陳燕，穆雪梅，蔡慧敏，邵華，鄭嘯

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

苦地丁CorydalisbungeanaTurcz又稱為紫堇，是罌粟科多年生草本植物，臨床上多以其干燥全草入藥[1]?？嗟囟【哂卸喾N功效，如清熱解毒、散結(jié)消腫等?，F(xiàn)代研究表明，其具有較好的抗菌、抗炎、抗腫瘤等生物學(xué)活性，常用于感冒、肺炎、化膿性感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[2]。苦地丁中主要含有黃酮及生物堿成分，其中生物堿成分與功效密切相關(guān)。如紫堇靈、乙酰紫堇靈、原阿片堿、氧化血根堿等[2-3]。

紫堇靈具有較好的抗炎作用，可抑制乙酰膽堿酯酶活性，并有一定的抗真菌等活性[3]。而乙酰紫堇靈可作為免疫抑制劑使用，同時(shí)還能降低帕金森模型小鼠腦中多巴胺能神經(jīng)元的損傷。近年來苦地丁在細(xì)菌性肺炎、哮喘等肺部疾病中的運(yùn)用越來越廣泛，如紫堇靈可通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，改善脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷[4]。

目前已有文獻(xiàn)對苦地丁中多種生物堿在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究[5-6]，但尚未有文獻(xiàn)對苦地丁中生物堿在疾病狀態(tài)下的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。本文擬首先建立一種快速、靈敏的LC-MS/MS分析方法用于同時(shí)測定大鼠血漿中紫堇靈和乙酰紫堇靈，在建立LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠體內(nèi)對其進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，以期為苦地丁相關(guān)藥物的深入開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

紫堇靈(批號：20180503)，乙酰紫堇靈(批號：20171201)對照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司(純度>98%)；氟西汀對照品購自中國食品藥品檢定研究院。苦地丁藥材飲片購自北京同仁堂藥業(yè),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金副教授鑒定為正品；乙腈(色譜純)購自德國Merck公司；無水乙醇購自上海阿拉丁生物科技有限公司；超純水由Milli-Q超純水機(jī)制備。

1.2 儀器

SHIMADZU LC30高效液相色譜儀；AB SCIEX QTRAP 4500型質(zhì)譜儀(加拿大AB SCIEX公司)，百萬分之一天平(METTLER TOLEDO公司)；微量臺(tái)式離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；SpeedVac離心濃縮儀(美國Thermo Scientific公司)；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)。

1.3 動(dòng)物及急性肺損傷大鼠模型的建立

SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，雄性，合計(jì)24只，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2012-0004。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組及急性肺損傷模型組，每組12只。

SD大鼠采用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉后，鼻腔滴入LPS 1 mg(溶于100 μL的無菌生理鹽水中)，LPS的劑量相當(dāng)于5 mg/kg。滴鼻后，大鼠保持直立姿勢約5 min，以保證LPS溶液順利吸入肺部。造模12 h后，其中每組6只大鼠，解剖，取肺組織，其中部分肺組織用于病理學(xué)檢查，另一部分肺組織用于肺中含水量的測定。每組動(dòng)物中，另外6只大鼠用于藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

1.4 方法

1.4.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱采用Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)；采用梯度洗脫方式，由乙腈(A)和含2 mmol/L甲酸銨及0.1%的甲酸水溶液(B)組成，流速為0.25 mL/min，洗脫程序?yàn)?～1 min，10%A；1～2.5 min，10%～80%A；2.5～5.5 min，80%A；5.5～6 min，80%～10%A；6～7 min，10%A。柱溫設(shè)置為40 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化(ESI)進(jìn)行離子化，在正離子模式下進(jìn)行檢測檢測；氣簾氣為40 psi(1 psi=0.006 894 757 mPa)；霧化氣為55 psi；輔助氣為45 psi；碰撞氣設(shè)置為中等；噴霧電壓為4 500 V；霧化溫度：500 ℃。紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測參數(shù)如表1所示。

1.4.2 苦地丁醇提物的制備 取苦地丁飲片100 g，加入10倍量的70%乙醇浸泡1 h后，回流提取2次，每次1 h，合并濾液后經(jīng)減壓濃縮至無醇味，經(jīng)冷凍干燥得固體8.56 g。采用2020版《中國藥典》的方法，對其中提取物中紫堇靈和乙酰紫堇靈含量進(jìn)行測定，苦地丁提取物中紫堇靈和乙酰紫堇靈含量分別為3.42%和0.96%。

