王 平，曹保利，李棣華，楊 磊，劉 帥，曹 穎，劉俊紅，呂沅珊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300100；2.天津南開醫(yī)院婦產(chǎn)科）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是生育期婦女常見疾病，是一種良性的婦科疾病，以具有活性的子宮內(nèi)膜異位在子宮以外的其它地方為特征，是一種炎癥性、雌激素依賴性疾病，常引起痛經(jīng)、盆腔炎癥和不孕等并發(fā)癥。臨床上約有10%～15%的生育期婦女患有此疾病，而不孕的婦女中有20%-40%的女性患有EMs，是一種需要終身治療的慢性疾病[1～3]。雖然EMs是一種良性的婦科疾病，但以惡性腫瘤的方式存在，對女性的健康產(chǎn)生重大的威脅[4]。目前，臨床上治療EMs的藥物并不是很理想，對EMs的治療還處在探索階段。淫羊藿苷（icariin，ICA）是中草藥淫羊藿的提取物，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[5]，相關(guān)研究表明，淫羊藿有雌激素樣作用，可以提高去卵巢大鼠的骨密度與骨重量[6]。本文目的是探討淫羊藿苷對EMs大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8和NF-kB和p-NF-kBp65水平的影響，為EMs的治療提供新的理論依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 淫羊藿苷，規(guī)格：20mg，中國生物制品檢定所，批號110737-201415；硫酸慶大霉素注射液，華中藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H42021503；10%水合氯醛（0.3mL/100g體重），天津市南開醫(yī)院分子生物研究實驗室提供；10%福爾馬林溶液，天津市南開醫(yī)院病理實驗室；無菌PBS緩沖液，購自中奧天元生物有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、大鼠白細(xì)胞介素-8（IL-8）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶鏈免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒，均購自上?？道噬锟萍加邢薰?；小鼠抗人磷酸化核因子kB（Ser536）單克隆抗體，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 全自動脫水機(jī)（ASP300S，德國Leica公司）、病理石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）、切片機(jī)（德國Leica公司）、攤片機(jī)（德國Leica公司）、烤片機(jī)（德國Leica公司）、電熱恒溫水浴箱（型號DKB-600D，上海橫一科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號DHG-101 3型，上海昕儀儀器儀表有限公司）、研究型正置熒光顯微鏡（型號DM4000B，德國Leica公司，攝像頭為DFC500，圖像采集軟件為LAS V3.7）。多功能酶標(biāo)儀（型號varioskanflash3001，thermo fisher scientific公司）

1.1.3 實驗動物 清潔級健康未交配過的SD雌性大鼠30只（中國食品藥品檢定研究所，國家實驗動物質(zhì)量檢測中心，SCXK（京）2014-0013），體重180～220g，常規(guī)飼養(yǎng)，室溫，自然光照。分籠飼養(yǎng)，每籠6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。本實驗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心動物倫理委員會審批許可，審批號為TCM-LAEC2018026。

1.2 方法

1.2.1 大鼠EMs模型的建立及成模情況參考非動情期大鼠EMs模型的建立方法[7，8]，30只雌性SD大鼠，經(jīng)腹腔注射10%的水合氯醛（0.3mL/100g）進(jìn)行麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠移至鼠板，固定其頭與四肢，暴露腹部，備皮，手術(shù)用阿爾碘消毒，鋪無菌孔巾，開腹，找到“Y”字形子宮，將大鼠右側(cè)子宮分離暴露，近卵巢約1cm處與右側(cè)子宮宮頸處兩端結(jié)扎，將子宮剪斷，長約2cm，迅速將剪下的組織放置于盛有0.9%生理鹽水的無菌培養(yǎng)皿中；在無菌培養(yǎng)皿中將多余的脂肪和結(jié)締組織剔除，沿系膜部位將組織縱行剪開，將組織剪成大小約4mm*4mm的內(nèi)膜組織片段2段；將子宮內(nèi)表面上皮與腹壁相貼合，左右兩側(cè)腹壁血管豐富處各縫一塊，用7-0帶針無損傷線將剪下來組織的四個角縫合在腹壁血管豐厚處上；用生理鹽水將腹腔沖洗干凈，然后在大鼠腹腔內(nèi)滴入用生理鹽水稀釋過的鹽酸慶大霉素注射液2～3mL預(yù)防感染，用4-0絲線關(guān)腹縫合，用苦味酸涂抹傷口，以防大鼠撕咬傷口；術(shù)后2只大鼠因腹腔感染死亡，其余28只均成模。

1.2.2 分組及給藥方法 隨機(jī)將大鼠分為4組：空白對照組，模型組，ICA高劑量組，ICA低劑量組，每組7只。空白對照組、模型組：15mL·kg-1d-1，ICA高劑量組：100mg·kg-1d-1，ICA低劑量組：50mg·kg-1d-1，連續(xù)給藥28天。

1.2.3 EMs標(biāo)本采集及處理連續(xù)灌胃給藥28天后，在末次給藥24h內(nèi)，用10%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)目內(nèi)眥靜脈采血1mL，開腹，剪取腹壁移植物，及空白組剪取子宮，每個組織在無菌PBS中沖洗樣本3次，盡量去除血液。用吸水紙將組織上液體盡量吸干。將該組織，分別切割3份，其中一份組織放入多聚甲醛/福爾馬林中離心管中，封口膜封口，待HE檢測，另外兩份放置-80℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存待其他檢測。

