洪 鐵*，王丹妮，張 宸 ，高賢嫻，吳 巖

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長(zhǎng)春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春130012）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，以慢性關(guān)節(jié)軟骨降解及丟失為主，其病理改變常為關(guān)節(jié)邊緣及軟骨下骨骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)滑膜損傷及炎性細(xì)胞的大量聚集。臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹，嚴(yán)重時(shí)關(guān)節(jié)畸形可引起運(yùn)動(dòng)功能障礙。已有研究表明，膝骨關(guān)節(jié)炎是40歲以后最常見(jiàn)的慢性、進(jìn)展性、退行性骨關(guān)節(jié)炎[1]。然而目前，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)制定的骨關(guān)節(jié)炎診治指南可使用的藥物只有用于控制癥狀的非甾體抗炎藥及改善病情的雙醋瑞因、硫酸氨基葡萄糖、玻璃酸鈉等，這提示控制炎癥及改善關(guān)節(jié)軟骨病變是治療骨關(guān)節(jié)炎的首要目標(biāo)[2]。

組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院骨科專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，根據(jù)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。全方由補(bǔ)骨脂、熟地、牛膝、生姜、麻黃、肉桂、白芥子、延胡索等多味中藥組成，具有溫經(jīng)通絡(luò)、祛濕散寒、強(qiáng)筋健骨、去痹止痛的功效，是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院院內(nèi)制劑，已在老年原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[3～4]、腰椎間盤突出癥[5]等疾病治療中取得較好的療效。膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉是常用的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型，其可引起軟骨基質(zhì)的改變，使關(guān)節(jié)軟骨降解和丟失，類似于人骨關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程[6]。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型以研究組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的作用，并探討其調(diào)控炎癥因子表達(dá)的機(jī)制，為骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，50只，體質(zhì)量220～250 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，將動(dòng)物于動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度為20～24℃，濕度為40%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

碘乙酸鈉由上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)；雙醋瑞因膠囊由昆明積大制藥股份有限公司生產(chǎn)；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；大鼠前列腺素E2（PGE-2）ELISA試劑盒、大鼠總一氧化氮檢測(cè)試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）ELISA試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機(jī)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XPX-9052 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 分組給藥與動(dòng)物模型的建立

將50只Wistar雄性大鼠，按體重隨機(jī)分為6組，模型組10只，其余各組8只。分別為正常對(duì)照組，模型（4%碘乙酸鈉溶液）組，陽(yáng)性對(duì)照雙醋瑞因膠囊（8.0mg/kg）組，組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組。大鼠分籠飼養(yǎng)。

大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，雙膝關(guān)節(jié)備皮后75%乙醇常規(guī)消毒。除正常對(duì)照組外其余各組大鼠雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.1ml 4%碘乙酸鈉溶液誘導(dǎo)大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，1次/d，連續(xù)注入7d；正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。在末次膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%碘乙酸鈉溶液后，陽(yáng)性對(duì)照組及各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)濃度受試藥，模型組、正常對(duì)照組灌胃給予等體積0.5%CMC-Na溶液，每日1次，共計(jì)給藥4周。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)

2.2.1 大鼠膝關(guān)節(jié)寬度變化

測(cè)量造模前、給藥前，以及給藥第 1、2、3、4 周的大鼠膝關(guān)節(jié)寬度（mm），每只大鼠測(cè)量3次取平均值，按照以下公式計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度：

關(guān)節(jié)腫脹度(mm)=致炎后（給藥后）膝關(guān)節(jié)寬度(mm)-致炎前膝關(guān)節(jié)寬度(mm)

2.2.2 大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量測(cè)定

大鼠按體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，行腹主動(dòng)脈取血，血液靜置45min后在4℃，3500r/min條件下離心15min取上清，分離血清后進(jìn)行分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩２捎肊LISA試劑盒根據(jù)說(shuō)明書的指導(dǎo)測(cè)量血清中IL-1β、TNF-α的水平。

2.2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)腔灌洗液中NO、PGE-2的含量測(cè)定

取血后大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1ml生理鹽水進(jìn)行灌洗，將灌洗液在4℃條件下1500r/min離心15min，分離上清后進(jìn)行分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ∑渖锨逡喊凑誆LISA試劑盒說(shuō)明書的要求測(cè)定灌洗液中PGE-2的含量，根據(jù)說(shuō)明書的指導(dǎo)采用硝酸鹽還原酶法檢測(cè)灌洗液中總NO含量。

2.2.4 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中MMP-1、MMP-13的含量測(cè)定