表1 紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)氟西汀的MRM檢測參數(shù)

1.4.3 溶液的配置 紫堇靈和乙酰紫堇靈對照品溶液的配制：分別精密稱取紫堇靈和乙酰紫堇靈對照品適量于10 mL的容量瓶中，加一定量的乙腈超聲溶解后，定容，進(jìn)一步稀釋成紫堇靈和乙酰紫堇靈濃度分別為100.0 μg/mL和80.0 μg/mL的溶液，避光，4 ℃保存。臨用前，經(jīng)乙腈稀釋到所需要濃度。

氟西汀(內(nèi)標(biāo))溶液的制備：氟西汀對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解，配制成含氟西汀濃度為0.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，臨用前用乙腈稀釋至200 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液，即得。

系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密量取紫堇靈和乙酰紫堇靈儲(chǔ)備液適量，采用乙腈稀釋，制備成含紫堇靈和乙酰紫堇靈濃度范圍分別為2.5～1 000 ng/mL和4～1 600 ng/mL的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品的制備：精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL，采用氮?dú)獯蹈扇軇?，加?0 μL的空白大鼠血漿，配制成含紫堇靈質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，乙酰紫堇靈質(zhì)量濃度0.40、0.80、1.6、3.2、8.0、16.0、32.0、80.0、160.0 ng/mL的系列血漿樣品。質(zhì)控樣品的制備同血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，其中質(zhì)控樣品中紫堇靈的質(zhì)量濃度分別為0.375、5.0、80.0 ng/mL，乙酰紫堇靈的質(zhì)量濃度分別為0.60、8.0、128.0 ng/mL。

1.4.4 血漿樣品處理方法 取50 μL血漿樣品，加入150 μL的內(nèi)標(biāo)溶液(氟西汀，200 g/mL)，渦旋振蕩5 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清150 μL，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，真空濃縮，溶劑揮干，加入50 μL流動(dòng)相(A∶B=50∶50)，渦旋振蕩5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣。

1.4.5 方法學(xué)考察 方法學(xué)考察主要包括線性范圍、定量下限、準(zhǔn)確度和精密度、穩(wěn)定性和基質(zhì)效應(yīng)。其中定量下限要求其信噪比大于10，同時(shí)其準(zhǔn)確度在80%～120%之間，精密度在20%以內(nèi)。穩(wěn)定性主要考察反復(fù)凍融3次，室溫8 h，凍存1個(gè)月的穩(wěn)定性。上述樣品均參照質(zhì)控樣品的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究 6只正常組大鼠和6只急性肺損傷大鼠，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，灌胃給予苦地丁提取物(428 mg/kg，以苦地丁飲片計(jì)其劑量為5 g/kg)，其中紫堇靈的給藥劑量為14.6 mg/kg，乙酰紫堇靈的給藥劑量為4.1 mg/kg，苦地丁提取物采用0.5%羥甲基纖維素鈉溶液配制，于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h經(jīng)眼底靜脈叢取血，每次取血量約120 μL，至肝素化的離心管中，2 500 r/min離心10 min，吸取60 μL血漿于離心管中，保存于-20 ℃冰箱中。樣品處理按“1.4”項(xiàng)下方法處理樣品，并采用上述建立的LC-MS/MS分析方法測定大鼠血漿中紫堇靈和乙酰紫堇靈的濃度。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用DAS 3.2.6軟件，采用非房室模型方法計(jì)算相關(guān)參數(shù)。采用單因素方差分析對藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中P<0.05可認(rèn)為其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別將空白血漿，空白血漿加入紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)的樣品，以及正常組大鼠灌胃苦地丁提取物4 h后的血漿樣品，參照方法項(xiàng)中“1.4”項(xiàng)下方法對上述血漿樣品進(jìn)行處理，采用我們建立好的LC-MS/MS分析方法對上述樣品進(jìn)行檢測。所得各成分的提取離子流色譜圖如圖1所示，從圖中可知，紫堇靈、乙酰紫堇靈及內(nèi)標(biāo)(氟西汀)的保留時(shí)間分別為4.20、4.86、3.01 min，同時(shí)在待測物及內(nèi)標(biāo)出峰位置，未見血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)干擾，提示血漿中的雜質(zhì)不影響紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)的專屬、特異性檢測。