1.2.4 EMs組織HE染色 將固定在福爾馬林中的組織進(jìn)行脫水，經(jīng)石蠟包埋好，準(zhǔn)備切片，將切片好的組織進(jìn)行常規(guī)操作染色，最后用中性樹膠封片于光鏡下觀察組織變化。

1.2.5 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量 將采取的靜脈血置于離心機(jī)，1000r，20min，離心，分離血清，-20℃保存，待檢用。采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒所標(biāo)示的步驟進(jìn)行。酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，在加終止液15min內(nèi)進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量進(jìn)行計算，得出數(shù)值。

1.2.6 以免疫印跡法檢測異位內(nèi)膜組織中的NFkB和磷酸化NF-kB水平 將存于液氮罐中的內(nèi)膜異位組織取出，將組織樣品稱取適量，放置于液氮預(yù)冷的研缽中，在研缽中加液氮將樣品充分研磨至粉末。加入粉末4倍體積裂解緩沖液（8 M尿素，1%蛋白酶抑制劑和2 mM EDTA），超聲裂解。4℃，12000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，將上清液置入新的離心管中，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸變性5～10min，制備SDSPAGE凝膠，電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，依次孵育一抗、二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。Image-ProPlus6.0軟件對其進(jìn)行分析處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，x±s表示計量資料，多個樣本之間采用方差分析（P<0.05，P<0.01），表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)異癥組織病理學(xué)觀察

空白組光鏡下可見黏膜上皮完整，細(xì)胞呈柱狀，細(xì)胞分布均勻，腺體數(shù)量多且完整。模型組光鏡下可見宮內(nèi)膜腺體，子宮內(nèi)膜間質(zhì)及含鐵血黃素；移植物腺體增生，腺上皮呈高柱狀排列。淫羊藿苷高劑量組與淫羊藿苷低劑量組在光鏡下均可見移植組織內(nèi)膜粘膜上皮變薄，呈萎縮性改變，呈縫隙狀改變，移植組織內(nèi)膜腺體可見明顯減少，腺腔較模型組明顯變窄，腺上皮萎縮明顯，呈扁平狀或矮立方狀，間質(zhì)中有少量白細(xì)胞浸潤，部分異位組織腺上皮明顯被破壞甚至消失（見圖1～4）。

2.2 ICA對大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量的影響

以模型組作為參照，空白組與之相比較，TNFα、IL-6、IL-8含量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。ICA低劑量組與高劑量組與之相比較，TNF-α、IL-6、IL-8含量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）（見表1）。

2.3 ICA對大鼠EMs組織中NF-kB和磷酸化NF-kB蛋白水平的影響

模型組作為參照，空白組與之相比較，磷酸化NF-kB表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。ICA低劑量組與ICA高劑量組與之相比較，磷酸化NF-kB表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）（見表2，圖5）。

表1 ICA對大鼠血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6’ng×L-1）白細(xì)胞介素-8（IL-8’ng×L-1）和腫瘤壞死因子（TNF-a’ng×L-1）水平的影響（x±s，n）

表2 ICA對大鼠EMs模型異位內(nèi)膜組織中核因子kB（NF-kB）蛋白和磷酸化核因子kB（p-NF-kB）表達(dá)水平的影響

3 討論

EMs是婦科常見的疾病，是一種炎癥性、雌激素依賴性疾病，也是臨床上引發(fā)不孕的危險因素之一[9，10]。TNF-α、IL-6、IL-8都是重要的炎癥因子，對EMs的診斷具有一定的臨床意義[11]。相關(guān)研究表明IL-6可以作為炎癥早期的因子，促進(jìn)其他炎癥因子的分泌，使炎癥反應(yīng)放大[12]。IL-8是通過巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌，可使中性粒細(xì)胞趨化，促使新的血管形成，在炎癥的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[13]。TNF-α在機(jī)體處于正常水平下其水平表現(xiàn)較低，當(dāng)機(jī)體處于炎癥反應(yīng)時其水平明顯升高，這是由于單核巨噬細(xì)胞分泌的具有防御和治病雙重作用的細(xì)胞因子所導(dǎo)致[14]。NF-kB在調(diào)解細(xì)胞反應(yīng)中有著重要的作用，在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起著關(guān)鍵的作用。NF-kB可以通過調(diào)節(jié)與炎癥細(xì)胞浸入有關(guān)的因子基因表達(dá)，在炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]。ICA是淫羊藿的提取物，淫羊藿中被分離鑒定的單體化合物有260余種，但其中以ICA的含量最高。王坤雅通過研究證實，淫羊藿苷可以下調(diào)EMs細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9蛋白，從而抑制EMs細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)ICA通過抑制NF-kB p65蛋白的磷酸化和阻斷IkB-a蛋白降解，提高GR-mRNA和蛋白的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)GR受體，抑制NF-kB活化及下游炎性因子產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。ICA通過抑制由NF-κB和PPARα和PPARγ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對大鼠缺血性中風(fēng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，ICA可以顯著降低大鼠EMs組織中的TNF-α、IL-6、IL-8的含量。并且，ICA高劑量組和ICA低劑量組都可以對異位內(nèi)膜起到抑制作用。高劑量組強(qiáng)于低劑量組。說明ICA通過抑制EMs異位組織促炎癥因子的釋放，改善EMs。其改善可能由于ICA通過對NF-kB信號通路的抑制而發(fā)揮的作用。從實驗結(jié)果可知ICA可以顯著降低EMs大鼠異位組織中的NF-kB蛋白的磷酸化水平。從某種程度上也說明ICA可以抑制內(nèi)膜異位組織中的NF-kB蛋白的激活，抑制下游炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，抑制促炎因子的釋放，起到緩解EMs的作用。