苣苔屬多生年草本植物，具有極強的抗旱和復蘇特性，蘊藏豐富的耐旱基因資源，近年來已成為干旱逆境研究的模式植物[1-3]。其獨特的脫水保護機制和復蘇機能，通過基因工程手段可將特定功能基因用于改良和提高作物的抗旱特性[4-6]。由于自然生境中牛耳草結(jié)實率低，種子小、萌發(fā)能力差，其主要依靠無性生殖進行繁衍，因此室內(nèi)繁殖困難，使得科研工作者在試驗室難以獲得持續(xù)穩(wěn)定的試驗材料。利用植物細胞的全能性和牛耳草的無性繁殖習性，通過組織培養(yǎng)和分株繁殖探究建立牛耳草的離體快繁技術(shù)，能解決牛耳草野外采集困難和室內(nèi)繁殖不易存活的難題[7,8]。

1 植物材料

試驗材料牛耳草采集于江西省宜黃縣二都鎮(zhèn)。選取根系完整的植株移植于通風、濕潤的環(huán)境中，待其長出3～4 片新生葉，沿基部剪下無病蟲害的成熟功能葉，作為組織培養(yǎng)和分株繁殖的外植體。

2 方法

2.1 組織培養(yǎng)

2.1.1 培養(yǎng)基成分。愈傷組織誘導、出芽和生根的培養(yǎng)基，以1/2 MS（Murashige & Skoog,Sigma）培養(yǎng)基為基底，添加3%蔗糖、0.75%瓊脂粉，pH 值調(diào)為5.8，并分別添加不同濃度的6-BA 和NAA，設(shè)置激素濃度梯度及組合培養(yǎng)基進行試驗。

2.1.2 外植體消毒及接種。先用自來水沖洗掉外植體表面的塵土及雜物，然后置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用75%的酒精棉涂拭外植體表面。隨后將外植體帶入超凈工作臺中，并放入0.1%的升汞溶液中浸泡3min，再用無菌水沖洗3～4 次，最后將外植體放在無菌濾紙上，吸干水分。用無菌手術(shù)刀將外植體切成1cm×1cm 的接種塊，接種時將接種塊背面接觸培養(yǎng)基。

2.1.3 培養(yǎng)條件。于植物光照培養(yǎng)室中，設(shè)置培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強度為35 μmoL/m2·s 的條件下進行連續(xù)光照培養(yǎng)。

2.1.4 煉苗與移植。待無菌苗長出2～3 片葉片且根系完整后，打開培養(yǎng)瓶蓋子，適應外界環(huán)境的溫度、空氣及光照3～4d；然后將組培苗從培養(yǎng)瓶中完整取出，用流水沖洗掉根部的培養(yǎng)基，移栽到混合基質(zhì)（珍珠巖：蛭石：泥炭土=1∶1∶3）中，等長出新生葉片后，再移植到土壤中。

2.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。利用SPSS 20.0 中的Duncan 和LSD 方法對所得的數(shù)據(jù)進行方差分析及多重比較。利用以下公式進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計：污染率=（污染苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%；無菌苗獲得率=（獲得無菌苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%；出芽率=（出芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；增殖系數(shù)=形成的有效芽數(shù)/接種苗數(shù)；生根率=（生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；移栽成活率=（移栽成活株數(shù)/移栽株數(shù)）×100%。

2.2 分株繁殖

2.2.1 葉片誘導新生植株的分株繁殖。取植株長勢良好的牛耳草新生功能葉片，剪成1cm×1cm 方塊后，均勻平放在土壤表面，保持葉片背面接觸土壤，于植物培養(yǎng)室進行培養(yǎng)?？刂剖覝貫?5±1℃，土壤濕度不低于85%，光照強度35μmol/m2·s，光暗周期16h/8h。培養(yǎng)6～8 周，帶有完整根系和葉片的新生植株即可長出，隨后進行移植擴繁。

2.2.2 匍匐莖的分株繁殖。在外界環(huán)境中，用松散濕潤的土壤掩蓋牛耳草的匍匐莖，保留莖的頂芽露出土面，待頂芽幼葉展開后，切斷老葉與匍匐莖的連接點，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)周，待頂芽長出新根，即獲得完整的新生植株，隨后進行移植擴繁。

3 結(jié)果與分析

3.1 牛耳草組織培養(yǎng)的適宜條件

通過不同濃度的6-BA 與NAA 進行組合探究，數(shù)據(jù)分析表明，以牛耳草成熟功能葉為外植體，其愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 g/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；出芽誘導最適培養(yǎng)基為1/2 MS+3.0 g/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；生根誘導最適培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA。

圖1 牛耳草組織培養(yǎng)過程

3.2 不同栽培基質(zhì)對牛耳草組培苗移栽成活率的影響

牛耳草煉苗后移入珍珠巖∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶3 的基質(zhì)中，并進行遮蔭保濕培養(yǎng)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，無菌苗移植成活率可達83.56%±2.76%，且植株生長良好。

3.3 分株繁殖效果

圖2 牛耳草葉片誘導新生植株的分株繁殖

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析表明，牛耳草成熟功能葉誘導新生植株進行分株繁殖效果較好，成活率較高，可達80.36%±3.56%，而且誘導周期短，6～8 周即可實現(xiàn)規(guī)?；瘮U繁（圖2）。匍匐莖的分株繁殖成功率較高，周期最短，只需3～4 周，但受限于匍匐莖的數(shù)量，故難以實現(xiàn)批量化擴繁。

4 結(jié)論

通過試驗探究，確定了牛耳草組織培養(yǎng)的適宜條件，其愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 g/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；出芽誘導最適培養(yǎng)基為1/2 MS+3.0 g/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；生根誘導最適培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA。同時通過葉片和匍匐莖誘導新生植株探索了牛耳草全新的分株繁殖技術(shù)，與組織培養(yǎng)技術(shù)相比，分株繁殖能顯著縮短快繁周期。