2.1.2 線性及定量限 采用AB SICEX Analyst軟件對樣品中紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)的峰面積進(jìn)行積分，將紫堇靈與乙酰紫堇靈的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值記為Y，待測物的濃度記為X，對其進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X。紫堇靈線性范圍為0.25～100.0 ng/mL，所得回歸方程為Y=0.042 1X-0.011 4，R2=0.999；乙酰紫堇靈的線性范圍為0.40～160.0 ng/mL，回歸方程：Y=0.033 2X+0.009，R2=0.995。紫堇靈和乙酰紫堇靈在血漿濃度分別為0.25 ng/mL和0.4 ng/mL時(shí)，其信噪比均大于10，同時(shí)他們的準(zhǔn)確度分別為82.42%和84.18%，精密度RSD分別為14.16%和9.58%，上述結(jié)果表明紫堇靈和乙酰紫堇靈的定量下限分別為0.25 ng/mL和0.4 ng/mL。

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 通過分析已知濃度樣品中紫堇靈和乙酰紫堇靈的濃度，通過計(jì)算其回收率和相對平均偏差用于評價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。紫堇靈低、中、高濃度的批內(nèi)(n=6)及批間(3批)準(zhǔn)確度分別為91.46%、103.27%、94.48%和88.54%、105.48%、103.21%。乙酰紫堇靈在低、中、高3個(gè)濃度的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度分別為107.23%、96.53%、103.15%和108.57%、94.67%、103.28%。紫堇靈和乙酰紫堇靈的批內(nèi)精密度(RSD)分別為3.93%～11.59%之間和5.25%～13.48%之間。紫堇靈和乙酰紫堇靈的批間精密度(RSD)分別為2.14%～7.32%之間和3.92%～9.62%之間。

2.1.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性 按照血漿樣品處理項(xiàng)下方法處理低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品，計(jì)算其各自的峰面積，同時(shí)測定相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液中紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)的峰面積，進(jìn)而計(jì)算各自的提取回收率，結(jié)果表明紫堇靈、乙酰紫堇靈和內(nèi)標(biāo)在上述3個(gè)濃度的樣品中的提取回收率較為穩(wěn)定，其中紫堇靈的提取回收率在76.58%～81.51%之間，紫堇靈的提取回收率在71.28%～76.92%之間，內(nèi)標(biāo)的提取回收率為85.69%。

將50 μL的空白大鼠血漿按照上述方法處理，待揮干溶劑后，分別加入低、中、高3個(gè)濃度的對照品溶液及流動(dòng)相，配制成與質(zhì)控樣品濃度相對應(yīng)的樣品，進(jìn)樣分析后得相應(yīng)的峰面積A1。同時(shí)采用流動(dòng)相配制含相應(yīng)濃度的對照品溶液，進(jìn)樣分析得峰面積A2?；|(zhì)效應(yīng)通過公式A1/A2×100%進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明紫堇靈的基質(zhì)效應(yīng)在95.35%～107.53%之間，乙酰紫堇靈的基質(zhì)效應(yīng)在93.27%～105.45%之間，均符合要求。

對含低、中、高3個(gè)濃度的紫堇靈和乙酰紫堇靈血漿樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，如室溫放置8 h，反復(fù)凍融3次，-20 ℃下放置1個(gè)月，4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器保存1 d。結(jié)果表明各待測成分在各種條件下均能保持良好的穩(wěn)定性，具體如表2所示。

從上述方法學(xué)各項(xiàng)內(nèi)容的考察結(jié)果可知，我們所建立的LC-MS/MS分析方法具有特異、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，符合生物樣本測定的要求，該方法可用于后續(xù)藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

2.2 急性肺損傷模型確證

正常組和急性肺損傷大鼠肺組織的HE染色結(jié)果如圖2所示，從病理結(jié)果中可見，急性肺損傷大鼠的肺組織整體結(jié)果破壞較為嚴(yán)重，肺泡壁明顯增厚，水腫較為明顯，腔內(nèi)有較多滲出，同時(shí)伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)果表明急性肺損傷模型建立較為成功。

表2 紫堇靈和乙酰紫堇靈在大鼠血漿中的穩(wěn)定性考察

進(jìn)一步對肺組織的濕干質(zhì)量比進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)模型大鼠肺組織的濕干質(zhì)量比為4.14±0.32，而正常大鼠的肺組織濕干質(zhì)量比為3.41±0.27，兩者具有明顯差異(P<0.05)，上述結(jié)果表明模型制作成功。