取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃凍存?zhèn)溆?。取適量滑膜組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成2%滑膜組織勻漿，離心取上清液，離心條件4℃下，3500 r/min，10 min。取適量上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書的要求測(cè)定滑膜組織上清液中MMP-1、MMP-13含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，各組數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)比較差異的顯著性。P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠膝關(guān)節(jié)寬度變化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,正常對(duì)照組給生理鹽水前后膝關(guān)節(jié)直徑無(wú)變化（P＞0.05）。與正常對(duì)照組相比，各造模組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑顯著升高（P＜0.01），各造模組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照雙醋瑞因膠囊組、組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊高劑量組的大鼠膝關(guān)節(jié)直徑顯著降低（P＜0.01），組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊中、低劑量組的大鼠膝關(guān)節(jié)直徑明顯降低 （P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊高劑量組大鼠血清中的IL-1β、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.01），組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊中、低劑量組的IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 2。

3.3 大鼠膝關(guān)節(jié)灌洗液中NO、PGE-2含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)灌洗液中NO、PGE-2 含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊高劑量組關(guān)節(jié)灌洗液中 NO、PGE-2 含量顯著降低（P＜0.01），組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊中、低劑量組關(guān)節(jié)灌洗液中NO、PGE-2含量明顯降低（P＜0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 2。

3.4 大鼠滑膜組織中MMP-1、MMP-13含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠滑膜組織中MMP-1、MMP-13 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊高劑量組滑膜組織中MMP-1、MMP-13含量顯著降低 （P＜0.01），組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊中、低劑量組滑膜組織中MMP-1、MMP-13 含量明顯降低（P＜0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 3。

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨降解為主，伴有滑膜炎癥的關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬疼痛腫大、慢性滲出性滑膜炎及進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)受限。隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)老齡化以及肥胖、外傷等病因，罹患骨關(guān)節(jié)炎已為患者造成一定的經(jīng)濟(jì)壓力。目前臨床常用的非甾體類抗炎藥、雙醋瑞因及硫酸氨基葡萄糖等只能在短期內(nèi)緩解關(guān)節(jié)癥狀，研制一種標(biāo)本兼治的骨關(guān)節(jié)炎治療藥物已成為骨科醫(yī)學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)。

在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨MMPs的異常增高是導(dǎo)致關(guān)節(jié)ECM合成與降解失衡的主要原因，其可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原、蛋白多糖的過(guò)度降解，使軟骨破壞[7]。MMP-1研究較多，其表達(dá)量隨著軟骨退變程度加重而逐漸增高，目前已有學(xué)者將MMP-1作為一項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)去評(píng)價(jià)新型軟骨保護(hù)性藥物的性能；MMP-13可直接降解軟骨基質(zhì)中含量最多的Ⅱ型膠原，影響Ⅱ型膠原代謝，間接反映軟骨損傷程度。IL-1β是促炎始動(dòng)因子，一方面可與TNF-α協(xié)同促進(jìn)IL-6、PGE-2等其他炎性細(xì)胞因子釋放[2]，加劇軟骨分解代謝，還可激活iNOS，生成大量NO及ROS介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡；另一方面參與調(diào)控MMPs/TIMPs平衡，抑制蛋白聚糖合成，降解Ⅱ型膠原，促進(jìn)軟骨下骨囊變形，引起基質(zhì)鈣化，繼而上調(diào)MMP-1、MMP-13的表達(dá)?；ぶ懈吆康腘O會(huì)使血管擴(kuò)張、血管壁通透性增加形成關(guān)節(jié)積液，使關(guān)節(jié)腫脹疼痛。PGE-2是關(guān)節(jié)軟骨降解中最主要的分解代謝因子之一，具有致炎致痛作用[6]，可與IL-1相互作用增加對(duì)軟骨的分解，使滑膜細(xì)胞與浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞反應(yīng)性增強(qiáng)，加重滑膜炎癥。炎癥因子之間相互作用，共同促進(jìn)滑膜炎癥及炎性滲出引起的關(guān)節(jié)疼痛腫脹，因此控制炎癥、抑制炎癥因子的表達(dá)是治療骨關(guān)節(jié)炎的重要任務(wù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊可降低體液炎癥因子的含量，抑制骨關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶合成，起到抗炎止痛、減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療作用。

綜上所述，組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊在緩解碘乙酸鈉誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的同時(shí)，降低了膝關(guān)節(jié)腔灌洗液及血清中 IL-1β、TNF-α、NO、PGE-2 的表達(dá)， 降低了軟骨組織中MMP-1、MMP-13的含量。提示組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊治療碘乙酸鈉誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能是下調(diào)促炎因子的表達(dá)及降低軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的含量來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎。關(guān)于組方優(yōu)化的陽(yáng)和膠囊治療碘乙酸鈉誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。