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 藥-時(shí)曲線 正常大鼠與LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠灌胃給予苦地丁提取物428 mg/kg后，血漿中可以檢測到紫堇靈和乙酰紫堇靈，它們各自在正常大鼠和急性肺損傷大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線分別如圖3所示。

2.3.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 經(jīng)DAS3.2.6軟件計(jì)算，采用非房室模型對其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3所示，其中2組大鼠的紫堇靈和乙酰紫堇靈的達(dá)峰時(shí)間均為2 h，但紫堇靈在急性肺損傷模型大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度顯著大于正常組(P<0.05)，同時(shí)紫堇靈在模型大鼠中的半衰期亦顯著增加(P<0.05)，同時(shí)其清除率顯著減少(P<0.05)，最終表現(xiàn)為模型大鼠體內(nèi)紫堇靈的暴露水平顯著增加(AUC提高29.8%，且P<0.01)。但乙酰紫堇靈在在2組大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)未見明顯改變。提示急性肺損傷可能影響了紫堇靈在其體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為。

表3 紫堇靈和乙酰紫堇靈的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們建立一種同時(shí)測定大鼠血漿中紫堇靈和乙酰紫堇靈的LC-MS/MS分析方法，并將該方法應(yīng)用于急性肺損傷模型大鼠灌胃苦地丁提取物后的藥代動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果表明我們所建立的分析方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

在血漿樣品處理過程中，因?yàn)橐译娴某恋淼鞍仔Ч^好，我們采用乙腈作為沉淀試劑，同時(shí)其提取效率較為穩(wěn)定，而基質(zhì)效應(yīng)也較低。此外，采用蛋白沉淀的方法，樣品處理耗時(shí)更短，方法更為簡便。因此，我們在血漿樣品處理中，我們選擇了乙腈沉淀蛋白法。

一般而言，生物堿類物質(zhì)在正離子模式下具有較好的響應(yīng)，為了保證質(zhì)譜響應(yīng)的穩(wěn)定，需要在流動(dòng)相中加入一定量的甲酸，但甲酸加入后，會(huì)使生物堿產(chǎn)生拖尾，為了抑制生物堿在流動(dòng)相中的解離，我們在流動(dòng)相中加入了2 mmol/L的甲酸銨，同時(shí)采用梯度洗脫方式，可以改善其峰形。

由于苦地丁具有清熱解毒等多種功效，目前常用于肺部疾病的治療，如蒲地藍(lán)口服液中就含有苦地丁[2,5]。因此研究苦地丁中主要活性成分在疾病狀態(tài)下的藥代動(dòng)力學(xué)對于進(jìn)一步揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制具有重要意義[6]。有研究表明，紫堇靈可通過多種細(xì)胞色素P450酶代謝，主要的酶亞型包括CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9以及CYP2D6等[7-8]，有研究表明CYP3A4介導(dǎo)的紫堇靈代謝活化與其肝毒性有關(guān)[7,9]。而有關(guān)乙酰紫堇靈的吸收、分布、代謝和排泄的研究較少。而在多種炎癥狀態(tài)下，炎癥因子如IL-6、TNF-α可以顯著抑制多種細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)及活性，如CYP3A4、CYP1A2[10]，而有文獻(xiàn)報(bào)道，在急性肺損傷小鼠中，血漿中多種促炎性細(xì)胞因子顯著增加，而這些細(xì)胞因子可能對肝臟中的細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)和活性產(chǎn)生抑制作用[11]，在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)急性肺損傷大鼠體內(nèi)的紫堇靈暴露水平顯著增加，而且主要表現(xiàn)為紫堇靈的消除變慢，這可能與急性肺損傷大鼠肝臟組織中的細(xì)胞色素P450酶表達(dá)下降有關(guān)。而乙酰紫堇靈的體內(nèi)暴露水平未見明顯改變，可能與介導(dǎo)其代謝的酶在急性肺損傷狀態(tài)下未明顯改變有關(guān)，具體的機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

從上述結(jié)果可知，在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠體內(nèi)，灌胃給予苦地丁提取物后，紫堇靈的體內(nèi)暴露水平較正常大鼠顯著增加，這可能與急性肺損傷狀態(tài)下體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶活性改變有關(guān)，本研究結(jié)果對初步揭示苦地丁的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制均有一定的參考意義。